PRÁCTICA 6

MANTENIMIENTO DE LA ASEPSIA EN BIORREACTORES

INTRODUCCIÓN

Desde un punto de vista médico, la asepsia se define como el conjunto de métodos aplicados
para la conservación de la esterilidad. Para fines de esta práctica definiremos la asepsia como el
conjunto de procedimientos destinados a prevenir la infección o la contaminación microbiológica
de un medio de cultivo estéril o en el que se esté llevando a cabo una biorreacción. El propósito
de la asepsia en Biorreactores es evitar la infección o contaminación microbiológica de un medio
de cultivo estéril o en el que se esté efectuando una biorreacción. La asepsia, por tanto, asegura
que las materias primas sólo se biotransforman en el producto de interés con el microorganismo
de interés.

La contaminación microbiológica de un medio de cultivo en el que se esté llevando a cabo una

biorreacción es totalmente perjudicial tanto técnica como económicamente, ya que los
microrganismos contaminantes pueden ocasionar problemas severos, entre otros, los siguientes:

 Inactivar o degradar al biocatalizador (si este es una enzima), lo que ocasionaría que no
existiera más la biorreacción y por consiguiente una gran pérdida económica.
 Competir por el sustrato con el microorganismo responsable de efectuar la biorreacción,
disminuyendo así los rendimientos celulares y de producto con base en el sustrato.
 Desplazar al microorganismo responsable de efectuar la biorreacción si esta se lleva a
cabo en cultivo continuo.
 Producir subproductos ajenos al producto de interés (tóxicos o no) contaminándolo
químicamente. Para eliminar esta última se desecharía completamente el lote de
producción o se incrementarían los costos en el procedimiento de separación,
recuperación y purificación del producto de interés al agregarse más etapas extras de
purificación. Ambos casos representan una severa pérdida económica.

CONSIDERACIONES DE DISEÑO DE BIORREACTORES PARA TRABAJO ASÉPTICO.

Para el éxito en el trabajo aséptico del biorreactor y de las tuberías asociadas a él, se deben
proponer ciertos criterios desde la etapa de diseño del mismo denominados “Criterios Primarios
de Diseño” (CPD). Estos se reúnen y desarrollan al comienzo de todo proyecto y servirán como
un conjunto maestro de datos disponibles para su uso cuando sea necesario. Los CPD están en
parte relacionados con el proceso y en parte con la nueva planta.

Entre los relacionados al proceso se encuentran la cinética de la reacción, requerimientos de

asepsia, propiedades del biocatalizador y de las materias primas, etc., que representan el
“Know-how” del proceso. Mientras que entre los relacionados a la nueva planta están la
localización geográfica, la capacidad, conexión a una planta existente, utilidades, tratamiento de
efluentes, etc.

DISEÑO MECÁNICO DEL BIORREACTOR.

A partir de los CPD y durante el desarrollo del proyecto, se produce una cantidad abundante de
“datos” que se utilizan para la compra, adquisición y construcción de los equipos requeridos en
el proyecto.

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Para el diseño de un biorreactor clasificado como un recipiente a presión, se requiere una gran
cantidad de cálculos ingenieriles basados en las normas y estándares de construcción
internacionales. Entre las tareas más comunes están:
 Cálculos de las presiones y temperaturas a las que estará sujeto el biorreactor.
 Cálculos de velocidades de transferencia de masa, calor y momento (incluyendo el
sistema de agitación mecánica).
 Cálculos de construcción en acero inoxidable.
 Análisis de expansión térmica de tuberías y cuerpo principal del biorreactor.
 Acabados de superficies tanto de las tuberías como del cuerpo principal del biorreactor.
 Requerimientos de asepsia y hermeticidad.
 Sistema de aislamiento (térmico y/o acústico)

Para alcanzar los puntos “e” y “f”, en el diseño de un biorreactor se debe considerar una
geometría interna y arreglos de tuberías que eviten: 1) el paso de microorganismos del exterior
al interior del biorreactor (y viceversa); 2) la retención de líquidos con alto contenido de sólidos
(solubles o insolubles) que se depositan o adhieren en el interior del biorreactor al vaciar su
contenido.

Cuando se vacía un caldo de cultivo fermentado de un biorreactor, normalmente quedan

adheridas o depositadas en su interior remanentes líquidos del mismo que contienen sólidos
disueltos (sales minerales) y en suspensión (células microbianas o compuestos orgánicos poco
solubles o insolubles). Esta adherencia, depósito o permanencia de sustancias líquidas en el
interior de un biorreactor se favorece cuando el material de construcción del mismo presenta un
acabado no sanitario (rugoso) o cuando existen recovecos o “pozas” en su interior. En un
biorreactor existen puntos en los cuales se retienen o permanecen residuos del caldo agotado
cuando este se vacía, o llena el biorreactor estos puntos pueden ser el sistema de agitación
mecánica (flecha e impulsores), el sistema de aireación (tubería y difusor) y ciertas estructuras
internas existentes tales como bafles, mamparas, serpentines, etc.

Si inmediatamente después de vaciar el contenido no existe un buen lavado del interior del
biorreactor y los remanentes del caldo agotado llegaran a secarse y volverse sólidos, podrían
propiciar una esterilización inefectiva debido a que la penetración de calor en los sólidos es
mucho menor que en los líquidos, aumentando así la probabilidad de sobrevivencia de
microorganismos extraños contenidos en el centro de dichas partículas sólidas. De ahí la
importancia de que desde la etapa de diseño se especifique que los materiales de construcción
presenten un “acabado sanitario”, que evite la retención de líquidos y que facilite la limpieza del
biorreactor y de las tuberías, alcanzando una mayor efectividad del trabajo aséptico. No solo
especificar el acabado de los materiales si no también especificar las uniones de las tuberías
(brida, soldadura, rosca,etc) propicia una contaminación tanto entrada y salida al biorreactor.
Ojo, esto rotundamente involucra que el costo de construcción de un biorreactor sea mas
costoso debido a las especificaciones tan rigurosas en acabados e intalaciones de los diferentes
requerimientos que necesita un biorreactor para mantenerse aséptico.

Recién esterilizado el biorreactor, este debe operar asépticamente. De nada sirve gastar una
buena cantidad de energía para esterilizar un medio de cultivo contenido en un biorreactor si
este no garantiza que el medio se mantenga estéril después del proceso térmico. El diseño
mecánico de un biorreactor debe contemplar también otros aspectos que garanticen que su
contenido pueda permanecer “axénico” durante el desarrollo de la biorreacción (en todo el
tiempo que esta dure). Este es el objetivo de la asepsia: evitar la infección o contaminación
microbiológica de un medio de cultivo estéril o en el que se esté efectuando una biorreacción.

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A diferencia de los modelos que se presentan en el diseño de la esterilización de aire y medios
de cultivo, la asepsia no es fácil de modelar matemáticamente. La asepsia es más una serie de
normas de diseño por medio de las cuales se pueda excluir la intrusión de microorganismos
extraños a un sistema de biorreacción biológicamente definido. También debe considerarse
evitar la liberación al ambiente de los microorganismos de interés contenidos en el biorreactor,
sobre todo cuando se trabaja con organismos potencialmente patógenos. Por lo anterior, la
asepsia significa la seguridad tanto del proceso como del personal que labora en las plantas. En
consecuencia, la asepsia es un aspecto fundamental de todo bioproceso durante la operación del
biorreactor y de las tuberías asociadas a él.

FUENTES DE CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE UNA BIORREACCIÓN.

A través de un análisis detallado de los sistemas de biorreacción existentes, se puede demostrar

que las contaminaciones microbiológicas ocurren por una o varias de las razones que a
continuación se enumeran:
 Insuficiente esterilización de los materiales, medios de cultivo y de los gases que entran o
salen del biorreactor.
 Limpieza inadecuada del biorreactor previa a la esterilización.
 Por el uso de válvulas inadecuadas.
 Por sellos mecánicos ineficaces.
 Por inadecuados diseños y operatividad de las líneas de alimentación y de transferencias
de gases y o líquidos que conectan con el biorreactor.
 Por inadecuada atención de las capas límites formadas entre los ambientes aséptico y no
aséptico del biorreactor.
 Por una perturbación, paro involuntario o fallo en el funcionamiento del biorreactor.
 Errores de operación

Con cada uno de estos criterios de a septicidades bien aplicadas en los biorreactores se pueden
llegar a diseñar sistemas a prueba de contaminación microbiológica.

SELLOS HERMÉTICOS

En un recipiente a presión (como un biorreactor) la hermeticidad es fundamental para garantizar

un trabajo aséptico. En un biorreactor la hermeticidad puede comprobarse con 2 pruebas
distintas: hidráulica y neumática.

En el primer caso, se llena el biorreactor con agua y se cierran todas las válvulas de las líneas de
transmisión de líquidos y gases que conectan con el biorreactor y comprobar si no hay fugas de
agua.

En las pruebas neumáticas se presuriza el biorreactor (preferentemente vacío) hasta un

determinado valor de presión manométrica e igualmente se cierran todas las válvulas de las
líneas de transmisión de líquidos y gases que conectan con el biorreactor. El objetivo es observar
que durante un cierto tiempo (horas) la lectura de la presión del manómetro se mantenga en
dicho valor o dentro de los intervalos adecuados debido a las variaciones que pudieran ocurrir de
la temperatura. Pueden comprobarse las fugas en las conexiones de las líneas que conectan al
biorreactor aplicando una solución jabonosa a las mismas. Si se observan formación de burbujas
es que existe una fuga. De haber fugas, significa que no existe hermeticidad y que por tanto el
biorreactor podrá contaminarse.

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Con estas 2 pruebas puede comprobarse fácilmente la eficacia de la hermeticidad y de los sellos
mecánicos de los biorreactores de tipo tanque agitado.

CAPAS LÍMITE

Las capas límitesformadas entre los ambientes aséptico y no aséptico del biorreactor, muy a
menudo se han pasado por alto en la búsqueda de fuentes de contaminación.Un vistazo más a
fondo del comportamiento de un microorganismo sujeto a distintas condiciones en las capas
límite, ha permitido condensar el problema en 8 criterios de asepticidad que se muestran en la
figura 1.

Figura 1.- Criterios básico de aspeticidad en biorreactores.

LÍNEAS DE TRANSFERENCIA Y VÁVULAS

Las tuberías que conectan el exterior con el interior del biorreactor y por las que fluyen los
fluidos requeridos en la biorreacción, deben cumplir con ciertos requisitos, entre los que
sobresalen los siguientes:
 Inertes.
 De fácil limpieza.
 Que aseguren la hermeticidad.(considerando el tipo de unión)
 Esterilizables.
 A prueba de presión.

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En biorreactores de grandes volúmenes se usan comúnmente tuberías de acero inoxidable.
Previo al uso de dichas tuberías para transportar un fluido al interior del biorreactor o fuera de
él, es necesario la limpieza y pre esterilización de las mismas.

FILTRO DE AIRE

El aire que se introducirá al biorreactor deberá estar estéril. La forma más fácil y económica de
esterilizarlo es mediante la filtración del mismo con filtros absolutos que, a su vez, deben estar
previamente esterilizados. Se requiere el más alto aseguramiento posible de la integridad y
eficiencia de remoción de estos filtros para la esterilización del aire.

El aire es indispensable no sólo para proporcionar oxígeno a la biorreacción, sino también para
mantener una presión positiva que evite la entrada de microorganismos al biorreactor y cumplir
así con el tercer criterio básico de asepsia.

Existen diferentes métodos para probar la integridad de filtros. Uno de ellos es la prueba de la
intrusión del agua. Es una prueba práctica y validada, que se puede considerar para probar la
integridad in situ de los filtros hidrofóbicos para la esterilización del aire. Otra prueba es la de
mantenimiento de la presión.

OBJETIVO

El alumno conocerá y distinguirá las capas límites que se forman entre los ambientes aséptico y
no aséptico del biorreactor y discutirá, con base en los conocimientos adquiridos la efectividad
de la asepsia del biorreactor.

MATERIALES Y MÉTODOS

Biorreactor.
 Biorreactor tipo tanque agitado de 15 L esterilizable in situ.

Instrumentación.
Medidor de la velocidad de agitación de los impulsores.
Filtro de aire absoluto.
Rotámetro para medir el flujo de aire.
Manómetro.
Medidor controlador de la temperatura.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El alumno realizara la investigación previa de las siguientes definiciones:
 Asepsia.
 Axenia.
 Desinfección.
 Limpieza.
 Esterilización.
 Tipos de materiales y acabados utilizados en procesos biotecnológicos.
 Tipos de agua y soluciones que se utilizan para mantener aséptico un proceso.

Con ayuda del maestro y en presencia de biorreactores tipo tanque agitado y neumáticos, el
alumno identificará y observará las líneas que conectan el interior del biorreactor con el

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ambiente externo, comentando las características esenciales que deben observar dichas líneas
para garantizar un trabajo aséptico, así como la forma en la que se lavan y esterilizan las
mismas y el biorreactor.

 Observará los tipos de válvulas utilizadas y comentará respecto a si son adecuadas para
utilizarse en los biorreactores.

 Observará el sello mecánico, las portas de inoculación y de adición de líquidos, así como la
toma de muestra, con las que cuenta el biorreactor y comentará respecto a la adecuación
de las mismas para el trabajo aséptico en los biorreactores.

 Comentará respecto a la forma de realizar las pruebas hidráulicas y neumáticas para

checar la hermeticidad del biorreactor.

 Comentará respecto a los métodos para probar la integridad y eficiencia de remoción de

los filtros para la esterilización del aire.

FORMULACIÓN DE RESULTADOS

El alumno deberá presentar sus resultados realizando los siguientes puntos:

 La eficiencia de las líneas de transferencia de gases y líquidos del exterior al interior del
biorreactor para el trabajo aséptico.
 La eficiencia de las válvulas empleadas en las líneas de transferencia para el trabajo
aséptico.
 La eficiencia del sello mecánico del biorreactor para el trabajo aséptico.
 La eficiencia de la toma de muestra para el trabajo aséptico.
 Propuestade un esquema para el establecimiento de una prueba hidráulica para checar la
hermeticidad del biorreactor.
 Propuesta de un esquema para el establecimiento de una prueba hidráulica para checar la
hermeticidad del biorreactor.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La discusión versará sobre los puntos establecidos en la Formulación de Resultados.

BIBLIOGRAFÍA

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