UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL

ESTADO DE MÉXICO

Facultad de Química

Químico Farmacéutico Biólogo

Práctica No. 4: Identificación cualitativa de Aminoácidos

Unidad de Aprendizaje: Bioquímica básica.

Equipo 8:

Jocelin Martínez Vera

María Fernanda Hernández Felipe

Itzel Bernardino Luis

3°Semestre GRUPO 32

Toluca, México a 15 de septiembre de 2018.

OBJETIVO:

El alumno identificara por medio de ensayos bioquímicos a algunos aminoácidos que conforman
las proteínas.

MARCO TEORICO:

Las reacciones de coloración para el reconocimiento de proteínas se basan principalmente en la

identificación de grupos estructurales de algunos de sus aminoácidos en particular, obteniendo
derivados coloreados. La formación de dicho color se interpreta como un resultado positivo, lo
que indica la presencia del aminoácido el cual dependerá de la reacción que se realice. Mientras
que la prueba que no produzca una coloración se interpreta como un resultado negativo, lo que
indica la ausencia de tal aminoácido.

Para la identificación de diferentes aminoácidos se realizan reacciones con determinadas

soluciones las cuales tienen características de reaccionar con cierto grupo del aminoácido.
Algunas son:

1. Reacción con Nihidrina: La ninhidrina es un compuesto químico que se utiliza en el

mundo de la cromatografía sobre capa fina para visualizar las proteínas. Esta sustancia
tiene la particularidad de colorear los aminoácidos (secundarios o primarios).
La reacción genera un producto de condensación coloreado. La intensidad del color está
relacionada con la concentración del aminoácido, por lo tanto, la prueba tiene utilidad tanto
para la valoración cuantitativa como para la valoración cualitativa de los aminoácidos, la
cual ocurre:
• La ninhidrina reacciona rápidamente con el grupo -amino oxidándolo: entre la
ninhidrina y el aminoácido ocurre una reacción de adición nucleofílica, donde se
eliminan dos moléculas de agua (deshidratación).

• En medio alcalino y en presencia de calor, el compuesto formado se descarboxila,

produciendo dióxido de carbono y formando la imina correspondiente.
 • La imina se hidroliza produciendo un anión diceto aminado y un aldehído:

• El producto formado reacciona con un exceso de ninhidrina para producir el

complejo coloreado (azul violeta) que se conoce con el nombre de púrpura de
Ruhemann:

2. Reacción Xantoproteica: Algunos aminoácidos como Fenilalanina, Tirosina y Triptofano,

tienen anillos aromáticos derivados de benceno y por ello tiene las propiedades químicas
del benceno y sus derivados. Una de estas propiedades es la reacción de nitración del
anillo bencénico con ácido Nítrico concentrado. Los anillos Benceno de Tirosina y
Triptofano están activados y reaccionan fácilmente, mientras que el benceno de la
Fenilalanina no tiene sustituyentes que lo activan y reacciona con más dificultad.

El nombre de la reacción se deriva del griego xantos, que significa amarillo, que es el color
característico de la reacción positiva. El color amarillo se intensifica en medio alcalino.
Esta reacción es la que provoca el color amarillo cuando se salpica la piel con ácido Nítrico
concentrado, las proteínas de la piel tienen Tirosina y Triptófano, los cuales, al nitrarse, le
dan a la piel un color amarillo característico.

3. Reacción de Millon: Es específica para el grupo fenólico, por lo tanto, la dan positiva
todas las sustancias que poseen esta función, como la Tirosina y todas las proteínas que
contengan Tirosina. El primer paso de la reacción de Millon consiste en la nitración del
anillo fenólico de la Tirosina, por el ácido Nítrico del reactivo. La Tirosina nitrada forma
complejos con los iones Mercurioso Hg(I) y Mercúrico Hg(II) del reactivo produciendo un
precipitado rojo o una solución roja, ambos resultados positivos.
 4. Reacción de Hopkins- Cole: Es específica del grupo indol característico del Triptófano.
El anillo del indol se hace reaccionar con ácido Glioxálico en presencia de ácido Sulfúrico
concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la
solución de proteína y el ácido sulfúrico.

5. Reacción de Nitroprusiato: Detecta aminoácidos azufrados. Los aminoácidos que

poseen grupos sulfhidrilos que se encuentran libres, como es el caso de la cisteína la cual
produce una coloración roja con nitroprusiato sódico en solución amoniacal diluida.

PROCEDIMIENTO:

Retirar la cubierta Fragmentar en 3

COTILEDONES
y separarlos c/u

Preparar una solucion con Dejar sedimentar, decantar y

FRIJOL SECO 50 mL de NaCl a 5 % y 10 g friltrar con papel filtro
de polvo de frijor
 Agregar 2 mL de
A 2 tubos de ensaye Glicina
colocar 0.5 mL de
Ninhidrina Ninhidrina y 3 gotas de
piridina (calentar 5 min a
baño maria) Adicionar 2 mL de
agua

Añadir 0.5 mL de
Fenilalanina
A dos tubo de ensaye
añadir 0.5 mL de HNO3 Colocar gota a gota
Xantoproteica (calentar a baño NaOH 40 %,
maria) mantener frio el tubo
Adicionar 0.5 mL de
agua

Agregar 1 mL de
tirosina
A dos tubos de ensaye
colocar 3 gotas de
Cotiledones Millon
ractivo Millon, calentar a
baño maria hasta hervir
Adicionar 1 mL de
agua

Agregar 1mL de
En 2 tubos de ensaye Triptofano
adicionar 5 gotas del
reactivo de Hopkins-
Hopkins-Cole Cole, mexclar.
Estratifique con 1 mL de
H2SO4 Adicionar 1 mL de
agua

Añadir 1mL de
A 2 tubos de ensaye Cisteina
añadir una gota de
Nitroprusiato Nitroprusiato de sodio
y una gota de NaOH
40%
Adicionar 1 mLagua
Identificación
cualitativa de
aminoácidos
Agregar 2 mL de
A 2 tubos de ensaye Glicina
colocar 0.5 mL de
Ninhidrina Ninhidrina y 3 gotas
de piridina (calentar 5
min a baño maria) Adicionar 2 mL de
agua

Añadir 0.5 mL de
Fenilalanina
En dos tubos de
ensaye añadir 0.5 mL Colocar gota a gota
Xantoproteica de HNO3 NaOH 40 %,
(calentar a baño mantener frio el tubo
maria) Adicionar 0.5 mL de
agua

Agregar 1 mL de
A 2 tubos de ensaye tirosina
colocar 3 gotas de
Filtrado de frijol Millon ractivo Millon, calentar
a baño maria hasta
hervir Adicionar 1 mL de
agua

Agregar 1mL de
A 2 tubos de ensaye Triptofano
adicionar 5 gotas del
reactivo de Hopkins-
Hopkins- Cole
Cole, mexclar.
Estratifique con 1 mL
de H2SO4 Adicionar 1 mL de
agua

Añadir 1mL de
Cisteina
A dos tubos de ensaye
añadir una gota de
Nitroprusiato
Nitroprusiato de sodio y
una gota de NaOH 40%
Añadir 1mL de
Cisteina
OBSERVACIONES:

• En la ninhidrina pudimos observar un tono purpura sin llegar al azul

• En la xanoproteica se puso de tonalidad amarilla y el y el otro de un tono
ligeramente azul purpura
• En el reactivo de millon el precipitado se tono rojo tras el efecto del calor
• En el Hoopkins- cole el anillo violeta era casi impredecible, solo se podía
distinguir hasta colocarlo cerca de la bata blanca
• En el nitroprusiato de puso de color rojo intenso

EVIDENCIAS:

Todas las muestras

RESULTADOS:

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA AMINOACIDOS

Prueba bioquímica Sustancia ensayada Resultados
Cotiledón con agua -
Ninhidrina Cotiledones +
Frijol seco con agua -
Frijol seco +
Cotiledón con agua -
Cotiledones +
Xanoproteica
Frijol seco con agua -
Frijol seco +
Cotiledón con agua -
Cotiledones +
Millon
Frijol seco con agua -
Frijol seco +
Cotiledón con agua -
Cotiledones +
Hoopkins- Cole
Frijol seco con agua -
Frijol seco +
Cotiledón con agua -
Cotiledones +
Nitroprusiato de sodio
Frijol seco con agua -
Frijol seco +

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La identificación de aminoácidos en base de diferentes reacciones es sumamente importante ya

que nos ayuda a saber que alimentos o muestra tiene determinados aminoácidos en su
estructura, durante el desarrollo de esta práctica se usó como factor o blanco negativo al agua
en lugar de la glicina, recordando que el agua puede actuar como factor negativo o positivo
dependiendo con el aminoácido con el que se encuentren en interacción.

CONCLUSIONES:

Al termino de la practica se pudo observar que los precipitados obtenidos eran correctos de
acuerdo con lo que la literatura dice, así como los colores de dichos precipitados. Por lo que
podemos concluir que los blancos obtenidos fueron los esperados y por tanto correctos.
CUESTIONARIO:

1.Investigue el fundamento de al menos otras dos pruebas para la identificación cualitativa de

aminoácidos.

Reacción de Biuret: reactivo formado por una solución de sulfato de cobre en medio alcalino,
este reacciona con el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de
coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que
forman parte de los enlaces peptídicos, lo que produce una coloración rojo-violeta presentando
un máximo de absorción a 540 nm.

Aplicación: el método normalizado se usa normalmente para la cuantificación de proteínas

totales.

Prueba de Sakaguchi: esta prueba es especifica para arginina o proteínas que la contienen. Es
positiva para el aminoácido que contiene el grupo guanidina en la arginina. El grupo guanidina
presente en el aminoácido reacciona con α-naftol e hipobromito alcalino para dar un complejo de
color rojo.

2.Escriba la ecuación química que corresponde al fundamento de cada una de las pruebas
realizadas en la práctica.

Prueba Reacción química

Ninhidrina
Xantoproteica

Millón

Hopkins-Cole

Nitroprusiato
3.Describa la clasificación de los aminoácidos de acuerdo con su grupo funcional.

Alifáticos: Glicina (Gly), Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu) e Isoleucina (Ille).

Contienen hidroxilo o azufre: Serina (Ser), Cisteína (Cys), Treonina (Thr) y Metionina (Met).

Cíclico: Prolina (Pro).

Aromáticos: Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr) y Triptófano (Trp).

Básicos: Histidina (His), Lisina (Lys) y Arginina (Arg).

ÁCIDOS Y SUS AMINAS: Ácido aspártico (Asp), Ácido glutámico (Glu), Asparagina (Asn) y
Glutamina (Gln).

4.Mediante un esquema identifique las principales partes de una semilla.

5.Investigue el aporte nutrimental de la semilla de frijol.
EJERCICIOS DE INTEGRACIÓN:

1.Esquematice el enlace peptídico que se lleva acabo entre los aminoácidos que conforman una
proteína.

2.Describa el procedimiento de la degradación de Edman para determinar la secuencia de

aminoácidos en una proteína.

Consiste en la degradación repetitiva de los péptidos a partir de una reacción con el grupo amino
terminal libre y con fenil isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando
feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con ácido fluorhídrico para liberar el aminoácido
que ha reaccionado del resto de la cadena peptídica mediante la formación de un derivado de
tiazolinona, el cual es convertido a un derivado más estable (un aminoácido PHT) por la adición
de TFA. Como consecuencia el péptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para
repetir el ciclo.
3.Investigue otro procedimiento que permita conocer la secuencia de aminoácidos, así como la
concentración de estos en una proteína.

Espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una herramienta muy apreciada para

el análisis de péptidos sintéticos, dada su sensibilidad, velocidad y alto grado de especificidad
molecular. Las técnicas de ionización utilizadas para el análisis de péptidos son el bombardeo
rápido de átomos (FAB por sus siglas en inglés), electrospray (ESI) y desorción/ionización
mediante láser asistida por matriz (MALDI).
Todas estas técnicas de ionización son utilizadas para determinar el peso molecular del péptido
sintetizado con gran precisión. Es recomendable determinar el peso molecular del producto antes
de la purificación, de esta manera, es posible conocer el estado de pureza del producto, si no
existen mezclas de péptidos truncados contaminantes, o si la desprotección del péptido ha sido
satisfactoria (analizando el producto final, o monitoreando etapas intermedias de la síntesis).
También es posible determinar la secuencia del péptido sintetizado, esto se lleva a cabo
mediante la espectrometría de masas en tándem, en donde un ión producido previamente por
una de las técnicas antes mencionadas, es disociado por colisiones con un gas. Los iones
fragmentados son obtenidos a partir del rompimiento de los enlaces de la cadena peptídica,
generando iones con el N-terminal y con el C-terminal, y a partir de una serie completa de los
iones fragmentados la secuencia de aminoácidos puede ser deducida.

BIBLIOGRAFÍA:
• “Química de los Alimentos, Reacciones de reconocimiento de Proteínas”,
http://blog.pucp.edu.pe/blog/quimicaalimentos/2017/10/31/reacciones-de-
reconocimiento-de-proteinas/, consultado 07 de Septiembre de 2018.
• Velazquez, M. y Ordorica, M. (2015). “Ptoteínas”, pp. 19.
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad30.pdf
• Murray, 2013. Harper, Bioquimica Ilustrada. 29aed, Mexico, DF: MC Graw-Hill
• “Guía nutrición”: http://www.guia-nutricion.com/frijoles/ .Consultado: 12 de septiembre de
2018.
• “Síntesis de péptidos”:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/sintesis_de_peptidos.pdf .Consultado: 14 de
septiembre de 2018.