Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Microorganismos celuloliticos
El pH optimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias abarca un amplio
rango, el cual incluye condiciones alcalinas y acidas. Por otro lado, las celulasasproducidas por
hongos requieren generalmente un pH acido.
Fundamento
La lignina conforma la pared celular de las plantas, es un polímero constituido por celulosa y
hemicelulosa (Ortiz, 2009). Los microorganismos lignolíticos catabolizan la celulosa y la
hemicelulosa. La mayoría de estos son hongos de la pudrición blanca y algunas bacterias
(Dávila & Vázquez-Duhalt, Enzimas lignocelulolíticas fúngicas para fines ambientales, 2006).
Las fibras de celulosa son degradadas esencialmente por dos tipos de sistemas enzimáticos
llamados agregativos y no agregativos, como se muestra en la siguiente figura:
Dentro del grupo de hongos aeróbicos, el hongo filamentoso Trichoderma reesei es uno de los
más estudiados y se caracteriza por su efectividad en la degradación de la celulosa nativa y
cristalina mediante su complejo celulolítico que presenta las tres actividades necesarias para la
hidrólisis de la celulosa (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa). Otra ventaja que
presenta el uso de este microorganismo, es su estabilidad en reactores agitados bajo
condiciones de pH ácido y a 50 ºC durante 48 hs.
Entre los microorganismos, los termófilos son de interés por su capacidad para producir
enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones
severas, incluso en niveles de pH altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta
90 °C.
Las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del género Bacillus presentan
básicamente actividad endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-1,4-glucanasa; pero tienen una
característica particular, en especial las enzimas de Bacillus subtillis y es la resistencia a ser
inhibida por la propia glucosa o celobiosa que producen.
Aislamiento
Se pesaran 10g de las muestras de residuos vegetales o de las muestreos de suelo tomados
para luego ser llevados a 90 ml de agua peptonada a 0.1% (p/v). Posteriormente se realizaran
diluciones seriadas a en agua peptonada a 0.1% (p/v) a partir de las diluciones
preparadas se realiza siembra en superficie en agar carboximetilcelulosa (cmc) al 1% (p/v).
Materiales y equipos
Espátula o cucharilla
Carboximetilcelulosa 10g
Extracto de levadura 2.5g
Peptona universal 2.5g
Sulfato de amonio 0.5g
Cloruro de calcio 0.5g
Fosfato monobásico de potasio 0.1 g
Fosfato dibasico de potasio 0.1 g
Agar – agar 15 g
Agua destilada 1000.0ml
Rojo congo al 1 % (p/v)
NaCI 0.1 M
Balanza analítica
Plancha de calentamiento y agitación
Cámara de flujo laminar
Autoclave
Potenciómetro
Agar CMC
Composición
Carboximetilcelulosa 10g
Agar – agar 15 g
Cálculos
Carboximetilcelulosa
10 g 1000ml
X= 2.4g de
X 240ml carboximetilcelulosa
X= 10 g x 240ml = 2.4 g
1000 ml
Extracto de levadura
2.5g 1000ml
X=0.6g de extracto de
X 240ml
levadura
X= 2.5 g x 240ml = 0.6g
1000 ml
Peptona universal
2.5 g 1000ml
1000 ml
Sulfato de amonio
0.5 g 1000ml
1000 ml
Cloruro de calcio
0.5 g 1000ml
X=0.2g de cloruro de
X 240ml calcio
X= 0.5 g x 240ml = 0.2 g
1000 ml
o.1g 1000ml
1000 ml
0.1 g 1000ml
X=0.024g de fosfato
X 240ml dibasico de potasio
X= 0.1 g x 240ml = 0.024g
1000 ml
Agar – agar
15g 1000ml
X= 15 g x ? = 2.88g
1000 ml
Rojo congo
1% p/v 1000ml
X= 1% p/v x 50 ml = 0.5 g
1000 ml
Utilizaremos un volumen de 30 ml
1L 1000ml
X 30 ML
1000 ml
Pm
N mol = 0,003
pm
W= 0,17 g
Procedimiento
Se disuelven cada componente en agua destilada, una vez disueltos todos los componentes se
ajusta el Ph ( 7.1 – 7.2 ), luego se somete a temperatura promedio al punto de ebullición, el
medio tomara un color cristalino esto nos indica que debemos retirar el medio de la plancha
de calentamiento, por siguiente se lleva al autoclave para su debida esterilización por
consiguiente estando el medio esterilizado se reparte en cajas Petri. Después de tener las
cajas cajas con el medio Se inocula en las placas mediante el método por estrías o
agotamiento, esto en condiciones asépticas.
Transcurrido el tiempo de incubación( 36ºc por 48 h ) se adiciona rojo congo al 1 % (p/v) como
revelador a las colonias presentes en los medios ( se le adiciona rojo congo por gotas a las
colonias), luego de 15 minutos de haber adicionado rojo congo como revelador se adiciona
NaCI 0.1 M, dejando reaccionar por 15 minutos mas , para luego hacer el recuento de las
colonias que presentaron halos de hidrolisis.
Bibliografía