Protocolo de Técnicas Laboratoriales de Diagnóstico para Enfermedades y Plagas Apícolas

PROTOCOLO DE TECNICAS LABORATORIALES DE DIAGNOSTICO PARA ENFERMEDADES APICOLAS
PROTOCOLO DE TÉCNICAS
LABORATORIALES DE
DIAGNÓSTICO PARA
ENFERMEDADES Y
PLAGAS APÍCOLAS
1
Preparado por:
Grupo Ad hoc de Sanidad e Inocuidad Apícola
Astrid Valladares. Universidad de San Carlos, Guatemala
Roberto Perdomo B. Ministerio de Agricultura y Ganadería, El Salvador
Martin Lanza. Secretaría de Agricultura y Ganadería, Honduras
Ana C. Miranda. Ministerio Agropecuario y Forestal, Nicaragua
Ana Cubero M. Ministerio de Agricultura y Ganadería, Costa Rica
Niyra Castillo. Dirección General de Ganadería, Ministerio de Agricultura,
República Dominicana
Marcela Marchelli Q. Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria, El Salvador

PROTOCOLO DE TÉCNICAS
LABORATORIALES DE
DIAGNÓSTICO PARA
ENFERMEDADES Y
PLAGAS APÍCOLAS
3
INDICE GENERAL
I. INTRODUCCIÓN..............................................................................................06
II. MUESTREO.......................................................................................................06
2.1 Generalidades...............................................................................................06
2.2 Muestra de cría.............................................................................................07
2.3 Muestra de abejas adultas..........................................................................08

2.3.1 Muestra para Nosema spp..........................................................................08
2.3.2 Muestra para Varroa spp y Acarapis spp..................................................08
2.4 Muestra de espécimen sospechoso de Aethina tumida........................09
III. TÉCNICAS LABORATORIALES..........................................................................10
3.1 Determinación del porcentaje de infestación de Acarapis spp...........10

3.1.1. Tipo de muestra.............................................................................................10
3.1.2. Procedimiento...............................................................................................10
3.1.3. Cálculo...........................................................................................................11
3.2 Determinación del grado de infestación por Nosema spp...................11

3.2.1. Tipo de muestra.............................................................................................11
3.2.2. Procedimiento...............................................................................................11
3.2.3. Cálculo...........................................................................................................13
3.3 Determinación del porcentaje de infestación por colmena

de Varroa spp................................................................................................13
3.3.1. Tipo de muestra.............................................................................................13
3.3.2. Procedimiento...............................................................................................13
3.3.3. Cálculo...........................................................................................................14
3.4 Diagnóstico de Loque americana.............................................................14

3.4.1. Tipo de muestra.............................................................................................14

3.4.2. Procedimiento...............................................................................................15
3.5 Diagnóstico de Loque europea.................................................................19

3.5.1. Tipo de muestra.............................................................................................19
3.5.2. Procedimiento...............................................................................................19
3.6 Identificación de Aethina tumida...............................................................22

3.6.1. Tipo de muestra.............................................................................................22
3.6.2. Procedimiento...............................................................................................22
3.7 Identificación de Tropilaelaps spp.............................................................22

3.7.1. Tipo de muestra.............................................................................................22
3.7.2. Procedimiento...............................................................................................22
IV. BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................26
V. ANEXOS...........................................................................................................27
5.1 Bitácora de trabajo de diagnóstico apícola Varroosis, Acariosis y

Nosemosis.......................................................................................................28
5.2 Formulación de medios de cultivo para Paenibacillus larvae..............29
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Conteo en cámara de Neubauer........................................................12

Figura 2 Aplicación de prueba rápida de reacción inmunológica..............18
Figura 3 Dibujo esquemático de Melissococcus plutonius (a) y
Paenibacillus alvei (b)............................................................................21
Figura 4. Estructuras anatómicas características de la
Aethina tumida – Adulto.........................................................................23
Figura 5. Estructuras anatómicas características de la
Aethina tumida – Larva..........................................................................24
Figura 6. Comparación Varroa spp - Tropilaelaps spp.....................................25
I. INTRODUCCIÓN
La apicultura es una actividad que produce importantes beneficios a la

agricultura y al ambiente por medio de la acción polinizadora de las abejas.
Al mismo tiempo constituye una importante actividad económica, por la
producción de miel, la cual se exporta en un gran porcentaje (en algunos países
de la región centroamericana puede oscilar entre el 85 y 95% de la producción)
casi exclusivamente a la Unión Europea.
Dado que la miel es un producto alimenticio, es vital cumplir con las normas
nacionales e internacionales referentes a la inocuidad y calidad de los alimentos.
En la cadena de producción existe el riesgo de contaminaciones físicas, químicas

y biológicas de los productos apícolas si no se cumplen las medidas preventivas y
los controles adecuados, establecidos en las Buenas Prácticas Apícolas.
La práctica más importante del apicultor, en función de garantizar la inocuidad

de la miel y demás productos de la colmena, es la prevención y control de
enfermedades, especialmente la aplicación de medicamentos veterinarios.
Esto significa realizar un oportuno y acertado diagnóstico de las principales
enfermedades apícolas que afectan a las abejas.
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un documento de consulta

rápida para la toma de muestra y análisis de laboratorio de las principales
enfermedades y plagas apícolas, presentes o exóticas, para el sector apícola de
Centroamérica y República Dominicana.
NOTA: El diagnóstico veterinario debe realizarse en Laboratorios Acreditados, con

las pruebas debidamente validadas, dentro del alcance de la acreditación.
II. MUESTREO
2.1 GENERALIDADES.
El muestreo de colmenas es esencial para el monitoreo y diagnóstico de

enfermedades, debe realizarse de rutina, dos veces al año, antes y después
de la temporada de cosecha, o cada vez que se sospeche de la presencia de
patógenos en la colonia.
Para el caso del diagnóstico, se debe muestrear las colmenas que presenten
sintomatología de la enfermedad, que se sospeche padece la colonia.
6
En los muestreos de rutina (monitoreo) debe hacerse, seleccionando al azar, no

menos de siete colmenas, para garantizar la representatividad, obteniendo una
muestra de cada colmena. En caso que el apiario tenga más de treinta y cinco
colmenas, se debe obtener una muestra de cada cinco colmenas, equivalente
al 20%.
La muestra debe ir acompañada de un “informe de muestreo”, donde se

detalle aspectos como: fecha de muestreo, datos generales del productor,
datos generales del apiario muestreado, situación sanitaria del apiario y de las
colmenas al momento del muestreo, datos generales de la persona responsable
del muestreo, entre otros.
Para garantizar un correcto diagnóstico de la patología, las muestras deben ser

tomadas siguiendo lineamientos básicos siguientes:
2.2 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE CRÍA.
a). Desinfectar el cuchillo con el alcohol de 90°.
b). Cortar una sección de panal, como mínimo de 10 x 10 cm.

La sección de panal debe contener crías en diferentes estadios de desarrollo
o presentando síntomas de enfermedad (color oscuro, consistencia pastosa,
olor no característico, entre otros); así mismo, NO DEBE CONTENER MIEL.
c). Envolver completamente la sección de panal, con el papel de empaque o

papel periódico, no se debe utilizar bolsa plástica o deposito hermético, por
el riesgo de daño a la muestra. Sellar con cinta adhesiva.
d). Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

• Fecha del muestreo
• Nombre del productor:
• Ubicación del apiario:
• Numero o identificación de la colmena, de donde proviene la muestra.
La información debe ir escrita con lápiz grafito, para evitar que se borre por el
uso de alcohol.
e). Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

térmicos.
7
f). Entregar la muestra al laboratorio antes de las 48 horas de tomada, cuidando

de mantener la cadena de frio al movilizar la muestra; de ser necesario, la
muestra de panal puede conservarse en refrigeración, con el cuidado de no
mojar o humedecer la muestra.
2.3 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE ABEJAS ADULTAS
2.3.1 Muestra para Nosema spp.
a) Tapar la piquera de la colmena a muestrear.
b) Recolectar, con el cepillo barre abejas, las abejas pecoreadoras que se

acumulen en la piquera, introduciéndolas en el frasco con alcohol al 70%, de
preferencia etanol. Recolectar de unas 150 a 200 abejas.
c) Cerrar el frasco con las abejas.
d) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

• Numero o identificación de la colmena de donde proviene la muestra.
uso de alcohol.
e) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

térmicos.
f) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

puede conservarse en refrigeración o a temperatura ambiente.
2.3.2 Muestra para Varroa spp y Acarapis spp.
a) Seleccionar un panal con cría abierta a punto de opercular, generalmente

del centro de la cámara de cría.
b) Sacar el panal, sin usar excesivo humo, para evitar que las abejas nodrizas se
retiren del panal.
c) Recolectar, con el cepillo barre abejas, algunas de las abejas que se

encuentran sobre el panal, introduciéndolas en el frasco con alcohol al 70%.
8
d) Repetir pasos a), b) y c) hasta recolectar de unas 200 a 300 abejas; las abejas
deben ser obtenidas de varios panales, pero siempre de la misma colmena.
e) Cerrar el frasco con las abejas.
f) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

uso de alcohol.
g) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

térmicos.
h) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

2.4 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE ESPÉCIMEN SOSPECHOSO DE Aethina

tumida.
a) Recolectar con cuidado, la mayor cantidad de individuos (escarabajos

adultos y larvas), encontrados dentro de la colmena, y colocarlos dentro del
frasco con etanol al 70%.
b) Cerrar el frasco con los individuos.
c) Identificar la colmena de donde se obtuvo la muestra. Debe ser una marca

claramente visible e inconfundible.
d) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

• Fecha del muestreo.
• Nombre del productor.
• Ubicación del apiario.
NOTA: La información debe ir escrita con lápiz grafito, para evitar que se borre por
el uso de alcohol.
9
e) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

térmicos.
f) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

g) Informar a la Autoridad Competente, de la sospecha de Aethina tumida y

colaborar con ella, acatando las indicaciones que le sean notificada por los
oficiales de los servicios veterinarios nacionales.
NOTA: Pueden utilizarse trampas internas de captura de Aethina tumida, pero

evitando aquellas trampas que utilicen productos químicos, que puedan
representar un riesgo por residuos en la miel u otros productos apícolas.
III. TÉCNICAS LABORATORIALES
3.1 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE INFESTACIÓN DE Acarapis spp.
3.1.1. Tipo de muestra.
Según numeral 2.3.2
3.1.2. Procedimiento.
• Tomar al azar una submuestra de 50 abejas. Las abejas no deben llevar

muertas más de 2–3 días, a menos que se hayan mantenido a 4°C hasta 4
semanas.
• Separar el abdomen del tórax de cada abeja de la submuestra.
• Recoger cada tórax y separar la cabeza; con la pinza diseccionar el primer

anillo torácico, garantizando que con él, se extraen las tráqueas
completamente.
• Colocar, en la caja petri, frontalmente el anillo torácico e inmediatamente

colocar una gota de Acido Láctico sobre éste evitando que se seque.
• Realizar los dos pasos anteriores a las 50 abejas que componen la submuestra.
• Una vez diseccionados los 50 anillos, reposar por 15 minutos. Observar al

estereoscopio cada anillo, buscando la presencia de los ácaros en las
tráqueas.
10
• Contar cuantas abejas están infestadas.
• Calcular el porcentaje de infestación por Acarapis spp., como se indica en el

numeral 4.1.3.
• Elaborar el informe en Hoja de Reporte de Resultados (Anexo 5.1).
• Entregar, a quien corresponda, la Hoja de Reporte de Resultados, para que se

elabore el Informe de Resultados.
3.1.3. Cálculo
Determinación del Porcentaje de Infestación.
3.2 DETERMINACIÓN DEL GRADO DE INFESTACIÓN DE Nosema spp.
• Tomar al azar una submuestra de 60 abejas.
• Separar el abdomen del tórax de cada abeja y se colocan en el mortero

junto a 5 ml de agua destilada.
• Macerar los 60 abdómenes y posteriormente se agregan 15 ml de agua

destilada estéril, logrando una suspensión homogénea.
• Filtrar la suspensión de inmediato a través del tamiz, colectando el preparado

en la caja petri descartable;
• Agregar 40 ml de agua destilada al mortero y enjugar. Este enjuague debe

agregarse al primer filtrado, en la caja petri descartable.
• Tomar un poco del filtrado, empleando una pipeta pasteur y llenar, por
capilaridad, uno de los lados de la cámara de Neubauer.
11
• Dejar reposar sobre la platina del microscopio la cámara para que el líquido
se estabilice.
• Observar al microscopio con el objetivo 40X, y proceder a contar el número

de esporas presentes. La cuadrícula de la cámara está dividida en grupos de
16 cuadritos y cada grupo está enmarcado por líneas dobles. Se cuentan
todas las esporas enmarcadas por líneas dobles, incluyendo el en conteo a
todas las esporas que toquen las líneas dobles del lado izquierdo y superiores
de cada bloque, pero no a las que toquen las líneas dobles inferiores y las
del lado derecho del bloque. Para obtener un buen promedio, se cuentan las
esporas de 5 bloques (cuadrantes), los 4 de los extremos y el del centro.
(Figura 1).
• Determinar el nivel de infestación, haciendo uso de la fórmula planteada en

el numeral 3.2.3.

Cada bloque contiene 16

cuadrados redondeados
por líneas dobles (A y B)
Se cuentan las esporas
dentro del bloque y en las
dos líneas A solamente.
Figura 1. Conteo en
Cámara de Neubauer
12
3.2.3. Cálculo
Determinación del nivel de infestación.
Con base en el No. de esporas por abeja determinado, se estima el nivel de

infestación haciendo uso de la tabla 1.
Tabla 1. Nivel de Infestación de Nosema spp. en abejas melíferas.
3.3 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE INFESTACIÓN DE Varroa spp.
• Colocar las abejas que componen la muestra en el contenedor con malla.

Agregar etanol al 70% hasta cubrir por completo las abejas.
• Agitar el contenedor por alrededor de 2 minutos.
• Separar las abejas de los ácaros filtrando el alcohol a través del embudo con
la tela blanca.
• Observar la presencia de varroas en la tela y contarlas.
13
• En caso de ser positiva a varroosis, contar el total de abejas presentes en la

muestra procesada. Conservar los ácaros obtenidos para verificación.
• Colocar las abejas en el frasco en el que ingresaron y colocarles suficiente

alcohol al 70%, para conservar la muestra para otros análisis.
• Calcular el porcentaje de infestación por varroosis; como se indica en el

numeral 3.3.3.

3.3.3. Cálculo
Determinación del Porcentaje de Infestación.
Con base en el porcentaje de infestación por colmena, se estima el nivel de

infestación haciendo uso de la tabla 2.
Tabla 2. Nivel de Infestación de Varroa spp. en abejas melíferas.
3.4 DIAGNÓSTICO DE LOQUE AMERICANA (Paenibacillus larvae).
Según numeral 2.2
14
a1. Preparación de la muestra – Cultivo.

• Recoger restos de larva o de la pupa con una torunda estéril.

• Suspender la torunda en 5 – 10 ml de agua esterilizada o de solución
fisiológica dentro de un tubo de ensayo.
• Calentar a suspensión a 80 °C durante 10 minutos o a 95 – 96 °C durante 3

a 5 minutos, a fin de eliminar otros microorganismos productores de esporas.
a2. Preparación de la muestra – Restos larvales.
• Los restos de larvas sospechosas, se mezclan y en un cubreobjeto limpio

formar una película delgada.
• Para fijar el frotis, se flamea el cubreobjeto con la muestra hacia arriba.
• Ponga suficiente aceite de inmersión sobre un portaobjeto.

• Asegurese que el frotis esté completamente seco antes de teñirlo.
b1. Técnica por morfología de la colonia
• Preparar medio de cultivo. Los mejores resultados para el cultivo de

Paenibacillus larvae se obtuvieron con PLA, con agar MYPGP y CSA (agar
Columbia sangre de oveja). Las formulaciones de los dos medios PLA y
MYPGP, se establecen en el Anexo 5.2.
NOTA: Es recomendable realizar cultivo en paralelo de cepas de P. larvae de

referencia, por ejemplo LMG 9820 (denominación alternativa: ATCC 9545, DSM
7030) para la variante no pigmentada y DSM 16115 o DSM 16116 para el genotipo
pigmentado.
• Transferir una porción de la muestra a la superficie de un medio sólido con

una torunda de algodón estéril. Para la evaluación cuantitativa, se
recomienda extender un volumen fijo de suspensión en agar sólido con una
espátula o una pipeta asépticos en lugar de usar torundas de algodón.
15
• Incubar las placas a 34–37°C durante 2–4 días en una atmósfera del 5–10%
de CO2, aunque la incubación aeróbica también produce los mismos
resultados. Si el cultivo de P. larvae se viera obstaculizado por la aparición
de hongos, una buena solución consiste en añadir 16,8 μg/ml de medio de
anfotericina B (Sigma).
NOTA: Las muestras de larvas con enfermedad clínica darán lugar a placas con
crecimiento confluente después de 2–4 días, y seguirá una fase de subcultivo a
fin de aislar las colonias.
• Observar las caracteristicas de las colonias, según el medio de cultivo

utilizado:
• En PLA, las colonias de P. larvae son pequeñas, de un color entre verde

pálido y amarillo (el mismo color que el medio), con una superficie
ligeramente opaca y rugosa; a veces, la parte central es elevada.
• En MYPGP, las colonias son pequeñas, regulares, casi siempre rugosas,

planas o elevadas y de color entre blanquecino y beige.
• En CSA, las colonias son pequeñas, regulares, brillantes, mantecosas y

grisáceas.
NOTA: Se han descrito colonias de Paenibacillus larvae de pigmentación entre

naranja y roja.
b2. Técnica por Microscopia
Tinción de frotis de bacterias procedente de colonias aisladas.
• Sumergir el portaobjetos entero con el frotis con la solución de cristal violeta;

reposar por un minuto.
• Remover el colorante, lavando el portaobjetos con agua durante 5

segundos. Observándola a simple vista, la muestra debe tener un color
azul-violeta.
• Sumergir el portaobjetos en solución de yodo; reposar un minuto.
• Remover la solución, lavando el portaobjetos con agua durante 5 segundos.

En ese momento, la muestra debería tener aún el mismo color azul-violeta.
16
• Añadir gotas de etanol al 95% (decolorante) hasta que la muestra deje de

emitir el color azul-violeta.
NOTA: Esta fase es en cierta manera subjetiva, porque si se usa demasiado

decolorante puede obtenerse un falso Gram (–) como resultado. Por el contrario,
si no se usa bastante decolorante, puede obtenerse un falso Gram (+) como
resultado.
• Remover el etanol, lavando el portaobjetos con agua durante 5 segundos.
• Cubrir el frotis con safranina (contracolorante), reposar por un minuto.
• Remover el contracolorante, lavando el portaobjetos con agua durante 5

segundos.
• Reposar el portaobjetos para que se seque al aire. El secado puede

realizarse con papel adsorbente, siempre que se realice suave y
cuidadosamente.
• Observar al microscopio (100X) con aceite de inmersión
• Las células Gram-positivas incorporarán poco o nada de contracolorante y

seguirán teniendo color azulvioleta. Se tienen como Gram-positivas:
Paenibacillus larvae, Melissococcus plutonius y Paenibacillus alvei.
• Las bacterias Gram-negativas, adquieren un color rosado y se distinguen

fácilmente de las Gram positivas. Se tienen como Gram-negativas: Bacillus
laterosporus y Bacterium eurydice.
• Paenibacillus larvae. es un bacilo de extremos redondeados, recto o, a

veces, curvo, que varía mucho de tamaño (0,5 μm de ancho por 1,5 a 6
μm de largo), y se presenta solo, en cadenas y en filamentos. La espora
de la bacteria es ovalada y aproximadamente tiene de longitud lo doble
de su ancho, mide 0,6 por 1,3 micras y teñida, se observa de un color púrpura
rojizo más oscuro en las orillas y más claro en el centro. Presentan movimiento
browniano.
• Anotar los resultados en el Informe de resultados establecido por el

Laboratorio.
17
b3. Prueba de Holts
• Colocar una escama en un tubo de ensayo con 3 a 4 ml de leche en polvo

descremada y diluida al 1%.
• El tubo se incuba a 37° C durante 20 minutos; la prueba será positiva a

Loque Americana si la dilución se aclara (se aclara por la digestión de
la caseína de la leche debido a que el Paenibacillus larvae produce enzimas
proteolíticas).

Laboratorio.
NOTA: Esta prueba no es 100% confiable.
b4. Prueba rápida inmunológica (kit comercial):
Actualmente se dispone de kit comerciales para el diagnostico de Loque

Americana, que se basan en la reacción del Paenibacillus larvae con anticuerpos
especifico para este microorganismo.
Este tipo de kit, pueden utilizarse directamente en el apiario, ya que solamente

se pone en contacto extractos de una larva sospechosa con los anticuerpos
especificos sobre un visor y se espera un par de minutos para efectuar la lectura
de la reacción. Figura 2.
NOTA: Al obtener un resultado positivo se deberá de confirmar empleando la

técnica de medio de cultivo o PCR.
18
Figura 2. Aplicación de prueba rápida de reacción inmunológica
3.5 DIAGNÓSTICO DE LOQUE EUROPEA (Melissococcus plutonius)
Según numeral 2.2
a.1. Preparación de la muestra
• Revisar los panales a ambos lados, si hay o no celdas operculadas o abiertas,

con larvas muertas o vivas.
19
• Destapar opérculos si se encuentran sellados.
• Recoger restos de larva o de la pupa con una torunda estéril.
• Suspender la torunda en 5 – 10 ml de agua esterilizada dentro de un tubo

de ensayo.
NOTA: Las larvas recién muertas son las de elección para el diagnóstico, antes
de que tenga lugar la descomposición, se hace un frotis de las larvas muertas
en el portaobjetos o se separan apretando la cutícula en el centro del cuerpo
con unas pinzas que luego se retiran. El contenido del intestino medio se deja
expuesto en el portaobjetos, dentro de la membrana peritrófica transparente y
gelatinosa. Esta está parcial o casi totalmente llena de bacterias que pueden
verse fácilmente formando montones de color tiza opaco. El intestino medio de
las larvas sanas, que son de más difícil disección, tiene un color marrón dorado.
Las larvas aparentemente sanas contienen una mezcla de bacterias y de polen. El
intestino medio de las larvas sanas, que contiene mucho polen de color brillante,
puede parecerse a los intestinos llenos de bacterias.
b1. Técnica de observación directa:
Preparación del frotis.
• Transferir, con un asa de siembra, una pequeña cantidad de suspensión

acuosa del contenido del intestino medio a un portaobjetos.
• Mezclar con una pequeña cantidad de nigrosina acuosa al 5%.
• Extender la mezcla, sobre uno o dos centímetros cuadrados.
• Secar la mezcla poco a poco sobre una llama.
NOTA: De ser necesario, puede realizar una tinción para determinación de Gram
positivo o negativo.
• Observar al microscopio (100X) con aceite de inmersión
• La presencia de numerosos estafilococos lanceolados, de aproximadamente

0,5-1,0 μm de tamaño, que se presentan individualmente o en grupos,
dispuestos en pares o en cadenas cortas, es suficiente para dar un
diagnóstico casi seguro del Melissococcus plutonius (loque europea).
Figura 3-a.
20
Nota: Es probable que las preparaciones similares, hechas con suspensiones

acuosas de larvas enteras muertas o en descomposición, presenten una población
variada de bacterias, entre las que M. plutonius es muy difícil de distinguir.
• Paenibacillus alvei. Este es un organismo en forma de bastoncillo que mide

aproximadamente de 0,5 a 0,8 micras de ancho por 2,0 a 5,0 micras de
longitud. Sus esporas miden 0,8 por 1,8 a 2,2 micras. Figura 3-b.
• Bacillus laterosporus. Anteriormente este organismo era conocido como

Bacillus orpheus. Ocasionalmente se encuentra en la larva muerta de la
Loque Europea. Los bastoncillos miden de 0,5 a 0,8 por 2,0 a 5,0 micras y las
esporas 1,0 a 1,3 por 1,2 a 1,5 micras. Se observa como un organismo de
forma ovalada y alargada, con los extremos redondeados, muy teñidos en
un lado y en los extremos. La parte clara corresponde a la espora de la
bacteria.
• Achromobacter (bacterium) eurydice. Esta es la otra bacteria que se

encuentra frecuentemente en caso de Loque Europea, no forma esporas
y aparece en pares o sola. El tamaño de A. eurydice, va de 0,5 a 1,4 micras
de longitud por 0,4 a 0,7 de ancho.

Laboratorio.
Figura 3. Dibujo esquemático de Melissococcus plutonius (a) y Paenibacillus alvei (b).
21
b2. Prueba rápida inmunológica (kit comercial):
Actualmente se dispone de kit comerciales para el diagnóstico de Loque Europea,

que se basan en la reacción del Melissococcus plutonius con anticuerpos
específicos para este microorganismo.
Este tipo de kit, pueden utilizarse directamente en el apiario, ya que solamente

se pone en contacto extractos de una larva sospechosa con los anticuerpos
específicos sobre un visor y se espera un par de minutos para efectuar la lectura
de la reacción. Figura 2.
3.6 Identificación de Aethina tumida.
Según numeral 2.4
3.6.2. Procedimiento
Observación directa al estereoscopio de cada individuo de la muestra, para

comparación morfológica:
• Por tamaño: Escarabajo adulto de 5 mm de largo por 3 mm de ancho;

Larva hasta 1,2 cm de longitud (fase deambulatoria).
• Color: Escarabajo adulto color uniforme entre marrón oscuro y negro (más
claro después de la eclosión); Larva blanquecino, a menudo revestidas con
una capa babosa y viscosa.
• Estructura anatómica: Figura 4 y Figura 5.
3.7 Identificación de Tropilaelaps spp.
De los ácaros obtenidos de la evaluación de varroa, numeral 3.3
3.7.2. Procedimiento
Observación directa al estereoscopio de cada individuo de la muestra, para

comparación morfológica:
22
• Cuerpo alargados y de color marrón-rojizo. Tropilaelaps clareae (<1 mm de

longitud), y T. mercedesae (< 9 mm de longitud) se diferencian por el tamaño
corporal, pareciéndose en el resto. Tropilaelaps koenigerum es ligeramente
más pequeño, con solo 0,7 mm de longitud.
• Ambas especies de Tropilaelaps pueden reconocerse fácilmente y

diferenciarse del ácaro Varroa. cuyo cuerpo es más ancho que largo, en
cambio el Tropilaelaps es alargado. Figura 6.
Figura 4. Estructuras anatómicas características de la Aethina tumida - Adulto
23
Figura 5. Estructuras anatómicas características de la Aethina tumida - Larva
24
Figura 6. Comparación Varroa spp - Tropilaelaps spp
25
IV. BIBLIOGRAFIA
OIE, Organización Mundial de Sanidad Animal. 2012. Manual de las Pruebas de

Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres, Sección 2.2. APINAE. 7ª
edición. Paris, Francia. 423 – 468 p.
OIRSA, Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria. 1990.

Enfermedades y plagas de la abeja melífera occidental. San Salvador, El Salvador.
147 pp.
SHIMANUKI, H.; Knox, D.A. 2000. Diagnosis of honey bee diseases. USDA-Agriculture
handbook No. 690. Washington DC, Estados Unidos de América. 63 pp.
26
V. A N E X O S
27
5.1 Hoja de reporte de resultados para el diagnóstico apícola de Varroosis,

Acariosis y Nosemosis.
28
5.2 Formulación de medios de cultivo para Paenibacillus larvae.
PLA (agar Paenibacillus larvae)
Este medio selectivo combina tres medios diferentes para conformar una base a
la que se añaden antibiótico y yema de huevo como suplementos. Se combinan
y mezclan cantidades iguales (100 ml) de agar base líquida, selectiva y estéril
de Bacillus cereus (Oxoid CM617), agar tripticasa de soja (Merck 5458) y agar
nutritivo con suplementos (SNA). El SNA se compone (por cada litro) de: 23 g de
agar nutritivo, 6 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 2 g de Na2HPO4; el
pH final es 7,4 ± 0,2. Se esterilizan todos los medios sólidos a 121°C/15 minutos. Se
prepara una solución maestra de ácido nalidíxico disolviendo 0,1 g en 2 ml de 0,1
N NaOH y diluyendo hasta 100 ml con 0,01 M de tampón salino fosfato (pH 7,2).
Se prepara una solución base de ácido pipermídico disolviendo 0,2 g en 2 ml
de 0,1 N NaOH y diluyendo a continuación hasta 100 ml con el mismo tampón
fosfato. Se esterilizan las dos soluciones de antibióticos mediante filtrado.
Tras combinar los tres medios líquidos, se añaden 3 ml de la base de ácido

nalidíxico, 3 ml de la base de ácido pipermídico, y 30 ml de la suspensión de
yema de huevo al 50% (13) para formar el medio PLA. Se transfiere el medio PLA
(20 ml) a placas de Petri estériles y estas se secan antes de usarse (a 45–50°C
durante 15 minutos).
MYPGP (abreviatura inglesa se refiere a los constituyentes del agar: caldo

Mueller-Hinton, extracto de levadura, fosfato potásico, glucosa y piruvato)
El agar MYPGP se compone (por cada litro) de: 10g de caldo
Mueller-Hinton (Oxoid CM0405), 15 g de extracto de levadura, 3 gramos
de K2PO4, 2g de glucosa, 1g de piruvato de NA y 20g de agar.
La adición de los ácidos nalixídico y pipermídico se llevan a cabo de la forma

indicada para PLA.
29
Este documento es de distribución

Gratuita, en caso de venta, notiﬁque
a las Representaciones del OIRSA en sus países
o a las Secretarías/Ministerios de Agricultura.
30
Para mayor información acerca de esta publicación, favor comunicarse al
Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria en:
Calle Ramón Belloso, Final Pasaje Isolde, Colonia Escalón,

San Salvador, El Salvador, C.A.
PBX: (503) 2263 – 1123

FAX: (503) 2263 – 1128
Apartado Postal: (01) 61
e-mail: sanimal@oirsa.org;
inocuidad@oirsa.org
Web Site: www.oirsa.org

Protocolo de Técnicas Laboratoriales de Diagnóstico para Enfermedades y Plagas Apícolas

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PROTOCOLO DE TECNICAS LABORATORIALES DE DIAGNOSTICO PARA ENFERMEDADES APICOLAS

Grupo Ad hoc de Sanidad e Inocuidad Apícola

Astrid Valladares. Universidad de San Carlos, Guatemala

Roberto Perdomo B. Ministerio de Agricultura y Ganadería, El Salvador

Martin Lanza. Secretaría de Agricultura y Ganadería, Honduras

Ana C. Miranda. Ministerio Agropecuario y Forestal, Nicaragua

Ana Cubero M. Ministerio de Agricultura y Ganadería, Costa Rica

Niyra Castillo. Dirección General de Ganadería, Ministerio de Agricultura,

Marcela Marchelli Q. Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria, El Salvador

2.2 Muestra de cría.............................................................................................07

2.3 Muestra de abejas adultas..........................................................................08

2.4 Muestra de espécimen sospechoso de Aethina tumida........................09

III. TÉCNICAS LABORATORIALES..........................................................................10

3.1 Determinación del porcentaje de infestación de Acarapis spp...........10

3.2 Determinación del grado de infestación por Nosema spp...................11

3.3 Determinación del porcentaje de infestación por colmena

3.4 Diagnóstico de Loque americana.............................................................14

3.4.1. Tipo de muestra.............................................................................................14

3.5 Diagnóstico de Loque europea.................................................................19

3.6 Identificación de Aethina tumida...............................................................22

3.7 Identificación de Tropilaelaps spp.............................................................22

5.1 Bitácora de trabajo de diagnóstico apícola Varroosis, Acariosis y

5.2 Formulación de medios de cultivo para Paenibacillus larvae..............29

Figura 1 Conteo en cámara de Neubauer........................................................12

La apicultura es una actividad que produce importantes beneficios a la

En la cadena de producción existe el riesgo de contaminaciones físicas, químicas

La práctica más importante del apicultor, en función de garantizar la inocuidad

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El muestreo de colmenas es esencial para el monitoreo y diagnóstico de

En los muestreos de rutina (monitoreo) debe hacerse, seleccionando al azar, no

La muestra debe ir acompañada de un “informe de muestreo”, donde se

Para garantizar un correcto diagnóstico de la patología, las muestras deben ser

2.2 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE CRÍA.

a). Desinfectar el cuchillo con el alcohol de 90°.

b). Cortar una sección de panal, como mínimo de 10 x 10 cm.

c). Envolver completamente la sección de panal, con el papel de empaque o

d). Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

e). Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

f). Entregar la muestra al laboratorio antes de las 48 horas de tomada, cuidando

2.3 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE ABEJAS ADULTAS

2.3.1 Muestra para Nosema spp.

a) Tapar la piquera de la colmena a muestrear.

b) Recolectar, con el cepillo barre abejas, las abejas pecoreadoras que se

c) Cerrar el frasco con las abejas.

d) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

e) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

f) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

2.3.2 Muestra para Varroa spp y Acarapis spp.

a) Seleccionar un panal con cría abierta a punto de opercular, generalmente

c) Recolectar, con el cepillo barre abejas, algunas de las abejas que se

e) Cerrar el frasco con las abejas.

f) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

g) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

h) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

2.4 PROCEDIMIENTO PARA MUESTRA DE ESPÉCIMEN SOSPECHOSO DE Aethina

a) Recolectar con cuidado, la mayor cantidad de individuos (escarabajos

b) Cerrar el frasco con los individuos.

c) Identificar la colmena de donde se obtuvo la muestra. Debe ser una marca

d) Etiquetar la muestra, colocando como mínimo, la siguiente información:

e) Colocar la muestra etiquetada, en la hielera junto con los acumuladores

f) Entregar la muestra al laboratorio lo antes posible, de ser necesario la muestra

g) Informar a la Autoridad Competente, de la sospecha de Aethina tumida y