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Nuno Taveira
Inês Bártolo
2014
Índice Geral
1.1. Introdução
Os laboratórios de microbiologia são ambientes de trabalho especiais em que as pessoas que neles
trabalham estão sujeitas a contrair doenças infecciosas que podem constituir risco de vida. São inúmeros
os trabalhos publicados desde o início do século descrevendo casos de doenças associadas ao trabalho
laboratorial, incluindo a febre tifoide (causada pela Salmonella typhi), cólera (causada pelo Vibrio
cholerae), brucelose (causada pela Brucella abortus), hepatite B, shigelose (causada por algumas
espécies de Shigella spp.), tuberculose (causada pelo Mycobacterium tuberculosis), arboviroses, tétano
(causada pelo Clostridium tetani) e SIDA (causada pelo HIV) (Tabela 1.1).
Tabela 1.1. Casos de SIDA ou infecções por HIV contraídas profissionalmente até Setembro de 1992
nos Estados Unidos1
Profissão No. de transmissões profissionais (%)
• Técnico de laboratório 25 (24.8)
• Enfermeiro 26 (25.7)
• Médico 13 (12.8)
• Técnico biomédico/paramédicos 7 (6.9)
• Dentista/técnico dentista 6 (5.9)
• Recepcionista/auxiliares 6 (5.9)
• Trabalhadores de limpeza/manutenção 6 (5.9)
• Técnico morgue 3 (3.0)
• Técnico/terapeuta 3 (3.0)
• Terapeuta respiratório 2 (2.0)
• Técnico cirúrgico 2 (2.0)
• Outros trabalhadores em saúde 2 (2.0)
Total 101
1
Adaptado de: Sewell, D.L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol.
Reviews 8: 389-405.
Nalguns casos as infecções terão sido associadas à simples manipulação de culturas microbianas ou
amostras clínicas, ou ainda inalação de pó ou aerossóis contendo microrganismos patogénicos. Noutros
casos, as infecções foram associadas à utilização de técnicas incorrectas e descuidadas de manuseamento
de materiais infecciosos (Tabela 1.2). Neste contexto são tristemente famosas as infecções mortais
adquiridas por iminentes cientistas como H.T. Ricketts, S.J.M. von Prowazek e E. Weil, durante os seus
estudos das doenças provocadas por Ricktesias spp.
Os três elementos que permitem definir o tipo de ‘contenção do risco biológico’ incluem, portanto, a
técnica e prática laboratorial, o equipamento de segurança, e o desenho de instalações. A análise de
risco do trabalho a efectuar com um agente específico determinará a apropriada combinação destes três
elementos.
Figura 1.1. Diagrama de uma câmara de segurança biológica de classe I. A) Abertura frontal; B)
Superfície de trabalho; C) Janela; D) Coluna de exaustão; E) Filtro HEPA.
Figura 1.3. Diagrama de uma câmara de segurança biológica de classe III. A) Mesa de apoio; B)
Compartimento das luvas; C) O-ring para ligação das luvas; D) Janela de vidro; E) Filtro HEPA de saída;
F) Filtro HEPA de exaustão (embora sejam necessários dois filtros HEPA consecutivos de exaustão o
segundo filtro não está representado na figura); G) Autoclave com duas saídas.
Outro exemplo de barreira primária é a tampa dos rotores de centrífuga que impedem a libertação de
aerossóis formados durante a centrifugação. Para minimizar este perigo potencial, sobretudo quando se
manuseiam agentes infecciosos que podem ser transmitidos por via respiratória após exposição a
aerossóis, deve também efectuar-se o trabalho laboratorial em câmaras de segurança biológica.
O equipamento de segurança pode também incluir itens para protecção pessoal tais como luvas, batas,
tocas, sapateiras, botas, respiradores, máscaras faciais, vidros protectores, ou óculos. O equipamento de
protecção pessoal é muitas vezes utilizado conjuntamente com câmaras de segurança biológica e outros
À medida que o risco de transmissão dos microrganismos por aerossóis aumenta, tornam-se necessários
níveis mais elevados de contenção primária e múltiplas barreiras secundárias para impedir a saída de
agentes infecciosos para o meio ambiente. As características do desenho das instalações podem então
incluir:
♦ sistemas de ventilação especializados que assegurem fluxo de ar direccionado,
♦ sistemas de tratamento do ar laboratorial para descontaminar ou remover agentes do ar contaminado
(ar expelido),
♦ zonas de acesso controlado,
♦ isolamento do laboratório em edifícios ou módulos separados
Os perigos primários para o pessoal que trabalha com estes agentes relacionam-se com exposições
percutâneas ou exposições acidentais das membranas mucosas, ou ainda com a ingestão de materiais
infecciosos. Deve ter-se precauções extremas com agulhas contaminadas ou instrumentos ponteagudos.
Embora os organismos manipulados em instalações de nível 2 de segurança biológica (NSB-2) não se
transmitam normalmente por via aerossol, todos os procedimentos que possam aumentar o risco de
exposição do pessoal a aerossóis devem ser efectuados em/com equipamento ou utensílios de contenção
primária como são as câmaras de segurança biológica e as tampas dos rotores de centrífugas. Outras
barreiras primárias podem ser utilizadas quando tal seja apropriado: escudos contra derrames e salpicos,
protecções faciais, luvas e toucas.
Para reduzir a potencial contaminação ambiental devem sempre existir e estar disponíveis e em
funcionamento, barreiras secundárias tais como lavatórios e instalações ou equipamento para
descontaminação dos resíduos infectados.
Os riscos primários para o pessoal que trabalhe neste nível de segurança são a exposição respiratória a
aerossóis infecciosos, exposição das membranas mucosas a gotículas infecciosas, e auto-inoculação.
Todas as manipulações de materiais de diagnóstico potencialmente infecciosos, microrganismos isolados,
e animais natural ou experimentalmente infectados constituem um risco de exposição e infecção para o
pessoal laboratorial, a comunidade, e o meio ambiente.
Tabela 1.6. Resumo dos níveis de segurança biológica recomendados para agentes infecciosos
Equipamento de Instalações
Nível de segurança
Agentes Práticas segurança (barreiras
biológica (NSB)
(barreiras primárias) secundárias)
Práticas
Não causam doença Obrigatória bancada
NSB-1 microbiológicas Não requerido
em adultos saudáveis aberta com lavatório
padronizadas
• Associados com Práticas de NSB-1 • Utilização de NSB-1 mais:
doenças mais: câmaras de
humanas. • Acesso segurança • Autoclave
limitado biológica de disponível
• Perigos • Sinais classe I ou II
primários: auto avisadores de para
inoculação, perigo manipulações
ingestão, • Precauções de agentes que
exposição das contra originem
membranas objectos salpicos e
NSB-2 mucosas pontiagudos formação de
• Manual de aerossóis de
segurança material
biológica infeccioso.
definindo • Batas,
métodos de • Luvas,
descontaminaç • Protecção
ão de resíduos facial quando
e políticas de necessária
vigilância
médica
• Agentes Práticas de NSB-2 • Utilização de NSB-2 mais:
indígenas ou mais: câmaras de • Separação
exógenos com • Acesso segurança física dos
potencial para controlado, biológica de corredores
transmissão por • Descontamina classe I ou II gerais de
NSB-3 aerossóis; ção de todos para a acesso
os resíduos manipulação de • Acesso com
• A doença • Descontamina todos os portas duplas e
provocada pelos ção das vestes agentes que se fechem
microrganismos laboratoriais • Bata, automaticament
pode ter antes de as • Luvas, e
2.1. Introdução
O exame microscópico é a primeira etapa do estudo e identificação de um microrganismo e permite
observar e analisar a forma, tamanho e organização/agrupamento dos microrganismos. Alguns destes
parâmetros são mais característicos e mais fáceis de observar quando os microrganismos estão no seu
habitat natural do que quando estão em cultura in vitro à longo tempo. Em materiais ou produtos que
contenham uma flora microbiana múltipla e complexa o exame microscópico directo pode permitir
determinar a proporção relativa das espécies microbianas presentes.
Exame a fresco
No exame a fresco, os microrganismos em suspensão em água, soro fisiológico, meio de cultura, produto
biológico, etc, são colocados entre lâmina e lamela e observados ao microscópio utilizando normalmente
a objectiva de 40X, o condensador em baixo e o diafragma ligeiramente fechado de modo a que não entre
demasiada luz. O exame a fresco permite uma primeira observação da morfologia e modo de
agrupamento dos microrganismos (Fig. 1.1). Uma vez que as células são observadas vivas, o exame a
fresco permite ainda o estudo da eventual mobilidade bacteriana.
• Mobilidade bacteriana
De um modo geral, a mobilidade das bactérias deve-se à existência de flagelos. Bactérias sem flagelos
são normalmente imóveis (ex. Klebsiella spp, Moraxella spp). A disposição dos flagelos é característica
das diferentes espécies bacterianas e determina o tipo de mobilidade. Uma bactéria monótrica possui um
único flagelo; se o flagelo está disposto num dos pólos da bactéria a flagelação é polar (ex. Pseudomonas
spp) (Fig. 1.2.a). Uma bactéria anfítrica possui um único flagelo em cada um dos pólos. As bactérias
lofótricas possuem um tufo de flagelos num dos pólos ou em ambos os pólos bacterianos (Fig. 1.2.b). As
bactérias perítricas possuem flagelos dispersos por toda a célula (ex. E. coli, Proteus spp., Salmonella
spp.) (Fig. 1.2.c).
Figura 1.2 – Localização dos flagelos. (a) flagelação polar; (b) flagelação lofótrica; (c) flagelação
perítrica.
A bactéria move-se quando o flagelo entra em rotação. A direcção da rotação flagelar determina a
natureza da movimentação bacteriana (Fig. 1.3). A movimentação para a frente das bactérias monótricas
ocorre quando o flagelo roda no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio; invertendo o sentido da
rotação flagelar a bactéria pára e roda sobre si própria. Um mecanismo semelhante determina a
mobilidade para a frente das bactérias perítricas.
Frente
(a)
Sobre si
própria
(b)
Frente
(c)
Sobre si
(d) própria
Figura 1.3 – Movimentação flagelar. Relação entre rotação flagelar e mobilidade bacteriana. (a) e (b)
ilustram a mobilidade de bactérias monótricas, polares. (c) e (d) ilustram a mobilidade de bactérias
perítricas.
Também se pode verificar se determinada bactéria é móvel ou imóvel por inoculação por picada central
de um meio de cultura semi-sólido em tubo, por exemplo o meio de manitol-mobilidade. A bactéria
móvel irá multiplicar-se em todo o meio turvando completamente o meio; o crescimento das bactérias
imóveis irá confinar-se ao local da inoculação.
a) Coloração simples - usa-se um só corante que confere a mesma cor a todos os microrganismos, é de
execução técnica simples e rápida e, como não danifica muito as células, é utilizada principalmente para
estudos morfológicos.
b) Coloração diferencial - como o nome indica permite diferenciar bactérias que não coram do mesmo
modo, sendo utilizado mais do que um corante e, necessariamente, uma solução de descoloração. A mais
comum é a coloração de Gram.
Coloração de Gram:
Foi descoberta pelo médico Dinamarquês Christian Gram em 18831 (Anexo 1) e baseia-se na diferença de
composição química e espessura das paredes bacterianas que condiciona a permeabilidade ao álcool e à
acetona e, em consequência, a dissolução mais ou menos rápida de complexos corados formados no
citoplasma.
Esta coloração permite dividir as bactérias em dois grandes grupos: as bactérias Gram (+) e as bactérias
Gram (-). As bactérias Gram (+), quando tratadas por um corante p-rosanilina trimetilmetano como o
violeta de metilo, o cristal violeta, ou o violeta de genciana (mistura dos dois primeiros) e seguidamente
por uma solução contendo iodo que genericamente se designa de mordente e que permite permite a
melhor penetração do corante (ex. lugol no caso da coloração de Gram), fixam o corante de tal modo que
este não é removido pela solução de descoloração, o álcool-acetona. Exemplos: Staphylococcus sp.,
Streptococcus sp., Bacillus sp..
As bactérias Gram (-), pelo contrário, são descoradas pela solução de álcool-acetona, porque o complexo
violeta/iodeto formado é dissolvido e extraído através de membrana externa. Para que depois se possam
observar melhor, são novamente coradas por um corante de contraste, geralmente vermelho-rosa (fucsina
diluída), que as distingue das bactérias Gram (+), corados de violeta. Exemplos: Famílias
Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae.
A coloração de Gram depende da idade da cultura bacteriana. Assim, a positividade ao Gram enfraquece
com o envelhecimento de forma que, por ex., uma cultura de bacilos Gram (+), apresenta sempre alguns
elementos Gram (-). Existem ainda bactérias Gram intermediárias que se descoram facilmente, e
bactérias Gram variáveis em que coexistem elementos bacterianos Gram (+) e elementos Gram (-).
c) Colorações especiais - a sua aplicação permite pôr em evidência detalhes da estrutura bacteriana
(flagelos, cápsulas, esporos núcleos ou inclusões citoplasmáticas), e ainda corar bactérias não coráveis ou
dificilmente coráveis pelas técnicas habituais. São geralmente mais complexas e morosas.
1
Gram, C. 1884. Ueber die isolirte Farbung der Schizomyceten in SchnittÄund Trockenpraparaten. Fortschritte der
Medicin, Vol. 2: 185-189.
Coloração da cápsula
Muitas bactérias segregam à sua superfície substâncias viscosas de composição variável, constituídas por
polissacáridos, glicoproteínas, poliálcoois e açúcares aminados que podem ser espessas ou finas, rígidas
ou flexíveis, dependendo da natureza química, e que têm funções de aderência a superfícies, protecção
bacteriana contra dessecação, contra as células do sistema imunológico, e contra outras agressões
exteriores.
A cápsula é uma secreção que adere à célula sob a forma de uma camada externa, disposta de modo
compacto em torno da superfície celular. É possível visualizar a cápsula, pela coloração negativa pela
tinta-da-china por via húmida, dado que a cápsula rejeita as partículas de tinta-da-china. As células
produtoras de cápsula vêem-se (com a objectiva de 40x), descoradas sobre fundo negro.
Pode ainda observar-se a cápsula utilizando uma variante da coloração anterior em que se aplica fucsina
diluída sobre um esfregaço seco das células, com tinta-da-china. As células produtoras de cápsula vêem-
se (com a objectiva de 100x), coradas de rosa, rodeadas por halos incolores, sobre fundo negro.
Coloração de endosporos
O endosporo bacteriano representa uma forma de resistência a condições ambientais desfavoráveis. Os
géneros Bacillus, Clostridium e Sporosarcina são caracteristicamente esporulados. No exame a fresco os
esporos são visíveis através da sua refringência e como são impermeáveis aos corantes habituais,
aparecem como zonas transparentes no interior da bactéria em preparações coradas.
É possível no entanto, corar endosporos, recorrendo à coloração de Möller, muito semelhante à
coloração de Ziehl-Neelsen, dado que também os endosporos são ácido resistentes. Após a coloração,
visualizam-se os esporos corados de vermelho e o protoplasma de azul.
Coloração de flagelos
Os flagelos bacterianos são orgãos de locomoção (Fig. 1.2). São muito finos (10 - 30 nm de diâmetro) e
só podem ser vistos directamente em microscopia electrónica. Para serem observados ao microscópio
óptico o diâmetro dos flagelos tem que ser aumentado. Para isso são revestidos com mordentes como, por
exemplo, o alúmen de potássio, e posteriormente corados com fucsina (método de Gray) ou nitrato de
prata (método de West). Estas colorações permitem observar a disposição flagelar o que é importante na
identificação de algumas espécies bacterianas.
1) Escolher um tubo com meio BHI previamente inoculado com uma das bactérias a estudar e que estará
supostamente, em fase exponencial de crescimento.
2) Em cada uma de três lâminas, e usando uma ansa, colocar 3 ou 4 gotas de cultura.
a) Consistência
Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para a multiplicação
de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Apresentam no entanto,
dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características
especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias; 2) é impossível a separação de
espécies bacterianas que se encontrem em misturas.
Ao contrário dos meios líquidos, os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante,
normalmente o agar. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e
tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal, incluindo ficar transparente no ponto
de ebulição da água, não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado
durante o crescimento microbiano.
Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em
estudos de fermentação, estudos de mobilidade bacteriana (ex.: meio manitol-mobilidade) e na promoção
do crescimento de bactérias anaeróbias.
Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias
das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram
muitas vezes aspecto e cor diferentes, auxiliando a sua posterior identificação. São praticamente
indispensáveis à obtenção de culturas puras. São ainda utilizados para a conservação de culturas, e
permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais).
b) Composição
Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os meios sintéticos,
ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em
água destilada em proporções determinadas, de modo a constituir uma solução de nutrientes devidamente
tamponada (ex. meio de citrato de Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de
substâncias nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como por exemplo,
extracto de carne, peptonas, e extracto de levedura, que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas.
Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey, Drigalsky ou Endo.
c) Tipo de utilização
Meios de isolamento
Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos:
Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um meio de cultura
universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose nutritiva).
Meios selectivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo
crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população plurimicrobiana, porque permite
favorecer a cultura preferencial de certas bactérias.
Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos
presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue, dado que algumas bactérias
produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não; dependendo
do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não
hemolíticas.
Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais.
São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública, como por exemplo na
determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. Temos como exemplos
deste tipo de meio:
a. gelose de McConkey - É um meio selectivo, uma vez que contém sais biliares e cristal violeta
que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento, apenas das bactérias
Gram negativas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as
bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As
bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio de
cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. As bactérias Gram negativas que não
fermentam a lactose, não acidificam o meio, e este permanece da cor original.
b. gelose de Drigalsky - É um meio muito semelhante ao anterior e contém, igualmente, lactose,
indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). Permite
distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac - (não fermentadoras de
lactose). As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de
produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo); as segundas originam colónias azuis (a cor
original do meio).
c. Meio de Chapman - É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração
de cloreto de sódio (7.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. Por conter manitol (um poliálcool
derivado de um açúcar - a manose) é também, diferencial (por ex.) para Staphylococcus aureus, uma vez
que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. A
acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio, e o indicador de pH (vermelho de fenol)
Meios enriquecidos - Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de
bactérias. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente, se encontra presente
num determinado produto mas em número muito baixo, é fundamental a utilização de um meio muito
rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. Estes meios enriquecidos
são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro, ovo ou sangue.
Exemplos: gelose sangue, gelose chocolate, “brain heart infusion” (BHI).
Gelose Chocolate - É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC
durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha,
responsável pelo nome atribuído. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular,
proteínas, cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. o
grupo heme é fundamental para o crescimento de Haemophilus influenzae, agente importante de
meningites bacterianas em crianças).
Meios de enriquecimento
São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade
relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. meio
de enriquecimento para organismos fotoautotróficos - meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo
de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de
intoxicações alimentares).
Meios de transporte
Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou
mais organismos. É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que
haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade
relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a
proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio de Stuart).
Meios de identificação
São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e, por
conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio Clark-Lubs - permite
distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a
fermentação ácida mista da glucose).
Meios de conservação
São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses, anos ou
décadas.
a) Pesagem do meio liofilizado ou, no caso dos meios sintéticos, dos vários compostos químicos.
b) Adição de água destilada.
c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.
d) Esterilização (geralmente em autoclave).
e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração, no caso dos meios sintéticos, uma vez que
soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque
caramelizam.
f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 - 45º C.
a) Inundação
É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições), com que se inunda a
superfície do meio sólido a usar. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a
superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica.
b) Espalhamento
É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à superfície de
meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente, ou
ainda por intermédio de uma zaragatoa.
c) Estrias
A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e realiza-se à superfície
de meio sólido, com uma ansa de Henle, a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3.1).
Figura 3. 1. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias.
d) Incorporação
A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio
sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio, enquanto quente (não mais do que
40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito.
e) Picada central
Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por
picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num meio gelosado em tubo.
a) Tamanho
• Colónias pequenas - diâmetro (d) < 1 mm
b) Forma geral
• Desenho dos contornos:
Bordos lisos regulares
Bordos irregulares
Bordos dentados
Bordos com prolongamento
• Forma de relevo:
Lisas
Convexas
semi-convexas
acuminadas
mamelonadas
umbilicadas
c) Transparência:
• Transparentes
• Translúcidas
• Opacas
• Lactescentes
d) Aspecto da superfície:
• Colónias lisas
Bordos regulares
Superfície lisa e brilhante por vezes
Consistência cremosa
Suspensão homogénea
Muitas vezes semi-convexas
• Colónias rugosas
Bordos muitas vezes dentados
Superfície rugosa, baça
Consistência pulvurulenta
Suspensão heterogénea
Sobretudo lisas
• Colónias mucosas
Bordos lisos e regulares
Convexas
Superfície lisa e brilhante
Suspensão heterogénea
e) Pigmentação:
A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.
Exemplos:
Serratia marcescens - colónias vermelhas
Pseudomonas aeruginosa - colónias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e piocianina)
Elevação
Elevação
Achatada
Achatada Elevada
Elevada Convexa
Convexa Pulverulenta
Pulverulenta Umbilical
Umbilical
Margem
Margem
Inteira
Inteira Ondulada
Ondulada Lobulada
Lobulada Erusionada
Erusionada Filamentosa
Filamentosa Encaracolada
Encaracolada
4) Na gelose chocolate, dividir a placa em três partes e inocular por estrias, utilizando uma zaragatoa as
seguintes bactérias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp.
5) Nos tubos de manitol-mobilidade, com a ansa de Henle, inocular Staphylococcus spp. e Proteus spp
por picada central.
2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas, fazer esfregaços, e realizar para
cada uma a coloração de Gram.
4.1 - Introdução
Definições
Genoma - Conjunto de genes
Genótipo - Conjunto de genes específicos de um organismo que determina um fenótipo (conjunto de
características físicas e biológicas observáveis).
Recombinação Genética - Processo pelo qual é formado um novo genoma recombinante que resulta da
combinação do material genético de dois organismos. Obtém-se um novo genótipo e, por vezes um novo,
um novo fenótipo.
A transferência de informação genética de uma célula dadora para uma célula receptora pode dar-se
segundo três processos:
Conjugação - Transferência de ADN entre bactérias em contacto físico através de um pili sexual.
Transdução - Transferência de ADN entre bactérias mediado por bacteriófagos.
Transformação - Transferência directa de um fragmento livre de ADN presente no meio ambiente. As
células receptoras têm obrigatoriamente que estar num estado de competência.
Estado de competência - Estado fisiológico em que são expressos receptores envolvidos na captação do
ADN e em que a célula bacteriana pode adquirir ADN exógeno e ser transformada. É um estado
complexo em que, por exemplo, é segregada uma proteína (factor de competência) que estimula a
produção de 8 a 10 novas proteínas necessárias à transformação. A frequência de transformação natural
pode ser muito aumentada tratando as células com cloreto de cálcio a frio.
O ADN transmitido por transformação pode ser de origem:
• Cromossomal - quando por exemplo células mortas sofrem lise nas proximidades de células
potencialmente receptoras.
• Plasmídico (Fig. 4.1)
Plasmídios bacterianos
São moléculas de ADN circular que podem existir nas bactérias ou fungos independentemente do ADN
cromossomal. Os plasmídios têm as suas próprias origens de replicação e portanto exibem replicação
autónoma. Têm geralmente poucos genes (< 30) e a informação que contêm não é, normalmente,
essencial à bactéria hospedeira. Pode existir um elevado número de cópias em cada célula bacteriana
(500 - 1000) ou apenas uma só cópia por célula. Os plasmídios podem ser eliminados por exposição a
agentes que inibem a sua replicação (radiações ultra violeta, radiações ionizantes _raios γ e X) ou por
crescimento a temperaturas acima da óptima. Este processo designa-se por cura plasmídica.
Os plasmídios podem ser de vários tipos:
• Factor F, factor de fertilidade ou plasmídio F - fundamental na conjugação bacteriana.
No laboratório, o ADN plasmídico pode ser introduzido em bactérias pelo processo artificial de
transformação, processo esse que é necessariamente iniciado pela extracção e purificação do ADN
plasmídico.
O plasmídio pGLO
O plasmídio pGLO tem 5,4 kpb, contém a origem de replicação ori, o gene GFP que codifica para a
green fluorescent protein, o gene bla que codifica para a β-lactamase e o gene araC que codifica para a
proteína araC (Fig. 4.3).
O sistema de regulação da expressão da GFP no pGLO é semelhante ao do operão arabinose uma vez que
está sob o controlo do promotor deste operão PBAD e da proteína araC. A expressão do gene GFP, e
consequente produção da proteína GFP, pode ser activada nas células transformadas pelo plasmídio
pGLO por adição da arabinose ao meio de cultura (Fig. 4.4). Na presença de arabinose, a proteína araC
vai recrutar a ARN polimerase para o promotor PBAD e a GFP é produzida. As células emitem tanto mais
fluorescência quanto mais GFP possuírem. Na ausência de arabinose, a araC não facilita a ligação da
ARN polimerase ao promotor e não há produção de GFP. As células não emitem fluorescência. Assim,
no meio de cultura sem arabinose as células transformadas aparecerão brancas (cor natural); no meio de
cultura com arabinose as células transformadas aparecerão verde fluorescente quando expostas aos raios
ultravioleta.
A transformação genética envolve a inserção de um novo ADN em células receptoras (ex. E. coli) onde o
será expresso fazendo com que as bactérias transformantes adquiram uma nova característica fenotípica.
O processo de transformação requer que as células estejam em estado de competência em que exprimem
na sua parede proteínas receptoras do ADN. O estado de competência pode ser natural ou induzido
dependendo das bactérias.
1) Marque um tubo eppendorf com +pGLO e outro com –pGLO e ponha os tubos fechados nos suportes
de espuma ou esferovite.
2) Abra os tubos e, com uma pipeta Pasteur estéril, transfira 250 µl de solução de transformação (CaCl2)
para dentro de cada tubo.
3) Coloque os tubos em gelo.
4) Com a ansa descartável estéril retire uma única colónia isolada do meio de cultura e coloque no fundo
do tubo marcado +pGLO, rodando a ansa entre os dedos até que toda a colónia esteja bem dispersa no
meio de transformação. Coloque de novo o tubo no gelo. Repita o procedimento com o tubo marcado –
pGLO utilizando uma nova ansa estéril.
5) Insira uma nova ansa estéril no tubo contendo solução stock de ADN plasmídico pGLO. Retire a ansa
cheia de solução plasmídica, insira-a no tubo eppendorf rotulado +pGLO e rode lentamente a ansa no
fundo do tubo de forma a misturar o plasmídio com as células.
6) Incube os tubos rotulados +pGLO e –pGLO no gelo durante 10 min.
Durante esta fase o ADN plasmídico vai ligar-se a proteínas de transformação presentes na superfície das
células competentes com ajuda do CaCl2 que vai atenuar a natural repulsão electrostática existente entre
o ADN e moléculas existentes na superfície celular contendo carga negativa (ex. LPS).
7) Marque as caixas de Petri contendo as diversas versões de meio de Luria sólido (ML). Para cada
experiência deverá marcar:
a) Uma caixa de ML com –pGLO
b) Uma caixa de ML com ampicilina com +pGLO e uma outra com –pGLO.
c) Uma caixa de ML com ampicilina e arabinose (ara) com +pGLO.
8) Transfira os suportes com os tubos do gelo para o banho de água a 42oC e incube durante exactamente
50 segundos. Imediatamente, transfira de novo os tubos para o gelo e incube durante mais 2 minutos.
Durante este período ocorre o choque térmico essencial para que a célula internalize o plasmídio.
9) Retire o suporte contendo os tubos do gelo e coloque-o na bancada. Adicione a cada tubo, com a ajuda
de uma nova pipeta Pasteur estéril, 250 µl de meio L líquido. Feche os tubos e incube os tubos durante 10
min. à temperatura ambiente.
10) Agite levemente os tubos com os seus dedos e, com uma nova pipeta Pasteur estéril, transfira 100 µl
das suspensões para cada uma das placas de Petri contendo os diferentes ML sólidos que previamente
rotulou. Deverá transferir 100 µl de suspensão de -pGLO para as duas placas rotuladas com –pGLO (ML
e ML com ampicilina) e 100 µl de suspensão de +pGLO para as duas placas rotuladas com +pGLO ((ML
com ampicilina e ML com ampicilina e arabinose).
11) Espalhe as suspensões bacterianas por toda a área do meio de cultura utilizando para o efeito uma
nova ansa estéril.
12) Incube as placas a 37oC até ao dia seguinte.
= 190 (colónias) x 5 (factor de diluição) x 1/0.3 (µg de ADN plasmídico) = 3166 ≈ 3,2 x 103
transformantes / µg de ADN plasmídico
5.1 - Introdução
Definições
Antisépticos – Substâncias químicas com propriedades antimicrobianas com mecanismos de acção
inespecíficos e que podem ser utilizadas sobre os tecidos vivos (pele e membranas mucosas).
Desinfectantes – Substâncias químicas com propriedades antimicrobianas utilizadas sobre materiais
inertes, normalmente tóxicas para a pele e membranas mucosas.
Compostos antimicrobianos – Substâncias de origem natural, sintética, ou semi-sintética, que destroem
ou inibem os microrganismos exercendo a sua acção a nível molecular, num processo metabólico ou
numa estrutura celular concreta dos microrganismos.
Durante muito tempo foram denominados antibióticos todos os compostos antimicrobianos produzidos
por microrganismos, fungos (Penicillium, Cephalospurium) ou bactérias (Bacillus ou Streptomyces), que
inibiam o crescimento ou destruiam outros microrganismos. Esta definição é hoje muito restritiva e deve
ser abandonada porque as moléculas obtidas por síntese, ou por modificação química de uma molécula
natural, podem originar as mesmas propriedades.
Um antibiótico é actualmente definido como uma substância de origem biológica ou sintética que actua
especificamente sobre uma etapa essencial do metabolismo das bactérias (agentes antibacterianos que
podem ser classificados de acordo com a sua estrutura química ou modo de acção sobre as bactérias) ou
dos fungos (agentes antifúngicos). Esta definição abrange todos os compostos antimicrobianos com
excepção dos anti-sépticos e desinfectantes, qualquer que seja a sua origem.
Os antibióticos são utilizados na terapêutica de numerosas doenças infecciosas, daí serem também
designados por agentes quimioterapêuticos antimicrobianos.
O espectro de acção antimicrobiano dos antibióticos é o seu grau de eficácia antimicrobiana. No caso de
antibióticos de largo espectro significa que são activos contra um grande número de bactérias Gram (+)
e Gram (-). Os de baixo espectro são activos unicamente contra certas bactérias Gram (+) ou Gram (-)
Exemplos:
- Penicilinas e cefalosporinas
- Aminoglicosidos (ex. gentamicina)
- Polimixinas
Por vezes a acção antimicrobiana é parcial e depois de uma diminuição precoce do número de bactérias
observa-se crescimento bacteriano. Este fenómeno pode ser devido a uma instabilidade do antibiótico in
vitro, a uma heterogeneidade da população bacteriana, que pode comportar um número de bactérias
genotipicamente mais resistentes que a maioria da população, ou ainda, devido a uma indução da
produção de enzimas que conferem resistência ao antibiótico.
A acção de um antimicrobiano sobre uma estirpe bacteriana pode ser caracterizada por dois parâmetros:
• CMI (Concentração Mínima Inibitória) – A mais baixa concentração de antibiótico que inibe a
multiplicação das bactérias (bacteriostase), em 18-24h. A CMI exprime-se em µg/ml.
O estudo do comportamento de uma bactéria face aos antibióticos, pelo crescimento de uma população
bacteriana em presença de gradientes de concentração de diferentes de antibióticos, permite determinar a
sua sensibilidade ou resistência a esses antibióticos. Este teste designa-se por antibiograma. Para
realizar um antibiograma podem usar-se os seguintes métodos:
1) Métodos de diluição (em meio de cultura líquido ou sólido) – São métodos quantitativos,
considerados de referência, para determinar a sensibilidade das bactérias aos antibióticos. Baseiam-se no
emprego de diluições progressivas do antimicrobiano, que é adicionado ao meio de cultura onde se irá
inocular a bactéria a estudar. Podem realizar-se em meio líquido ou sólido. Estes métodos permitem
determinar a CMI e a CMB.
2) Métodos de difusão (em meio sólido) - O método de difusão em agar é uma prova qualitativa
adequada para estudar a sensibilidade das bactérias de crescimento rápido. Não é adequada para as
bactérias de crescimento lento e baterias anaeróbias, nem para os antibióticos que difundem com
dificuldade. É uma técnica sensível e flexível no que diz respeito às substâncias que podem ser
estudadas. Permite classificar o microrganismo em sensível, intermédio ou resistente.
Este método tem a vantagem de possibilitar o estudo de um grande número de espécies bacterianas em
simultâneo.
Para cada antibiótico, mede-se o diâmetro de inibição do crescimento bacteriano e deduz-se o valor
(aproximado) da CMI do agente antimicrobiano em função da espécie estudada (Fig.5.3). Com efeito,
para um determinado antibiótico, existe uma relação entre o valor do diâmetro de inibição de crescimento
e o da CMI. Este é estabelecido por estudos comparativos previamente estabelecidos sobre um grande
número de espécies bacterianas.
Hoje em dia, o método dos discos é o mais utilizado e o mais rigoroso se forem respeitados três
parâmetros:
1) Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar deve ter de espessura 4 mm e de diâmetro 9 cm. O pH deve ser igual a 7.3.
Geralmente usa-se o meio de Mueller-Hinton que apresenta as seguintes vantagens:
2) Densidade do inóculo
O inoculo tem de ser estandardizado pois uma má estandardização deste leva a uma grande variabilidade
dos diâmetros das zonas de inibição. O inoculo é estandardizado com base na escala de McFarland:
A escala de McFarland (que está compreendida entre 0 e 5 unidades) é efectuada com cloreto de bário e
mede o grau de turvação da suspensão bacteriana.
Se a concentração do inóculo for elevada a sementeira é muito densa, não se destinguem as colónias - má
difusão do antibiótico.
Se a concentração do inóculo for baixa as colónias surgem muito dispersas - o antibiótico difunde-se
demasiadamente bem aparecendo uma zona de actuação muito grande que é falsa.
Se a concentração do inóculo for ideal todas as colónias são visíveis apesar de juntas - neste caso a
difusão é correcta e o disco fica envolvido por uma zona bem definida.
3) Concentração de antibiótico
A concentração de antibiótico deve ser sempre a mesma para que possam ser usadas as tabelas de
resultados. A conservação deve ser feita no frigorífico e o controlo de qualidade, realizado com estirpes
padrão E. coli, S. aureus e P. aeruginosa.
Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar é agar Mueller-Hinton. O pH do meio deve ser entre 7.2 e 7.4, verificado
sempre para cada lote do meio. Nas placas, o meio deve ter uma superfície plana e uma altura uniforme
de 4mm aproximadamente. As placas de meio devem ser conservadas no frigorífico. Quando vão ser
inoculadas as placas não devem apresentar gotas de água à superfície do meio nem na tampa, para o que
são postas a secar na estufa a 35 - 37ºC, geralmente 15 a 30 minutos.
Preparação do inóculo
A partir de uma cultura pura do microrganismo em estudo, em fase exponencial de crescimento,
escolhem-se 4 ou 5 colónias isoladas, morfologicamente semelhantes com que se prepara uma suspensão
em 5 ml de caldo nutritivo. Incubar 2 a 4h a 35 - 37º C até obter turvação compatível à unidade 0.5 da
escala de McFarland. Diluir em seguida com soro fisiológico do seguinte modo:
• Embeber uma zaragatoa na suspensão de bacteriana e inocular uma placa de meio de Mueller-Hinton
por estrias apertadas (em duas direcções, ou mais) por toda a superfície do meio.
• Deixar secar 2ou 3 minutos ao bico de Bunsen (5-10 min.)
• Colocar em cada placa um máximo de sete discos dos antibióticos com uma pinça ou um aplicador
mecânico. Deixar difundir 10-15 min.
• Incubar as placas a 37ºC durante 24 horas.
• Medir o diâmetro do halo de inibição de crescimento existente ao redor de cada antibiótico utilizando
uma régua.
Staphylococcus aureus:
P, KN, GM, E, NET, AMX, AMC, TRT, F, VN-
Pseudomonas aeruginosa:
TIC, PIP, IMI, CAZ, TBR, GM, NET, CL, CPX-
2) Estudo do efeito de uma solução de desinfectante para bancadas e do hipoclorito de sódio sobre
duas espécies bacterianas
• Colocar 5 ml de desinfectante em dois tubos estéreis
• Adicionar a um dos tubos 500 µl de suspensão de P. aeruginosa
5.3.1 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para Escherichia coli e o resultado final (Sensível
– S;Intermédio – I; Resistente – R)
AMC-
NET -
NA -
CXM -
AMX -
NOR -
SXT -
CPX-
GM-
F-
5.3.2 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para o Staphylococcus aureus
e o resultado final (Sensível – S;Intermédio – I; Resistente – R)
P -
KN-
GM -
E-
NET -
AMX -
AMC -
TRT-
F-
VN-
5.3.3 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para a Pseudomonas aeruginosa e o resultado
final (Sensível – S;Intermédio – I; Resistente – R)
TIC-
PIP-
IMI-
CAZ-
TBR-
GM-
NET-
CL-
CPX-
6.1 - Introdução
Generalidades
As infecções causadas pelos fungos são denominadas micoses. Apenas uma pequena minoria das cerca
de 100000 espécies de fungos existentes são patogénicas para os seres humanos. Apesar de não serem tão
predominantes como as infecções bacterianas ou virais, a incidência das micoses superficiais e sistémicas
tem crescido recentemente. Factores iatrogénicos, tais como tratamentos com fármacos imunosupressores
em transplantados e doentes com cancro, a nutrição parental, o aumento do número de indivíduos com
SIDA, e o uso indiscriminado de antibióticos, têm sido responsabilizados por este aumento do número de
casos.
Com poucas excepções, os fungos associados com doenças em seres humanos são membros saprofíticos
das comunidades microbianas encontradas nos solos. Outras espécies são comensais na pele humana,
intestino e mucosas que em determinadas condições (ex. imunodeficiências) assumem o carácter
patogénico.
A célula fúngica
Um fungo é um eucariota definido pela ausência de organização tecidular e de clorofila. A célula fungica
é frequentemente limitada por uma parede rígida de natureza celulósica ou quitinosa.
A maior parte dos fungos de importância médica apresenta um de dois tipos de morfologia celular. As
formas celulares esferoidais ou ovais são típicas de leveduras (fungos leveduriformes) e possuem o
diâmetro de 5 a 25 µm. As células tubulares ou filamentosas são características das hifas, que constituem
os fungos filamentosos (ou bolores). Uma única célula pode possuir o comprimento de 5 a 50 µm por 2 a
5 µm de diâmetro.
As leveduras aparecem isoladas ou em grupos de duas a três células, com uma delas distintamente maior
do que as outras.
As células das hifas podem ou não ser compartimentadas por meio de estruturas semelhantes a paredes
cruzadas denominadas septos. Um conjunto de hifas forma um micélio.
Alguns fungos são dimórficos, ou seja, podem proliferar como leveduras ou como bolores. Todos os
fungos dimórficos são patogénicos para o homem, apresentando a forma de levedura no interior do nosso
organismo e a forma filamentosa no exterior (no meio ambiente).
Reprodução assexuada:
• Por divisão binária (por fissão)
• Por divisão binária (por gemulação)
• Por produção de esporos assexuados.
Reprodução sexuada:
Leveduras
As leveduras são fungos unicelulares, redondos ou ovais, de parede fina ou espessa. São normalmente 5 a
10 vezes maiores do que as bactérias. Multiplicam-se normalmente por fissão binária (reprodução
assexuada); quando as leveduras se multiplicam sexuadamente produzem vários tipos de esporos que
podem ser úteis na sua identificação. As suas actividades metabólicas também são utilizadas para
classificação da espécie e do género.
O isolamento de leveduras é feito em meio de Sabouraud com ou sem adição de antibióticos
antibacterianos (ex. cloranfenicol). A adição de antibióticos antibacterianos pode ser fundamental para o
isolamento de espécies de crescimento lento. O meio de Sabouraud é um meio selectivo que contém 4%
de glucose (os fungos toleram pressões osmóticas elevadas), e um valor de pH baixo (5.2), o que vai
inibir o crescimento de outros microrganismos (bactérias). As colónias de leveduras são semelhantes às
colónias bacterianas. Têm uma consistência cremosa e crescimento rápido, em 2 a 4 dias.
• Candida albicans
• Candida glabrata (torulopsis glabrata)
• Candida tropicalis
• Candida guilhermondii
• cândida parapsilosis
1) Prova da blastése
Só a Candida albicans é capaz de produzir tubos germinativos no soro humano fresco num período de
três horas. Os tubos germinativos são o início de hifas verdadeiras e aparecem como filamentos que não
estão constritos ao ponto de origem da célula mãe.
Técnica:
a) Execução de uma suspensão em tubo contendo soro humano com 3 ou 4 colónias.
b) Incubação 3 horas/37ºC.
c) Leitura por observação microscópica dos tubos germinativos (Fig. 6.2).
São testes de identificação bioquímica de leveduras que se baseiam na sua capacidade de utilização por
via aeróbia ou fermentativa de açúcares.
Hoje em dia a maior parte dos laboratórios usam sistemas automatizados, vendidos comercialmente, para
executar os testes de assimilação dos açúcares e outros testes de identificação bioquímica de leveduras.
Os mais correntemente usados são: API 20C (bioMérieux) e Minitek (BBL).
• Aspergillus flavus
• Aspergillus niger
• Aspergillus fumigatus
• Aspergillus versicolor
• Aspergillus candidum
b) Taxa de crescimento: crescimento geralmente rápido (3 dias), no entanto algumas espécies são mais
lentas (semanas).
• Penicillium notatum
Candida albicans
Candida tropicalis
Geotrichum sp.
2) Incubar 24 - 48 h/37ºC.
Prova da blastése
1) Executar a prova da blastése, com colónias de Candida albicans e de Candida tropicalis:
2) Executar a coloração de Gram, a partir do meio de Sabouraud de Candida spp. e Geotrichum sp.
• Candida tropicalis
• Geotrichum sp.
a) Observação macroscópica:
b) Observação microscópica:
(obj.40x) (obj.100x)
c) Prova da blastése:
• Positiva -
• Negativa -
(Obj.40x)
a) Observação macroscópica:
• Odor_________· • odor______________
• Extensão do crescimento_________ • extensão do crescimento_______
• Pigmentação do verso__________ • pigmentação do verso_________
• Pigmentação do reverso__________ • pigmentação do reverso_______
• Presença de hifas aéreas_________ • presença de hifas aéreas_______
b) Observação microscópica:
(Obj.40x)
(Obj.40x)
7.1 - Introdução
Generalidades
Os cocos Gram positivos são espécies bacterianas constituídas por células de forma arredondada (cocos)
e imóveis.
A família Micrococcaceae é constituída por vários géneros, sendo o género Staphylococcus o mais
importante em termos clínicos. Dele fazem parte 41 espécies e 24 subespécies. O S. aureus pode ser
isolado das narinas e do períneo é a espécie mais importante em termos médicos porque causa
frequentemente infecções (pneumonia, intoxicação alimentar, sindroma do choque tóxico, endocardite e
abcessos). S. epidermidis faz parte da flora normal da pele,narinas e axilas podendo ser patogénico em
situações de compromisso imunológico do hospedeiro. S. saprophyticus, normalmente é comensal,
podendo no entanto ser responsável por infecções do tracto urinário em mulheres jovens.
Família Micrococcaceae
Género Staphylococcus
Características gerais:
• São cocos Gram positivos, imóveis, anaeróbios facultativos.
• Microscopicamente, aparecem agrupados caracteristicamente em “cacho de uva”.
(grego staphylé - cacho de uvas)
• Algumas estirpes podem apresentar cápsula.
• Os membros deste género bacteriano fermentam a glucose e produzem catalase.
• As colónias em meio sólido aparecem bem definidas, redondas, convexas.
Família Streptococaceae
• Streptococcus pyogenes
• Streptococcus pneumoniae
• Enterococcus faecalis
Classificação:
• São classificados em 21 grupos (Grupos de Lancefield: A-U), distinguidos serologicamente por
pequenas diferenças específicas dos carbohidratos da parede celular.
• Também podem ser classificados de acordo com o tipo de lise enzimática dos glóbulos vermelhos
(hemólise), produzida em placas de gelose sangue:
Alfa (αα) hemolíticos - caracterizam-se por uma hemólise incompleta com difusão de pigmento verde à
volta da colónia.
Beta (ββ ) hemolíticos - caracterizam-se por hemólise completa, com libertação da hemoglobina e uma
zona clara à volta da colónia.
Gama (γγ) hemolíticos - caracterizam-se pela ausência de hemólise.
O TASO é um teste utilizado em rotina, quando se pretende diagnosticar uma infecção recente por
estreptococos e evitar a possibilidade de complicações pós-infecção estreptocócica, como a febre
reumática ou glomerulonefrite. Após uma infecção devida a estreptococos do grupo A, os anticorpos
anti-estreptolisina O começam a aumentar ao fim de 2-3 semanas surgindo a máxima quantidade ao fim
de 5-6 semanas. O título de anticorpos anti-estreptolisina O é medido em unidades Todd. Um título
superior a 200 unidades Todd sugere uma infecção recente por estreptococos do grupo A.
Tabela 1- Algumas características fenotípicas que permitem distinguir S. aureus dos Streptococcus spp.
Característica S. aureus Streptococcus spp.
Meio de manitol Cresce e fermenta Não cresce e não fermenta (em geral)
Catalase Produz Não produz
Tipo de hemólise β α, β, ausência
Glucose Fermenta fermenta
Pesquisa de catalase:
• Fundamento
Em aerobiose, as bactérias utilizam normalmente o oxigénio como aceitador terminal de electrões pela
via oxidativa directa (fosforilação oxidativa).
superóxido dismutase
2 O2- + 2H+ → O2 + H2O2
catalase ou peroxidase
2 H2O2 → 2 H2O + O2
As bactérias aerotolerantes têm a superóxido dismutase mas não têm catalase, enquanto as bactérias
facultativas têm ambas.
• Técnica
b) Com uma pipeta Pasteur fechada retirar uma colónia de uma caixa de Petri e tocar na água
oxigenada.
• Leitura
• Interpretação
Os estafilococos são catalase positivos enquanto que os estreptococos são catalase negativos.
Estudo microbiológico do género Staphylococcus
Composição:
Peptona (1%)
Extracto de carne (0.1%)
NaCl (7.5%)
Manitol (1%)
Agar (1.5%)
Vermelho de fenol (0.0025%)
O meio de Chapman tem um elevado conteúdo em NaCl, e contém ainda manitol e vermelho de fenol.
Este meio permite o isolamento selectivo de estafilococos com base na sua tolerância a um elevado teor
em NaCl e na diferenciação da espécie de S. aureus, pela fermentação do manitol e consequente viragem
do indicador de pH.
Outras espécies como o Streptococcus do grupo D e Bacillus sp. podem desenvolver-se neste meio. No
entanto o aspecto das colónias permite distingui-las facilmente.
• Técnica:
Sementeira - por estrias
Incubação - 24h/37ºC
• Leitura e interpretação:
- Os estafilococos potencialmente patogénicos fermentam o manitol e acidificam o meio cuja cor vira
para amarelo;
- Os estafilococos não patogénicos não modificam a cor do meio que permanece vermelha ou seja,
não fermentam o manitol.
Pesquisa de estafilocoagulase
• Fundamento
A coagulase é um produto extracelular que tem a característica única de coagular vários plasmas de
mamíferos. A coagulase reage com um factor plasmático, formando a estafilotrombina que converte o
fibrinogénio em fibrina (que é insolúvel) e que cobre a célula, defendendo-a das defesas do hospedeiro.
A determinação da actividade da coagulase é utilizada para distinguir entre espécies patogénicas e não
patogénicas embora ainda não esteja provado que haja correlação entre a coagulase e o poder patogénico.
• Técnica:
a) Num tubo de hemólise colocar cerca de 500 µl de plasma de coelho (ou humano) diluído a 1/5.
b) Adicionar 500µl de uma cultura de 24h.
c) Incubar os tubos 37ºC/24h.
+1 +2 +3 +4
a) Os estafilococos patogénicos originam a coagulação do plasma num tempo que vai dos 30 minutos
às 24 horas.
b) As leituras devem ser efectuadas de hora a hora durante as primeiras 5 horas.
• Fundamento
Certas bactérias são capazes de hidrolisar o ácido desoxirribonucleico, graças a uma enzima por elas
produzida, a DNase. Após cultura sobre gelose nutritiva contendo ácido desoxiribonucleico, pesquisa-se
a presença de ADN graças a um reagente revelador, o HCl ou azul de toluidina.
• Meio de cultura
Composição:
ADN (0.2%)
Peptona (0.5%)
Triptona (1.5%)
Cloreto de sódio (0.5%)
Agar (1.5%)
• Técnica:
a) Semear cada estirpe por estria espessa em caixas de meio sólido contendo ADN (normalmente de
esperma de salmão).
b) Incubar 24h/37ºC.
c) No dia seguinte revelar, inundando a superfície do meio com uma solução 1 N de HCl ou com uma
solução a 0.1% de azul de toluidina.
d) Esperar 5 a 10 minutos.
Pesquisa de hemolisinas
• Fundamento
As hemolisinas são exotoxinas que provocam a destruição dos glóbulos vermelhos. Pode classificar-se o
tipo de hemólise consoante o tipo de ataque que a bactéria faz aos glóbulos vermelhos.
• Técnica:
a) Inocular por estrias as estirpes a estudar em meio gelosado contendo 5% de sangue de carneiro.
b) Incubar 24h/37ºC.
• Leitura e interpretação
Para os estafilococos patogénicos, observa-se hemólise β ou seja, hemólise completa em que se forma
uma zona mais clara à volta da colónia. Este fenómeno deve-se a uma toxina (hemolisina) libertada pelas
espécies patogénicas de origem humana.
Isolamento:
• Meios de cultura:
Composição:
Triptona (0.3%)
Peptona (1%)
Cloreto de sódio (0.5%)
Sangue de carneiro (5%)
Extracto de carne (1%)
Amido (1%)
Cloreto de sódio (5%)
Agar (1.3%)
• Técnica:
Sementeira - por estrias
Incubação - 24h/37ºC
• Leitura:
Só os enterococos se multiplicam neste meio, com o aparecimento de colónias pequenas, translúcidas,
com um halo negro.
Pesquisa de hemolisinas:
• Fundamento
As hemolisinas são exotoxinas que provocam a destruição dos glóbulos vermelhos do sangue, podendo
classificar-se o tipo de hemólise consoante o tipo de ataque que a bactéria faz aos glóbulos vermelhos.
• Técnica:
a) Inocular as estirpes a estudar em gelose de sangue, pelo método de estrias.
b) Incubar 24h/37ºC.
• Leitura:
- Hemólise β (hemólise total): halo claro e transparente à volta da colónia.
- Hemólise α (hemólise parcial): zona verde acastanhada à volta da colónia.
- Hemólise γ (ausência de hemólise).
• Técnica:
a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos.
b) Colocar um disco impregnado com bacitracina no centro.
c) Incubar 24h/37ºC.
• Leitura:
O aparecimento de uma zona de inibição à volta do disco de bacitracina, quer dizer que a bactéria lhe
é sensível, permitindo desta forma identificar os estreptococos do grupo A. Todos os outros
estreptococos são resistentes à bacitracina (Tabela 2).
• Técnica:
a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos.
b) Colocar um disco impregnado com SXT no centro.
c) Incubar 24h/37ºC.
• Leitura:
Só se verifica o aparecimento de uma zona de inibição à volta do disco quando se trata de
estreptococos do grupo C ou estreptococos viridans (Tabela 2).
1) Dividir ao meio uma placa de meio de Chapman e inocular pelo método de estrias as seguintes
bactérias:
• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
2) Dividir ao meio uma placa de TSA e inocular pelo método de estrias com as seguintes bactérias:
• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
3) Dividir em quatro uma placa de gelose de sangue e inocular pelo método de estrias as seguintes
bactérias:
• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
• Streptococcus pyogenes
• Enterococcus faecalis
4) Dividir ao meio uma placa meio de D-Coccosel, e inocular pelo método de estrias as seguintes
bactérias:
• Enterococcus faecalis
• Streptococcus pyogenes
5) Proceder à colheita por intermédio de zaragatoa (previamente embebida em soro fisiológico estéril) da
pele do antebraço e inocular uma placa de gelose de sangue ou manitol.
6) Incubar todos os meios de cultura a 24h a 37oC.
3) Executar uma suspensão em água destilada estéril com colónias de S. aureus e a partir dela realizar o
teste da coagulase:
• num tubo de hemólise colocar cerca de 500 µl de plasma de coelho (ou humano) diluído a 1/5.
• adicionar 500µl da suspensão
• incubar os tubos 37ºC/24h
7) Executar duas suspensões em água destilada estéril, uma com colónias de S. pyogenes e outra com
colónias de E. faecalis.
8) A partir das suspensões anteriores realizar os testes de sensibilidade aos antibióticos (B e SXT):
• Dividir uma placa de gelose sangue ao meio e inocular cada metade, por estrias apertadas, com as
suspensões anteriormente preparadas
• Colocar um disco impregnado com bacitracina e também um disco impregnado com SXT sobre
cada metade
• Incubar 24h/37ºC
10) De acordo com as técnicas adquiridas, identifique a espécie de estafilococos isolado a partir da pele
do antebraço (obviamente se tiver obtido crescimento).
S. aureus S. epidermidis
S. pyogenes E. faecalis
8.1 - Introdução
Gelose de Drigalsky
a) Composição
peptona 1.5%
extracto de carne 0.3%
extracto de levedura 0.3%
desoxicolato de sódio 0.1%
tiossulfato de sódio 0.1%
lactose 1.5%
cristal violeta 0.0005%
azul de bromotimol 0.008%
agar 1.1%
Gelose de McConkey
a) Composição:
peptona 2 %
lactose 1 %
mistura de sais biliares 0.15 %
cloreto de sódio 0.5 %
vermelho neutro 0.003 %
cristal violeta 0.0001 %
agar 1.3 %
Fermentação de lactose
Este teste é realizado pela observação directa da alteração da cor dos meios selectivos que contêm lactose
e um indicador de pH. Pretende verificar-se se as bactérias metabolizam a lactose por via fermentativa.
Técnica:
• inoculação, por ex., de uma placa de gelose de Drigalsky, por estrias
• incubação a 37ºC/24h
Leitura:
lactose (+) - colónias amarelas
lactose (-) - colónias incolores
Pesquisa de β -galactosidase
Para que a degradação da lactose por uma bactéria seja possível é necessário, em primeiro lugar, que
aquele dissacárido penetre na célula por acção de uma permease e que no seu interior exista outra
enzima, a β -galactosidase, que catalize a hidrólise da lactose em dois açúcares simples, a glucose e a
galactose. A bactéria catabolizará depois ambos os monossacáridos pelas vias metabólicas apropriadas,
com produção de energia. Tanto a β-galactosidase como a permease são enzimas produzidas pelo operão
lactose. Todas as bactérias capazes de metabolizar a lactose terão o operão lactose funcional.
Para espécies bacterianas classificadas como lactose negativas (ou seja, que aparentemente não
fermentam a lactose) deve fazer-se a pesquisa directa da β -galactosidase, uma vez que essas espécies
bacterianas podem ser lactose tardias, ou seja, ter dificuldade em metabolizar a lactose, não devido à
ausência do operão lactose, mas devido à baixa produção da enzima permease. Neste teste, as bactérias
previamente induzidas pela lactose (presente no meio selectivo) são lisadas com clorofórmio ou tolueno e
os lisados (contendo ou não a β-galactosidase) são colocados na presença de orto-nitrofenil-β β -D-
galactopiranósido (ONPG), um composto que tem uma estrutura análoga à lactose e que é hidrolizado
pela β-galactosidase em orto-nitrofenol e galactose. O orto-nitrofenol apresenta cor amarela que é
facilmente visualizada a olho nú.
Técnica:
• a partir de colónias multiplicadas em meio selectivo (contendo lactose) fazer uma suspensão
bacteriana em soro fisiológico estéril num tubo de hemólise
• adicionar uma gota de tolueno ou clorofórmio
• agitar (para auxiliar a lise das bactérias)
• colocar um disco de ONPG
• incubar a 37º/24h
Leitura:
ONPG (+) - coloração amarela
ONPG (-) - incolor
Técnica:
• inocular o meio Clark e Lubs
• incubar a 37ºC/24h
• revelar com solução alcoólica de vermelho de metilo
Leitura:
VM (+) - meio vermelho
VM (-) - meio da cor original (amarelo muito claro)
glucose + ½ O2
↓
2 piruvato
↓
α-acetolactato + CO2
↓
acetil-metil-carbinol (acetoína) + CO2
↓
2,3-butanodiol
É possível verificar se ocorre fermentação butanodiólica pelo teste de VP em que a acetoína é feita reagir
com o α-naftol em meio alcalino formando-se a creatina que tem uma cor rosa/vermelho:
KOH 40%
acetoína + α-naftol → diacetil + creatina (coloração rosa/vermelho)
etanol
Técnica:
• inocular o meio Clark e Lubs
• incubar a 37ºC/24h
• revelar com as soluções VP1 (KOH a 40%) e VP2 (α-naftol a 6%)
Leitura:
VP (+) - meio rosa/vermelho
VP (-) - meio da cor original (amarelo muito claro)
Composição:
extracto de carne 0.3 %
extracto de levedura 0.3 %
peptona 1.5 %
lactose 1 %
glucose 0.1 %
sulfato ferroso 0.02 %
cloreto de sódio 0.5 %
tiosulfato de sódio 0.03 %
vermelho de fenol 0.0024 %
agar 1.2 %
Técnica:
• inoculação do meio por picada central no fundo do tubo, e por estrias na rampa
• incubação a 37ºC/24h
Leitura do fundo:
• Fermentação de glucose - cor amarela
Se a bactéria fermentar a glucose os produtos de fermentação (ácidos) acidificam o meio fazendo o
indicador de pH (vermelho de fenol) virar para amarelo.
Leitura da rampa:
• Após algumas horas, oxidação da glucose - cor amarela
• Após 24h:
Glucose (+); lactose (-) - A glucose esgota e a lactose não é fermentada; a bactéria recorre à
catabolização de aminoácidos com formação de produtos que alcalinizam
o meio (ex. NH3) fazendo o indicador de pH virar para vermelho.
ou
Glucose (+); lactose (+) - A glucose esgota e a lactose é fermentada; os produtos de fermentação
acidificam o meio e o indicador de pH permanece amarelo
Teste da oxidase
Como já foi referido as espécies da família Enterobacteriaceae são aeróbias anaeróbias facultativas
enquanto que as espécies da família Pseudomonadaceae são aeróbias estritas. O teste da oxidase permite
citocromo oxidase
2 citocromo c oxidado + tetrametil-p-fenilenodiamina →
Técnica:
• com uma pipeta Pasteur fechada, colocar uma colónia sobre um disco do teste da oxidase
previamente humedecido com água destilada estéril dentro de uma caixa de Petri vazia
Leitura:
oxidase (+) - coloracão púrpura
oxidase (-) - coloracão rosa
Caso o teste da oxidase seja positivo, a bactéria em estudo pertence à família Pseudomonadaceae. Uma
identificação complementar deve ser feita pela observação de pigmento de cor verde em placas de gelose
simples, assim como pela detecção de um cheiro característico a flores. A P. aeruginosa produz dois
pigmentos, a piocianina (azul) e a pioverdina (verde). A tonalidade esverdeada das colónias deve-se à
difusão dos dois pigmentos na gelose.
Teste da urease
Este teste é realizado no meio ureia-indol (que contém ureia, L-triptofano, tampão fosfato, glucose e
vermelho de fenol) e é pesquisada a enzima urease, responsável pela hidrólise da ureia (produto do
metabolismo dos aminoácidos) com obtenção de amónia:
urease
ureia + 2 H2O → CO2 + H2O + 2NH3
Dado que a amónia alcaliniza o meio, o indicador de pH nele contido (vermelho de fenol) vira para a cor
alcalina (rosa cereja).
Leitura:
urease (+) - meio rosa cerise
urease (-) - meio da cor original (amarelo)
TDA
L-triptofano → ácido indol-pirúvico
A presença de ácido indol-pirúvico será revelada por um reagente contendo percloreto de ferro em
solução ácida (HCl) que origina um composto castanho.
Técnica:
• Inocular o meio ureia-indol
• Incubar a 37ºC/24h
• Revelar com o reagente de TDA
Leitura:
TDA (+) - meio castanho escuro
TDA (-) - meio da cor anterior à adição do reagente de TDA
TDA
L-triptofano → ácido indol-pirúvico
hidrólise
ácido indol-pirúvico → indol + ácido pirúvico + amónia
A presença de indol será neste teste revelada por adição do reagente de Kovacs (p-
dimetilaminobenzaldeído em solução de HCl e álcool isoamílico) originando um composto de cor
vermelho cereja, o corante de Rosindol, que fica na fase orgânica.
Técnica:
• Inocular o meio ureia-indol
• Incubar a 37ºC/24h
• Revelar com o reagente de Kovacs
Teste do citrato
Este teste é utilizado para definir se a bactéria em estudo tem capacidade (por acção das enzimas citrato
permease e citrase) para usar o citrato como única fonte de carbono e energia, e um sal de amónia como
fonte de azoto, contidos no meio de Citrato-Simmons (composição: dihidrogeno fosfato de amónia,
fosfato dipotássio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de magnésio, azul de bromotimol, agar).
citrato
permease
citrato de sódio → ácido pirúvico + ácido oxaloacético + CO2
citrase
O dióxido de carbono produzido forma carbonato de sódio (com o excesso de sódio proveniente do
citrato de sódio) que por sua vez alcaliniza o meio de cultura fazendo virar o indicador de pH para azul:
Técnica:
• Inocular o meio de Citrato-Simmons, por estrias
• Incubar a 37ºC/24h
Leitura:
citrato (+) - meio azul
citrato (-) - meio da cor original (verde)
nitrato redutase
nitratos → nitritos
No caso da reacção ser negativa, a adição de zinco confirma a presença de nitratos não reduzidos,
reduzindo-os a nitritos (cor laranja-rosa). Se não houver alteração de cor após a adição de zinco significa
que houve uma redução completa dos nitratos (nitratos → nitritos → azoto gasoso), (ex. Pseudomonas
sp):
nitrito redutase
nitritos → N2↑
Pretende-se que os alunos aprendam a identificar algumas bactérias Gram negativas. Utilizarão técnicas
de exame microscópico, de cultura bacteriana e do estudo do metabolismo através da realização de
alguns testes bioquímicos.
• Pseudomonas aeruginosa
• E. coli
• Klebsiella oxytoca
• Proteus mirabilis
• Proteus vulgaris
• Pseudomonas aeruginosa
• Enterobacter cloacae
3) Incubar a 37ºC/24h.
1) Teste da oxidase
• Raspar um bastonete impregnado de tetrametil parafenilenodiamina (Oxoid) nas bactérias isoladas em
meio de cultura sólido. Incubar à temperatura ambiente.
• Observar a mudança de cor ao fim de 5 minutos.
2) Pesquisa de β -galactosidase
• A partir de colónias lactose (-), multiplicadas em meio selectivo (contendo lactose), fazer uma
suspensão bacteriana em soro fisiológico estéril num tubo de hemólise
• Adicionar uma gota de tolueno ou clorofórmio
• Agitar
• Colocar um disco de ONPG
• Incubar a 37º/24h
•
3) Testes do VM e de VP
• Inocular 2 tubos com o meio Clark e Lubs
• Incubar a 37ºC/24h
4) Teste do citrato
• Inocular o meio de Citrato-Simmons, por estrias
• Incubar a 37ºC/24h
3) Revelar o teste do VP
Construa uma tabela com os resultados obtidos relativamente a todas as bactérias estudadas.
9.1 – Introdução
Os bacteriófagos podem ser isolados a partir de muitos ambientes diferentes. Será de esperar encontrá-los
em grandes quantidades sempre que se estiver na presença de uma densa população bacteriana, como por
exemplo na água de esgoto.
Dado que a concentração de bacteriófagos específicos para um determinado hospedeiro pode ser
relativamente baixa, o primeiro passo no processo de isolamento é o de enriquecimento. Quando a
amostra é incubada com a população bacteriana respectiva, os fagos específicos para aquela bactéria vão
multiplicar-se em larga escala, sendo mais fáceis de isolar.
Para o isolamento dos fagos, as bactérias podem ser mortas e lisadas por um tratamento com
clorofórmio. Em seguida é efectuada uma filtração em membranas que serve para remover os resíduos de
células e as bactérias sobreviventes. O filtrado que contém os bacteriófagos pode ser armazenado no
frigorífico (2-8ºC) durante meses.
Os fagos do filtrado podem ser isolados misturando uma pequena quantidade de filtrado com uma cultura
em fase exponencial de crescimento da bactéria hospedeira. A mistura é então inoculada na superfície de
uma caixa de Petri contendo agar nutritivo. A esta técnica chama-se cultura em dupla camada.
Na prática, os vírus e as bactérias estão misturados com o meio de agar liquefeito (gelose mole)- agar da
camada de cima, sendo colocados sob a forma de camada fina na superfície do agar base (meio de
Luria-Bertani). Quando o agar da camada de cima gelifica, os vírus e as bactérias são imobilizados. O
fago, pelo facto de estar embebido na gelose e ter a sua mobilidade severamente restrita, infecta somente
as bactérias que lhe estão adjacentes. O fago vai reproduzir-se e, eventualmente, lisar a célula
hospedeira. A partícula viral irá dar origem a milhões de novos viriões, aparecendo então uma zona clara
de bactérias lisadas que se irá desenvolver na camada bacteriana. Esta zona clara, observada a olho nú, é
denominada de placa fágica (Fig. 9.1).
Amostras de cada placa podem ser retiradas e posteriormente utilizadas para cultivar grandes quantidades
de um único tipo de vírus.
Porque cada placa provém de uma única partícula viral, a contagem do número de placas irá permitir
calcular a concentração do vírus na amostra original. Uma vez que a eficiência do plaqueamento
raramente é próxima dos 100%, quando se utiliza o método das placas para quantificar os vírus, é mais
correcto exprimir a concentração (o título) da suspensão viral não como números absolutos de unidades
de viriões mas como números de unidades formadoras de placas (UFP).
Figura 9.1 - Placas de lise produzidas por dois colifagos (T1 e T2). Notar as diferenças no aspecto das
duas placas lise.
Pretende-se que os alunos pesquisem a presença de bacteriófagos em águas com elevada carga orgânica,
como por exemplo a água do esgoto, poço ou lago. No final desta aula os alunos deverão saber isolar e
titular fagos de E. coli e P. aeruginosa.
6) Num tubo contendo 10 ml de meio LB líquido adicionar 100 µl da mesma cultura de E. coli ou
P.aeruginosa usada anteriormente e incubar a 37ºC/24h (vai servir de cultura em fase exponencial de
crescimento para o dia seguinte).
3) Preparar a partir deste stock uma diluição fágica a 10-2 (Fig. 9.2)
0.1 ml
Adicionar 0,1 ml de
bactéria indicadora em fase
exponencial de
crescimento. 9.9 ml
0.1 ml 0.1 ml SF
Stock Diluição
-2
fágico 10
Bactéri
o
Banho a 48 C
3 ml 3 ml
o
Incubar 24h/ 37 C
Figura 9.2- Isolamento e titulação de bacteriófagos. Protocolo de preparação das diluições virais e da
infecção das bactérias alvo.
1) Determine o número de fagos de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa presentes num mililitro
de água de esgoto enriquecida. Apresente os cálculos efectuados.
2) Verifique a existência ou não de variações no tamanho das placas lise e morfologia das mesmas, para
a Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
3) Desenhe a morfologia das placas. Procure encontrar explicação para as diferentes morfologias das
placas.
10.1 Introdução
A cavidade oral é formada por um conjunto de tecidos, com numerosos microrganismos associados a
eles, constituindo um ecossistema. Quando este sistema ecológico se encontra em equilíbrio denomina-se
de eubiose, quando ocorrem alterações passa a chamar-se disbiose ou seja uma cavidade oral doente.
A flora oral é um dos mais complexos ecossistemas associados com superfícies biológicas. É responsável
pela formação da placa dentária, um biofilme que se forma na superfície do dente e compreende uma
diversidade de microrganismos, sobretudo bactérias, envolvidas numa matriz de polímeros de origem
quer microbiana, quer do hospedeiro. Estes biofilmes encontram-se geralmente num equilíbrio dinâmico
com o hospedeiro e são compatíveis com a manutenção da integridade dos tecidos colonizados. Em
presença de alterações do ambiente oral, esta microflora causa cárie e doença periodontal. Torna-se
então, absolutamente necessário, perceber a ecologia da flora oral, para explicar a etiologia da doença
oral.
A flora oral é muito complexa podendo ser isoladas > 500 espécies distintas de microrganismos_
bactérias, fungos, protozoários e, ocasionalmente, vírus_ numa mesma cavidade oral humana. A maioria
dos microrganismos existe apenas de forma transitória na cavidade oral. Alguns exemplos de
microrganismos existentes na cavidade oral:
• Bacilos Gram positivos: podem ser isolados numerosos bacilos Gram positivos e filamentosos
pleormórficos, dos quais se destacam diversas espécies de Actinomyces, Lactobacillus e Bifidobacterium;
• Dorso da língua: ocorre colonização bacteriana, sendo cerca de 45% cocos Gram positivos anaeróbios
facultativos (ex: S. salivarius) seguindo-se com cerca de 16% os cocos Gram negativos anaeróbios
estritos (ex: Veillonella) e por fim os bacilos Gram positivos anaeróbios facultativos (ex: Actinomyces).
• Mucosa: a sua microflora, com excepção dos lábios e da gengiva é essencialmente constituída por
cocos Gram positivos anaeróbios facultativos, especialmente pelos estreptococos.
• Superfícies dentárias: vão oferecer superfícies muito estáveis para a colonização microbiana e a
composição do biofilme vai depender dos diferentes tipos de placa estabelecidos. A placa pode ter dois
tipos de localização; acima da gengiva, placa supragengival, ou por baixo da gengiva, placa subgengival.
• Sulco gengival: num estado de saúde periodontal, predominam os cocos Gram positivos anaeróbios
facultativos (50%) e os bacilos Gram positivos anaeróbios facultativos (18%).
A cavidade oral desenvolve uma flora microbiana característica que varia de local para local. Esta flora
vive em harmonia com o hospedeiro e é designada por flora comensal ou nativa. A flora comensal tem
várias funções entre elas a prevenção da colonização por organismos potencialmente patogénicos. Os
organismos patogénicos são aqueles capazes de iniciar doença num individuo saudável. Contudo quando
o estado do hospedeiro se modifica (idade, administração de drogas, alterações no seu estado
imunológico) alguns comensais tornam-se oportunistas e provocam infecções. A maioria das infecções
orais provém de patogéneos oportunistas e não de verdadeiros organismos patogénicos.
A etiologia microbiana das patologias orais, tais como, cárie dentária, gengivite, periodontite, pulpite e
abcessos periapicais é complexa e está directamente relacionada com a microflora oral. Em determinadas
situações sabe-se que alguns microrganismos apresentam um papel bastante específico em alguns destes
processos patológicos (Tabela 1)
1. Colheitas
No estudo dos microrganismos orais e das patologias infecciosas da cavidade oral podem utilizar-se
diferentes tipos de amostras. O tipo de amostra estará condicionado pelo processo que se vai estudar e
pelo tipo de análise que se pretende realizar.
As amostras para exame microbiológico são muitas vezes obtidas com técnica inadequada, de um local
impróprio, e em quantidade insuficiente. Muitas delas são, também, comprometidas devido à demora e
aos inadequados acondicionamento e transporte para o laboratório, o que promove a distorção da
quantidade relativa de microorganismos presentes: morte dos mais sensíveis, que são normalmente os
responsáveis pela infecção, e proliferação exagerada dos mais resistentes, que muitas vezes não são mais
do que a flora autóctone.
Na colheita de amostras orais deve evitar-se tanto quanto possível a contaminação da amostra por flora
indígena oral.
6 - Colher com técnica adequada, evitando a contaminação da amostra com a flora autóctone;
A B
C D
Figura 1 – Tipos de amostras. Lesões da mucosa oral (A-D), placa supragengival (E), placa subgengival
(F).E F
A colheita de saliva é um método indirecto de colheita das bactérias dos dentes. Requer apenas que o
indivíduo mastigue um objecto (geralmente uma pastilha de parafina) que desaloja as bactérias dos
dentes e cuspa a saliva para um copo de recolha estéril.
As colheitas da mucosa oral e placa subgengival são feitas recorrendo normalmente a zaragatoas de
algodão esterilizadas, que são posteriormente colocadas em meio de transporte ou colocadas numa
solução de soro fisiológico para posterior inoculação de meios de cultura próprios.
A colheita de amostras da placa subgengival pode fazer-se com recurso a uma cureta (Fig. 1F), mas como
é fisicamente impossível inserir uma cureta a mais de 6 mm de profundidade há dificuldades em retirar
Os cones podem ser inseridos nas bolsas periodontais ficando embebidos no fluido que contém as
bactérias (Fig. 3). São depois retirados e colocados num tubo contendo uma solução salina ou aquosa ou
em meio de transporte.
As colheitas feitas a partir da cavidade oral devem ter em conta que a maioria dos microrganismos são
anaeróbios e como tal as amostras devem ser processadas com os cuidados requeridos para anaeróbios.
2. Transporte
Quando as amostras colhidas não podem ser imediatamente semeadas torna-se necessário um meio de
transporte. Idealmente o meio de transporte evita o contacto da amostra com o oxigénio, impede a
dissecação da amostra e evita que os microrganismos presentes na mesma se multipliquem. Desta forma
não há alterações no número de bactérias na amostra.
Meio de Stuart
O meio de transporte de Stuart (Fig. 4) é recomendado para a conservação e transporte de um grande
número de microrganismos patogénicos, incluindo anaeróbios. Exemplos de microrganismos que podem
O Portagerm (Fig. 5) é um meio redutor sólido tamponado para o transporte de aeróbios e anaeróbios. O
agar contido no meio impede a difusão do oxigénio que é levado durante a colheita. Os agentes redutores
combinam-se com o oxigénio livre para manter a anaerobiose. O indicador de oxido-redução permite
visualizar a presença ou ausência de oxigénio: coloração azul-lavanda-presença de oxigénio; sem
coloração: ausência de oxigénio. Qualquer que seja a origem a viabilidade da maior parte dos
microorganismos aeróbios e anaeróbios é mantida 48 horas a 20-25ºC.
3.1 Anaerobiose
Uma vez que a placa dentária, sobretudo a placa subgengival, contém bactérias anaeróbias é importante
que o meio de transporte seja apropriado para anaeróbios.
3.2 Dispersão
As bactérias da placa dentária tendem a formar aglomerados pelo que a amostra deve ser dispersada antes
do exame cultural para que se obtenham resultados representativos.
3.3 Diluição
O número de microrganismos presentes na placa é muito elevado (109-1012). Por essa razão a amostra
deve ser diluída antes do exame cultural de forma a permitir contagens precisas do número de colónias.
3.4 Incubação
Como a maioria dos microrganismos orais são anaeróbios as amostras devem ser incubadas em atmosfera
de anaerobiose. Se existir a suspeita da presença de bactérias aeróbias ou microaerófilas a amostra deve
ser incubada nesse tipo de ambiente.
- Exame a fresco
É um método rápido e barato para rastrear os diferentes tipos de morfologia microbiana. Pode recorrer-se
a microscopia de contraste de fase ou de fundo escuro. São distinguíveis quatro grandes grupos
morfológicos: cocos, bacilos imóveis, bacilos móveis e espiroquetas. A sua maior desvantagem é a
incapacidade para identificar espécies específicas. Certas formas atípicas de Streptococcus mutans
podem ser erradamente identificados como bacilos.
Meios não selectivos - permitem o crescimento dos microrganismos nas mesmas proporções em que se
encontram na amostra. Os meios não selectivos usados em microbiologia oral são meios simples
enriquecidos com extratos de tecidos ricos em proteínas suplementados com 5% a 10% de sangue
desfibrinado de cavalo, hemina, vitamina K e outros factores nutricionais que são importantes para o
crescimento de várias espécies orais. Ex. Tripticase soja agar.
Meios selectivos - Contém compostos que permitem apenas o crescimento de um determinado tipo ou
grupo de microrganismos. Exs. Meio ROGOSA SL, Mitis Salivarius Bacitracina Agar, Chromo ID
Candida.
Meio ROGOSA SL
O meio ROGOSA SL é usado como meio sólido seletivo para o isolamento de lactobacilos orais ou
fecais que apesar de terem pouco significado clínico podem ser confundidos com estreptococos.
Os produtos da digestão da caseína e dos tecidos animais fornecem carbono, azoto e aminoácidos usados
como requerimentos gerais para o crescimento bacteriano. O fosfato dipotássico e o agente tamponante.
O cristal violeta e o azul tripan inibem o crescimento da maioria dos bacilos Gram negativos e das
bactérias Gram positivas excepto os estreptococos. O azul tripan é absorvido pelas colónias produzindo
uma cor azul. A sacarose e a dextrose são utilizadas como fonte de energia. A sacarose permite que o
Streptococcus salivarius desenvolva colónias mais exuberantes que o Streptococcus oralis ou o
Enterococcus faecalis.
Streptococcus salivarius Colónias grandes, azuis claras, opacas, mucóides, 2-5 mm,
lisas ou rugosas, elevadas, brilhantes, com aspeto clássico
de “goma”, devido a formação de levanos a partir da
sacarose
Streptococcus mitis Colónias azuis, planas, pequenas, rijas, com cercar de 0.2
mm com centro em cúpula.
Streptococcus mutans Colónia elevada, convexa, ondulada, opaca, azul clara, 0.5-
1 mm, com margem rugosa; granular com aspecto de ”
vidro fosco”. Podem exibir uma bolha brilhante na
superfície da colónia ou ao longo dela devido a excessiva
síntese de glucanos a partir da sacarose.
Streptococcus sanguis Colónia elevada, lisa, rija, cravada no agar, adere á
superfície do meio e não é facilmente removida.
Enterococcus spp Colónia azul enegrecida, reluzente e levemente elevada, 1-2
mm com periferia bem delineada.
Atmosfera de incubação
A cultura de anaeróbios é baseada na exclusão de oxigénio da atmosfera e produção de um baixo
potencial de oxidação-redução no meio de cultura. Para isso a incubação dos meios de cultura tem de ser
feita em câmaras de anaerobiose ou em caixas de anaerobiose, caixas hermeticamente fechadas em
que se elimina o oxigénio através de uma reacção química com hidrogénio que dá origem a água (Fig. 8).
A identificação de muitas espécies orais é em geral presuntivamente efectuada por testes de identificação
semi-automatizados que põem em evidência características bioquímicas e/ou metabólicas das bactérias.
Exs. Sistemas API ou BBL. Contudo, a identificação definitiva de muitas espécies pode requerer um
estudo bioquímico aprofundado dos produtos finais do metabolismo ou o estudo do perfil proteico da
bactéria ou a caracterização genómica.
Exame microscópico
- Gram
- Fresco: - Mobilidade
Tolerância ao oxigénio
- Anaeróbios estritos
- Anaeróbios aerotolerantes
- Anaeróbios facultativos
- Microaerófilos
- Aeróbios estritos
Caracterização bioquímica
- Catalase
- Redução dos nitritos
- Oxidase
- Reacções de fermentação
- Análise dos produtos finais de fermentação
- Perfil proteico da membrana celular por SDS PAGE
- Reacções de hidrólise
Testes de imunodiagnóstico
A detecção dos antigénios bacterianos com recurso a anticorpos específicos pode ser importante para a
melhor caracterização de algumas espécies patogénicas da cavidade oral. Há ainda testes imunológicos
que permitem determinar os níveis de anticorpos anti-bacterianos na saliva, fluido gengival e soro.
Os testes imunológicos têm particular importância para a identificação de organismos que têm
dificuldade em crescer nos meios de cultura tradicionais uma vez que não requerem nem a viabilidade
destes organismos, nem manuseamento asséptico da amostra. Por outro lado, podem fornecer importantes
dados epidemiológicos mesmo na ausência de cultura bacteriana.
Ensaios de imunofluorescência
Os ensaios de imunofluorescência são baseados na ligação específica de um anticorpo primário aos
determinantes antigénicos na superfície do microrganismo em estudo. Um fluorocromo pode ser
acoplado a um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário sendo a imunofluorescência
indirecta; alternativamente, o fluorocromo pode ser acoplado ao anticorpo primário sendo a
imunofluorescência directa.
Ensaios de aglutinação
Na aglutinação em látex, os anticorpos específicos são ligados a partículas de látex em poliestireno e o
contacto com o antigénio homólogo vai induzir à formação de uma rede de aglutinação. Aglutinação em
látex tem vindo a ser utilizado para identificar P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e serotipos de
Streptococcus sp.
A aplicação de testes com ácidos nucleicos no diagnóstico de infecções microbianas baseia-se no facto
de todos os organismos vivos terem um material genético único que os distingue de todos outros. Ao
contrário do exame cultural, não são necessários organismos vivos e ao contrário das técnicas
imunoenzimáticas a identificação é independente das reações antigénio-anticorpo. A maior vantagem da
identificação pelos ácidos nucleicos é a possibilidade de distinção entre espécies de maior ou menor
potencial patogénico. A sua limitação principal é que apenas os microrganismos para os quais já existem
sequências de DNA disponíveis podem ser conclusivamente identificados. Estes métodos permitem
também obter alguma informação sobre padrões de susceptibilidade aos antibióticos com base em
mutações de resistência conhecidas. Contudo, nem todas as mutações de resistência são conhecidas pelo
que nem sempre é possível obter informação conclusiva sobre a susceptibilidade dos microrganismos aos
antibióticos por esta via. Têm vindo a ser desenvolvidos testes com ácidos nucleicos para identificação e
caracterização de P. gingivalis, Peptostreptococcus micros e A. actinomycetemcomitans, entre outros.
Placa Supragengival
Raspar as zonas de retenção com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com meio de transporte.
Dorso da língua
Raspar o terço posterior do dorso da língua com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com
meio de transporte.
Mucosa Oral
Raspar a face interna da bochecha com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com meio de
transporte.
Placa Supragengival
Raspar as zonas de retenção com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com 0,5 ml de SF (soro
fisiológico). Dispersar os microrganismos agitando o tubo (zaragatoa + SF) em vórtex durante 1 minuto e
em seguida preparar um esfregaço em lâmina e executar a coloração de Gram.
Dorso da língua
3.1 Colheita
Raspar o terço posterior do dorso da língua com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com
0,5 ml de soro fisiológico. A partir da zaragatoa em soro fisiológico preparar um esfregaço em lâmina e
executar a coloração de Gram.
Mucosa Oral
Raspar a face interna da bochecha com uma zaragatoa e em seguida colocá-la em tubo com 0,5 ml de
soro fisiológico. A partir da zaragatoa em soro fisiológico preparar um esfregaço em lâmina e executar a
coloração de Gram.
Saliva
Recolher a ≥ 1 ml de saliva para recipiente graduado mastigando uma pastilha de parafina. Agitar o
recipiente em vórtex durante 1 minuto para dispersão. A partir da saliva recolhida preparar um esfregaço
em lâmina e executar a coloração de Gram.
Nota: Conservar a amostra no frio depois de a utilizar.
3º Dia - Inoculação de meios de cultura com amostras da placa supragengival, dorso da língua,
mucosa oral e saliva
Inocular os meios de cultura descritos em baixo por estrias utilizando a zaragatoa colocada no meio de
transporte (placa supragengival, dorso da língua e mucosa oral). No caso da saliva, molhar uma zaragatoa
na saliva colhida.
Placa Supragengival
Exame a fresco
Coloração de Gram
Exame Cultural
Exame macroscópico
- Abundância da cultura
- Presença de cultura pura, predominante ou mista
- Aspecto das colónias em predomínio:
Gelose de Sangue ------------------------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Agar------------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Bacitracina Agar---------------------------------------------
Meio de Chapman ------------------------------------------------------------------------
Exame microscópico
Coloração de Gram das colónias em predomínio:--------------------------------
Testes de identificação
Teste da catalase
Resultado: -----------------------------------------------------------------------------
Tipagem de Estreptococos
Teste de aglutinação em látex – Classificação de Lancefield (Slidex Strepto Kit)
Resultado: ------------------------------------------------------------------------------
Exame a fresco
Células inflamatórias ----------------------------------------------------------
Quantidade relativa de microrganismos ------------------------------------
Mobilidade dos microrganismos --------------------------------------------
Fungos e protozoários -------------------------------------------------------
Coloração de Gram
Exame Cultural
Exame macroscópico
- Abundância da cultura
- Presença de cultura pura, predominante ou mista
- Aspecto das colónias em predomínio:
Gelose de Sangue -------------------------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Agar---------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Bacitracina Agar----------------------------------------------
Meio de Chapman ---------------------------------------------------------------------
Exame microscópico
Coloração de Gram das colónias em predomínio:--------------------------------
Dorso da língua
Exame a fresco
Coloração de Gram
Exame Cultural
Exame macroscópico
- Abundância da cultura
Exame microscópico
Coloração de Gram das colónias em predomínio:--------------------------------
Mucosa Oral
Exame a fresco
Coloração de Gram
Exame Cultural
Exame macroscópico
- Abundância da cultura
- Presença de cultura pura, predominante ou mista
- Aspecto das colónias em predomínio:
Gelose de Sangue -----------------------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Agar---------------------------------------------------------
Meio Mitis Salivarius Bacitracina Agar----------------------------------------------
Meio de Chapman ---------------------------------------------------------------------
Exame microscópico
Coloração de Gram das colónias em predomínio:--------------------------------
11.1- Introdução
O género Streptococcus engloba os estreptococos piogénicos (β-hemolíticos), os estreptococos orais e
vários outros estreptococos não agrupáveis. Os Streptococcus fazem parte da flora comensal humana e de
outros animais e encontram-se na pele, nas mucosas da nasofaringe, no canal alimentar e no trato
urogenital. A boca é o maior habitat das espécies orais que parecem estar bem adaptadas para colonizar a
mucosa oral (S. salivarius) ou as superfícies duras (S. sanguinis e S. mutans encontram-se no esmalte
dentário). Na cavidade oral, o S. mutans tem sido considerado o principal responsável por cáries
dentárias. A cariogenicidade deste microrganismo é atribuída à produção de ácido láctico que vai
dissolver o esmalte do dente; a produção de polissacáridos extracelulares na presença de sacarose é o
factor principal na colonização do dente por este organismo e contribui para iniciar a cárie. Em relação à
doença periodontal, algumas espécies como o S. sanguis podem ter um papel protetor.
Os estreptococos orais são os componentes maioritários da placa supragengival e também são
encontrados na placa subgengival.
Streptococcus orais
Streptococcus mutans - São os principais responsáveis por cáries dentárias. O potencial cariogénico é
primariamente expresso na capacidade para fermentar açúcares até ácido lático (acidogenicidade láctica)
e na tolerância a valores baixos de pH, que são necessários para a desmineralização do dente. S. mutans
também consegue aderir à superfície de esmalte e produzir extracelularmente os glucanos resultantes da
polimerização da glucose.
Streptococcus sanguinis - Distinguem-se dos outros estreptococos orais porque são incapazes de
fermentar o manitol ou sorbitol e na sua apetência para produzir amónia e dióxido de carbono a partir da
arginina. A maior parte das estirpes isoladas produzem glucanos extracelulares a partir da glucose. Estas
bactérias conseguem aderir à película de esmalte e pensa-se que esta espécie seja a primeira
recolonizadora da superfície dentária limpa durante a iniciação da placa dentária.
Outros Streptococcus
Enterococcus faecalis - Os enterococos podem estar presentes em cerca de 75% da população mas
sempre em pequenas quantidades.
Streptococcus pneumoniae – Esta bactéria não faz parte da flora oral normal mas encontra-se presente
nas secreções oro-nasofaríngeas de alguns indivíduos.
Diagnóstico laboratorial
1. Cultura
Para a cultura destas bactérias recorre-se a meios de cultura selectivos para estreptococos orais
adicionados de 5% de sacarose (TYC;MSB;GSTB;TYCSB). Estes meios também ajudam a diferenciar as
diferentes espécies de estreptococos orais com base na sua morfologia. Ex. Mitis Salivarius Bacitracina
Agar.
2. Identificação
Para a identificação destas bactérias recorre-se aos seguintes métodos:
- Coloração de Gram
- Teste da catalase
- Estudo do padrão de hemólise
- Teste de sensibilidade à bacitracina e sulfametoxazol-trimetoprim (SXT)
- Agrupamento de acordo com a classificação serológica de Lancefield:
Grupo A – S. pyogenes
Grupo B – S. agalactie
Grupo A, C, F ou G – Grupo S. anginosus
Grupo D – E. faecalis
Não agrupáveis – S. pneumoniae
- Grupo viridans
Fazer a avaliação macroscópica das colónias obtidas em todos os meios inoculados na semana anterior
(MSA, MSBA, Gelose sangue e Chapman). Anotar especificamente os seguintes aspectos:
- Abundância da cultura
- Presença de cultura pura, predominante ou mista
- Aspecto das colónias em predomínio:
- Tamanho
- Cor
- Mucóides
- Aderentes ao agar
- Brilhantes
No meio MSA e MSBA, escolha o tipo de colónia em predomínio e efectue os seguintes procedimentos.
b. Teste da catalase:
• Colocar 2 gotas de água oxigenada (H2O2) numa caixa de petri ou lâmina;
• Com uma pipeta de Pasteur fechada retirar 2 colónias bacterianas e colocá-las sobre a água
oxigenada.
c. Para a análise da capacidade hemolítica, repicar as colónias de interesse do meio MSA e MSBA para
uma placa de gelose sangue (se necessário dividir a caixa em vários sectores). Incubar a 37oC
overnight.
1. Preparar suspensões bacterianas em soro fisiológico ou água destilada estéril. A suspensão tem de ter
turvação 1 na Escala de McFarland.
2. Embeber uma zaragatoa na suspensão bacteriana e inocular uma placa de meio Mueller-Hinton por
estrias apertadas (em 2 direcções ou mais) por toda a superfície do meio.
4. Colocar em cada placa os discos dos antibióticos respectivos com uma pinça ou com um aplicador
mecânico. Discos de antibióticos: amoxicilina; amoxicilina com ácido clavulânico; azitromicina;
eritomicina; tetraciclina; cefuroxima; penicilina; ciprofloxacina. Deixar difundir os antibióticos
durante 10 min.
Cada grupo pode fazer o teste a partir das colónias isoladas na aula anterior em gelose sangue
(fazer teste da catalase para confirmar se são estreptococos)
Preparação da galeria:
• Montar a galeria (câmara e tampa)
• Identificar a galeria com o nome da bactéria, nome do grupo e turma
• Colocar 5ml de água nos alvéolos de modo a proporcionar uma atmosfera húmida durante a incubação
Preparar o inóculo:
• Realizar uma suspensão bacteriana densa (4 McFarland), utilizando uma ampola de meio de
suspensão ou ABE.
Inoculação da galeria:
• Na 1ª metade (testes VP a ADH) distribuir a suspensão com uma pipeta estéril
• Para os testes VP a LAP encher tubo e cúpula
• Encher apenas o tubo para o teste ADH
• Na 2ª metade da câmara (testes RIB a GLYG), abrir uma ampola de meio API GP, e transferir o resto
da suspensão bacteriana anterior (cerca de 0,5ml), misturar bem
• Encher apenas os tubos de todos os testes
• Encher as cúpulas dos testes que têm o nome sublinhado com parafina líquida
• Fechar a câmara com a tampa e incubar a 37ºC/24h
2) Leitura do antibiograma
3º dia - Serotipagem de Estreptococos orais com teste de aglutinação em látex e leitura do API 20
Strep
Bactérias a utilizar:
- Streptococcus mutans
- Streptococcus pyogenes
- Streptococcus agalactie
12.1 Introdução
Os fungos são membros normais, embora minoritários, da flora microbiana oral. O fungo mais
frequentemente isolado da cavidade oral humana é a Candida albicans. Este organismo é um comensal
em aproximadamente 20-40% dos indivíduos saudáveis. Os fungos podem no entanto causar doenças da
mucosa oral particularmente em indivíduos imunocomprometidos. A infeção fúngica oral mais comum é
a candidíase que tem várias apresentações.
A célula fúngica
Um fungo é um eucariota definido pela ausência de organização tecidular e de clorofila. A célula fúngica
é frequentemente limitada por uma parede rígida de natureza celulósica ou quitinosa.
A maior parte dos fungos de importância médica apresenta um de dois tipos de morfologia celular. As
formas celulares esferoidais ou ovais são típicas de leveduras (fungos leveduriformes) e possuem o
diâmetro de 5 a 25 µm. As células tubulares ou filamentosas são características das hifas que constituem
os fungos filamentosos (ou bolores). Uma única célula pode possuir o comprimento de 5 a 50 µm por 2 a
5 µm de diâmetro. As leveduras aparecem isoladas ou em grupos de duas a três células, com uma delas
distintamente maior do que as outras. As células das hifas podem ou não ser compartimentadas por meio
de estruturas semelhantes a paredes cruzadas denominadas septos. Um conjunto de hifas forma um
micélio. Alguns fungos são dimórficos, ou seja, podem proliferar como leveduras ou como bolores.
Todos os fungos dimórficos são patogénicos para o homem, apresentando a forma de levedura no interior
do nosso organismo e a forma filamentosa no exterior (no meio ambiente).
Reprodução assexuada:
• Por divisão binária (por fissão)
• Por divisão binária (por gemulação)
• Por produção de esporos assexuados.
Reprodução sexuada:
Envolve a união de núcleos compatíveis e pode envolver também a formação de esporos sexuados:
zigosporos, ascosporos, basidiosporos.
Leveduras
As leveduras são fungos unicelulares, redondos ou ovais, de parede fina ou espessa. São normalmente 5 a
10 vezes maiores do que as bactérias. Multiplicam-se normalmente por fissão binária (reprodução
assexuada); quando as leveduras se multiplicam sexuadamente produzem vários tipos de esporos que
Figura 2 – Candidíase oral. (a) Lesões de candidíase pseudomembranosa no palato; (b) candidíase
crónica eritmatosa na mucosa palatal de um doente sem dentes com dentadura completa; (c) candidíase
em placas ou nodular na união dos lábios superior e inferior (superfícies mucosas); (d) queilite angular
nas uniões da boca, envolvendo a pele.
Tabela 1 – Classificação das infeções por Candida confinadas aos tecidos orais e periorais.
Técnica:
a) Execução de uma suspensão em tubo contendo soro humano com 3 ou 4 colónias.
b) Incubação 3 horas/37ºC.
Hoje em dia a maior parte dos laboratórios usam sistemas automatizados, vendidos comercialmente, para
executar os testes de assimilação dos açúcares e outros testes de identificação bioquímica de leveduras.
Os mais correntemente usados são: API (BioMerieux) e Minitek (BBL).
Api Candida
Sistema de identificação padronizado, destinada à identificação em 18-24h das leveduras mais
frequentemente encontradas em microbiologia clínica.
A galeria Api Candida engloba 10 tubos que contêm substratos desidratados para efectuar 12 testes de
identificação (acidificação de açúcares ou reacções enzimáticas). As reacções produzidas durante a
incubação traduzem-se por mudanças de cor espontâneas (Fig. 4).
A leitura das reacções é efectuada visualmente com o quadro de leitura e a identificação obtém-se por
consulta do sistema de identificação.
Vantagens:
• Identificação imediata de C. albicans = colónias azuis.
• Diferenciação de culturas mista através do aspeto das colónias
• Orientação na identificação de outras espécies de Candida (C. tropicalis, C. lusitaniae e C. kefyr) =
colónias rosa
• Elevado nível de seletividade para inibir bactérias
• O aspecto característico das colónias permite a orientação na identificação de fungos filamentosos e C.
krusei.
Figura 5 - Aspeto e coloração das colónias de diferentes tipos de Candida sp. no meio Chromo ID
Candida (BioMerieux).
Criptococose
A criptococose raramente envolve a cavidade oral. A doença é causada por Cryptococcus neoformans e
os doentes imunocomprometidos estão em risco de doença disseminada. As lesões apresentam-se como
úlceras ou nódulos na língua, palato, gengiva ou no alvéolo do dente. O diagnóstico é confirmado por
biópsia.
Histoplasmose
É endémica nos Estados Unidos e apresenta-se como uma doença pulmonar aguda ou crónica ou doença
disseminada progressiva. A histoplasmose oral pode ocorrer como histoplasmose pulmonar ou
disseminada ou como uma lesão primária em indivíduos saudáveis. O palato, língua, mucosa oral,
gengiva e lábios são locais frequentes de lesões. O diagnóstico pode ser estabelecido a partir de biópsia,
cultura, exame direto de esfregaços ou testes complementares de fixação.
Blastomicose
É uma infecção fúngica crónica causada por Blastomyces dermatidis. Ocorre principalmente na América
do Norte e ocasionalmente em África. Podem ocorrer lesões orais proliferativas ou ulceradas no palato
duro, gengiva, língua ou lábios. O diagnóstico é feito através de cultura ou de biópsia.
Paracocidioidomicose
A paracocidioidomicose ou blastomicose sul-americana é uma doença crónica provocada por
Paracoccidioides brasiliensis. Homens adultos de áreas rurais são os mais afectados com lesões
envolvendo a boca e a faringe. As lesões orais podem ser granulares e apresentar-se ulceradas, e resultam
de infecções primárias ou secundárias. Locais de envolvimento incluem a gengiva, palato, lábios e
mucosa oral. O diagnóstico é normalmente feito por biópsia.
Mucormicose
A mucormicose é uma doença rara mas com significado pois está frequentemente associada a um
desfecho fatal. É uma infecção oportunista normalmente envolvendo indivíduos debilitados. A doença é
causada por fungos da família Mucoraceae, principalmente Rhizopus e Mucor. A necrose dos tecidos
pode causar ulceração palatal e perfuração. A biópsia e os esfregaços são testes laboratoriais apropriados.
1.1 Colheita
- Bochecho com 5 ml de solução salina, durante 60 segundos, e expetoração do lavado para o mesmo
recipiente.
3) Inocular uma placa de meio de Sabouraud e uma de Chromo ID Candida pelo método de
estrias e incubar 24h a 37ºC.
2º Dia – Identificação
Preparação da galeria:
• Montar a galeria (câmara e tampa)
• Identificar a galeria com o nome da bactéria, nome do grupo e turma
Preparar o inóculo:
• Realizar uma suspensão fúngica homogénea, utilizando uma ampola de soro fisiológico e colónias de
uma levedura (turvação 3 McFarland) retirada do meio de Sabouraud inoculado na aula anterior.
Inoculação da galeria:
• Utilizando uma micropipeta (P1000) encher de suspensão fúngica unicamente os tubos de todos os
testes evitando a formação de bolhas
• Cobrir as cúpulas dos 5 primeiros testes (GLU a RAF) e do último (URE) com parafina líquida
• Fechar a câmara com a tampa e incubar a 37ºC/18-24h em aerobiose
13.1- Introdução
Até há relativamente pouco tempo o estudo do bacterioma da boca era limitado porque requeria o
isolamento das bactérias da boca em cultura e sua posterior identificação e classificação com recurso a
colorações e testes de metabolismo. Pela análise de ADN bacteriano presente na boca depressa se
percebeu que há muito espécies orais que não são cultiváveis nos meios disponíveis. Deste modo, hoje
em dia é comum recorrer-se a métodos moleculares baseados no ADN para identificar de forma
qualitativa e quantitativa as bactérias da boca. Pode assim saber-se se determinada bactéria existe na
bochecha, na língua ou na saliva dos indivíduos saudáveis, se está presente na placa subgengival ou
supragengival, se causa cárie, periodontite ou endodontite, etc. O ADN bacteriano pode ser obtido por
métodos simples a partir de todo o tipo de amostras orais e, em geral, a reação de PCR é a mais utilizada
na análise deste ADN logo seguida da sequenciação dos genes e análise filogenética das sequências
obtidas.
Doenças periodontais
O termo “doença periodontal” refere-se a um vasto grupo de alterações patológicas do tecido periodontal.
As formas mais comuns da doença são a gengivite e a periodontite. A periodontite é uma infeção baseada
na inflamação das estruturas de suporte do dente e é caracterizada pela destruição progressiva do
ligamento periodontal e osso alveolar que pode resultar na perda do dente. A periodontite é causada por
uma bactéria ou grupos de bactérias encontrados no biofilme da placa dentária. As duas formas distintas
de periodontite que ocorrem em indivíduos saudáveis são a periodontite crónica e a periodontite
agressiva, e estas duas condições têm sido o foco da maioria dos estudos de patogénese. Uma terceira
forma da doença ocorre em indivíduos com doenças sistémicas, mais frequentemente doenças genéticas
ou hematológicas que comprometem profundamente a resposta do hospedeiro a uma infecção bacteriana.
A alternativa à colheita com cureta é o uso dos cones de papel endodônticos (Fig. 2). Os cones podem ser
inseridos nas bolsas periodontais ficando embebidos no fluido que contém as bactérias (Fig. 3). São
depois retirados e colocados num tubo eppendorf contendo numa solução salina ou aquosa a partir da
qual se extrai o ADN bacteriano.
O Chelex 100 é uma resina composta por copolímeros do divinilbenzeno contendo iões iminodiacetato
emparelhados que atuam como grupos quelantes. O Chelex permite realizar uma extracção de ADN
rápida, barata e eficiente. O Chelex tem sido usado para extrair ADN a partir de uma grande variedade de
produtos biológicos (sangue periférico, sémen, lavados bucais, etc). A extração de ADN cromossomal
envolve normalmente a fervura de suspensões celulares numa suspensão de 5% de Chelex. A
alcalinidade das suspensões de Chelex (pH 10-11) e a exposição a temperaturas de 100oC leva à lise das
membranas celulares e desnaturação do ADN. O Chelex remove os iões metálicos divalentes que podem
atuar como catalisadores na degradação hidrolítica do ADN que pode ocorrer a temperaturas elevadas em
soluções de baixa força iónica. O ADN resultante neste processo é desnaturado (em cadeia única).
A reação de PCR
Entre 1983 e 1985, Kary Mullis desenvolveu a técnica de amplificação enzimática em cadeia (PCR) que
tornou possível amplificar milhões de vezes um fragmento de ADN e assim sintetizar grandes
quantidades de ADN. O primeiro passo do PCR é selecionar e sintetizar dois primers (oligonucleótidos
monocatenários) com sequência complementar à da extremidade 3´e 5´do ADN em dupla cadeia a
amplificar. Cada primer hibridiza somente numa das cadeias e funciona como iniciador da síntese do
ADN pelas ADN polimerases, o que significa que os fragmentos de ADN amplificados serão sempre
delimitados pelos primers utilizados no PCR.
O PCR ocorre em ciclos, cada um deles com três passos que se processam sequencialmente: desnaturação
do ADN alvo, hibridização dos primers e elongação.
Desnaturação do ADN alvo - O ADN alvo contendo a sequência a amplificar é desnaturado (separação
das duas cadeias por quebra das ligações de hidrogénio) por aquecimento a 94-96 oC.
Elongação – Nesta fase dá-se a síntese de múltiplas cópias da sequência de ADN alvo. A ADN
polimerase usa os primers como iniciadores da polimerização do ADN em cada cadeia. Para isso são
necessários os quatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), o tampão apropriado para a atividade da
enzima e a temperatura ótima de funcionamento da enzima. A temperatura ótima de funcionamento da
enzima mais utilizada no PCR, a Taq ADN polimerase, é de 72 oC.
Estes três passos repetem-se um número limitado de vezes, normalmente 35 vezes, em aparelhos
apropriados designados de termocicladores. Teoricamente, 20 ciclos irão produzir cerca de um milhão de
cópias da sequência alvo de ADN.
A - ADN polimerase
Na técnica de PCR só podem ser utilizadas polimerases termoestáveis. A polimerase mais popular é a
Taq ADN polimerase da bactéria termófila Thermus aquaticus. A Thermus aquaticus vive na água a
temperaturas de 75ºC. A sua polimerase, a Taq ADN polimerase, tem uma temperatura ótima de atuação
B - Primers
Dos muitos fatores que influenciam a eficiência e a especificidade da reação de amplificação nenhum é
mais crucial que o desenho dos primers. O desenho cuidado dos primers é necessário para se obter os
produtos desejados em grande quantidade, para suprimir a amplificação de sequências não requeridas e
para facilitar a consequente manipulação dos produtos amplificados. Cada primer deve ter 20-30
nucleótidos de comprimento e conter aproximadamente um nº igual dos quatro dNTPs, com uma
distribuição equilibrada de resíduos G e C e uma baixa propensão para formar estruturas secundárias
estáveis. Os primers podem ser seleccionados e analisados em programas de computador específicos
(exs. Oligotech e PerlPrimer).
D - Catiões divalentes
Todas as ADN polimerases termoestáveis requerem para a sua atividade catiões divalentes livres,
normalmente Mg2+. Devido à fixação do Mg2+ pelos dNTPs e primers a concentração molar do catião
deve exceder a concentração molar dos grupos fosfato fornecidos pelos dNTPs e primers. É impossível
recomendar uma concentração de Mg2+ que seja ótima em qualquer circunstância. No entanto, a
concentração de 1,5 mM é usada em rotina. A concentração óptima de Mg2+ deve ser determinada
empiricamente para cada combinação de primers e cadeia de ADN.
E - Tampão
O tampão é utilizado para manter o pH estável durante a reação. Normalmente utiliza-se o tampão Tris-
HCl com o pH ajustado entre 8,3 - 8,8 à temperatura ambiente (TA) a uma concentração de 10 mM.
Quando incubado a 72 ºC, temperatura normalmente usada na elongação, o pH da mistura de reação
baixa mais de 1 unidade produzindo um pH ≈ 7,2.
F - Catiões monovalentes
Os tampões de PCR contêm KCl 50 mM e funcionam bem para fragmentos de ADN superiores a 500 pb.
Aumentando a concentração de KCl para 70-100 mM, em geral, aumenta a eficiência do PCR para
fragmentos de ADN curtos.
Desnaturação
ADNs de cadeia dupla desnaturam a uma temperatura (Tm) que é determinada em parte pelo seu
conteúdo em G + C. Quanto maior for o conteúdo em G + C maior será a temperatura necessária para se
separar as duas cadeias da molécula de ADN. Quanto mais longa for a molécula de ADN maior terá que
ser o tempo necessário para separar completamente as duas cadeias à temperatura de desnaturação
escolhida. Quando a temperatura é reduzida nos dois passos subsequentes do PCR (hibridização e
elongação), as cadeias de ADN voltam a ligar-se retomando a sua forma nativa. Em PCRs catalisados
pela Taq ADN polimerase a desnaturação ocorre a 94-96 ºC. No 1º ciclo de PCR, a desnaturação ocorre
durante 5 minutos para aumentar a probabilidade de total desnaturação de moléculas de ADN longas.
Nos ciclos seguintes o tempo de desnaturação pode ser diminuído para 30 seg - 1 min.
Elongação
A elongação ocorre à temperatura ótima para a síntese de ADN catalisada pela polimerase termoestável,
que no caso da Taq ADN polimerase é de 72-78ºC. Nos dois primeiros ciclos a elongação a partir de um
dos primers forma um produto de sequência complementar à cadeia que vai para lá do local de ligação do
outro primer. No ciclo seguinte, são produzidas as 1as moléculas cujo comprimento é igual ao do
segmento de ADN delimitado pelos locais de ligação dos primers. A partir do 3º ciclo, este segmento de
ADN é amplificado exponencialmente. No último ciclo de PCR usa-se normalmente um tempo de
elongação três vezes superior aos dos ciclos anteriores, para permitir a completa elongação de todas as
moléculas amplificadas.
Uma vez que a reação de PCR é capaz de amplificar milhões de vezes uma única molécula de ADN
devem ser tomadas precauções para evitar contaminações da amostra com ADN exógeno. Estas
precauções tornam-se essenciais quando as sequências a amplificar estão presentes em baixa
concentração. Algumas precauções elementares a tomar para evitar contaminações no PCR são:
* Preparar e efetuar a mistura de reação de PCR numa câmara de fluxo laminar equipada com luz
ultra-violeta. A luz deve ser ligada antes e depois do trabalho, de modo a manter o ambiente estéril;
* Utilização de material descartável, como as luvas;
* Utilização de micropipetas que só servem para fazer as misturas de reação para o PCR e pontas
com filtro;
* Os reagentes para efetuar as misturas de reação do PCR não deverão ser usados para outros fins.
Na preparação destes reagentes deve-se usar material que não tenha sido utilizado nem exposto a outros
ADNs;
* Quando se adiciona a amostra de ADN à mistura de reação deve ter-se o cuidado de evitar a
formação de aerossóis que possam vir a contaminar outras reações; esta adição deve ser efetuada num
local diferente do da preparação da mistura de reação;
* Verificar sempre se os tubos se encontram bem fechados;
* Incluir sempre, pelo menos, um controlo negativo que irá conter todos os componentes da reação
com excepção do ADN que será substituído por água.
1º Dia - Extração de ADN a partir de amostras de placa subgengival (fluido gengival) pelo método do
Chelex 100.
2ºDia – Execução de uma reação de PCR para amplificação de um fragmento do gene do antigénio
polissacarídico específico do serotipo B de A. actinomycetemcomitans
O PCR realizado amplifica um fragmento de ADN com 333 pares de bases no serotipo B. Os produtos
amplificados serão analisados num gel de agarose a 2%. Os resultados esperados estão indicados na
Figura 4.
333
Figura 4 – Fotografia de electroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação por PCR de um
fragmento do gene que codifica para o antigénio polissacarídico específico (APE) de diferentes subtipos
de A. actinomycetemcomitans. O serotipo B origina um fragmento com 333 pb.
1. Tapar as extremidades laterais da cama do gel com fita adesiva e colocar o pente de modo a que os
dentes não toquem no fundo da cama.
2. Preparar quantidade suficiente de tampão de electroforese (TBE 0,5X ou TAE 1X) para encher a tina
de electroforese e fazer o gel.
3. Preparar a solução de agarose em tampão de electroforese a 2%
4. Dissolver no microondas até obter uma solução cristalina.
ATENÇÃO: A solução de agarose pode ficar superaquecida e entrar em ebulição. Cuidado ao tirar do
microondas.
5. Arrefecer o erlenmeyer em água corrente. Adicionar 5µlde gel rede misturar cuidadosamente.
6. Verter cuidadosamente a agarose na cama do gel, evitando a formação de bolhas.
7. Deixe solidificar completamente o gel e retire com cuidado o pente e a fita adesiva
8. Coloque a cama na tina de electroforese e tape completamente o gel com TBE 0,5X.
9. Prepare as suas amostras para aplicar no gel. Num tubo eppendorf adicionar10 µl do produto de PCR e
2 µl de tampão de aplicação de amostra.
10.Com cuidado aplique a mistura no poço do gel usando uma micropipeta.
11. Feche a tampa da tina e aplique um campo eléctrico que fará o ADN migrar do polo negativo para o
positivo. Corra o gel até o azul de bromofenol e o xileno de cianol terem migrado a uma distância
apropriada no gel.
12. Desligue a fonte de electroforese
13. Observe à luz ultravioleta e fotografe.
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