Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de San Juan – Ingeniería Química

MICROBIOLOGÍA

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

MICROBIOLOGÍA

Practica de laboratorio Nº 1.A: MICROSCOPÍA

“Ampliar por Biología de los Microorganismos – Cap. 3 -Brock – 8° Ed.

El microscopio Compuesto, (figura 1) es una herramienta básica en microbiología, razón por la

cuál es muy importante conocer los principios básicos de la microscopia así como el empleo la
manipulación de este instrumento.

En microbiología se emplean con frecuencia los siguientes tipos de microscopio:

• Microscopio de campo claro
• Microscopio de contraste de fase
• Microscopio de campo oscuro
• Microscopio de fluorescencia

Todos se basan en los mismos principios y constan de un sistema óptico que produce el
aumento y un sistema de iluminación, que permite visualizar el objeto.
El microscopio compuesto tiene dos sistemas de lentes, uno situado cerca del objeto que se
observa, llamado objetivo y otro colocado cerca del ojo del observador, el ocular. El aumento
primario del objeto es producido por el objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se
realiza el aumento final. El aumento total de un microscopio es el producto del aumento de su
objetivo por el de su ocular. Los objetivos empleados en microbiología amplifican 10X (objetivo
seco de pocos aumentos), 40X (objetivo seco de muchos aumentos), 90X y 100X (objetivos de
inmersión) y oculares de 10X ó 15X.

El poder de resolución de una lente es la capacidad de mostrar, distintos y separados,

dos puntos muy cercanos.

El poder de resolución es función de la longitud de onda de la luz empleada y de una

propiedad óptica del objetivo denominada apertura numérica.

Entonces, a menores longitudes de onda, serán visibles estructuras más pequeñas pero en la
práctica la longitud de onda empleada es fija, por lo que el poder de resolución es función de
la apertura numérica del objetivo. A mayor apertura numérica el objeto resuelto será más
pequeño.
La apertura numérica depende del diámetro real del objetivo y del índice de refracción del
medio que hay entre la muestra y el objetivo. Si el medio es aire, la apertura numérica es ≤1.
Si se desea aumentar la apertura numérica se recurre a la inmersión de la lente objetivo
(colocando aceite de inmersión, de índice de refracción similar al del vidrio, entre la lente y el
portaobjeto), en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. La apertura numérica de
lentes de inmersión varía entre 1,2 y 1,4 y para un objetivo de 10X es de 0,25.
La resolución más alta posible para un microscopio compuesto, permitirá ver un objeto de
diámetro 0,0002 mm ó 0,2 µm (micrómetro), que ampliado 1000 veces (100X del objetivo y

Lic. Eduardo A. Suero

Ing. María José Herrera
 Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de San Juan – Ingeniería Química
MICROBIOLOGÍA

10X del ocular) aparecerá al ojo como un objeto de 0,2 mm de diámetro. Los objetivos 10X, en
promedio, tienen poder de resolución de 0,2 µm. Otros datos ópticos de los objetivos son:

Profundidad de campo: es el espesor de la muestra en foco en cualquier momento: 7 µm para

poder de resolución de 2 µm, 1,3 µm para poder 0,5 µm y 0,5 µm para poder 0,27 µm.

Área del campo: es el área de la muestra que está a la vista y se representa con el valor de su
diámetro. El área del campo es mayor para lentes con menor poder de resolución.

El sistema de iluminación es muy importante, sobre todo cuando se utilizan grandes

aumentos.
La fuente de iluminación generalmente empleada es una lámpara de tungsteno con control de
intensidad y tamaño del rayo de luz. La luz que entra al sistema debe enfocarse sobre la
preparación, empleándose para ello el condensador, lente que permite modificar el plano de
foco de la luz para encontrar una posición que origine un foco preciso. Por debajo del sistema
condensador se encuentra el diafragma iris, que controla el diámetro del cono de luz que pasa
por el sistema. A mayor amplificación, disminuye la distancia de trabajo y el tamaño del cono
luminoso debe ser mayor. El diafragma iris se coloca abierto cuando emplea objetivo de
inmersión y parcialmente abierto cuando se observa con objetivos secos de pocos y muchos
aumentos (figura 2).

Microscopio de campo claro: Es el microscopio óptico más común y es el que se usará en este
curso. Las propiedades ópticas (absorción y dispersión de la luz) diferentes entre los objetos y
el medio que los rodea, ocasionan diferencias de contraste que permiten visualizar los objetos
en cuestión. Con este microscopio es posible visualizar perfectamente células de mohos y
levaduras, pero es muy difícil ver con detalle células bacterianas debido a su falta de contraste
con el medio. Para aumentar dicho contraste, se tiñen las células, pero en algunos casos es

Lic. Eduardo A. Suero

Ing. María José Herrera
 Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de San Juan – Ingeniería Química
MICROBIOLOGÍA

imposible emplear este recurso porque los procesos de tinción modifican o destruyen las
células.

Microscopio de contraste de fase: Permite observar perfectamente células pequeñas sin

necesidad de teñirlas. El microscopio de contraste de fase crea una imagen de mayor contraste
que el microscopio de campo claro basándose en lo siguiente:
• El índice de refracción de las células es distinto al del medio que las rodea, por lo que las
ondas luminosas que atraviesan las células se retrasan y desvían (tienen fase distinta) respecto
a las que atraviesan el medio. Este microscopio amplifica esa diferencia de fases y las
convierte en diferencia de intensidad de luz, lo que significa mayor contraste entre las células
y el medio.
• El microscopio de contraste de fase posee, en lugar del diafragma iris del microscopio óptico
común, un diafragma anular que permite que llegue a la muestra sólo un anillo de luz, y
un anillo de fase o placa de difracción (detrás del plano de foco del sistema de lentes objetivo),
que interviene en la formación de la imagen.

Microscopio de campo oscuro: emplea un condensador especial que impide que los rayos
provenientes de la fuente luminosa incidan directamente en el objetivo. Los objetos se hacen
visibles porque dispersan la luz que llega a la muestra por los lados.
Con este microscopio se pueden detectar objetos de menor tamaño ya que el poder de
resolución es mayor que el del microscopio óptico común pero es difícil observar las
estructuras internas de las células que aparecen brillantes sobre fondo oscuro. Se emplea para
observar la motilidad de los microorganismos.

Microscopio de Fluorescencia: Se basa en la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir

luz de un color cuando incide sobre ella luz de un color diferente. Las muestras que se
observan, fluorescen, porque poseen sustancias fluorescentes naturales o porque fueron
teñidas con colorantes fluorescentes.

Lic. Eduardo A. Suero

Ing. María José Herrera
Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de San Juan – Ingeniería Química
MICROBIOLOGÍA

Lic. Eduardo A. Suero

Ing. María José Herrera