LABORATORIO

 DE  
EXPERIMENTACIÓN  
QUÍMICA  FARMACÉUTICA  
2016-­‐I  

DRA.  ALEJANDRA  ROJAS  MOLINA  

   
 PRACTICA 1
Parte I

Cuantificación de Fenoles totales y flavonoides totales

I. Preparación del extracto

Nota: Todo el procedimiento debe realizarse usando luz atenuada

1. Pesar 5 a 10 g de muestra fresca si es fruta, para otro tipo de material

vegetal se requiere 1 g.
2. Agregar 10 mL de una solución compuesta de metanol: agua: ácido
fórmico (80: 10: 2).
3. Homogenizar durante 1 minuto aproximadamente y sonicar durante 30
minutos.
4. Filtrar con papel Whatman Num.1
5. Hacer una segunda extracción con el sedimento, empleando
nuevamente 10 ml de solución de extracción y repetir el procedimiento.
6. Medir el volumen final.
7. Centrifugar el volumen final del extracto (10 min a 8000 rpm) para
obtener un extracto de apariencia limpida.
8. Medir y anotar el volumen de extracto obtenido
9. Guardar el extracto a -20´C protegido de la luz.

Puntos a investigar
1.- ¿Qué son los compuestos antioxidante y cuál es el mecanismo de acción de
los antioxidantes de tipo alimenticio?
2.- Mencione la clasificación química de los compuestos de tipo fenólico
3.-¿Qué rutas metabólicas dan origen a este tipo de metabolitos
especializados?
4. ¿Cuál es el fundamento químico de los ensayos realizados?

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 PRACTICA 1
Parte II

Cuantificación de Fenoles totales y flavonoides totales

II. Cuantificación de Fenoles Totales por el método de Folin-Ciocalteu

1. Realizar una curva de calibración con ácido gálico empleando

concentraciones de 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.06 0.08 y 0.1 mg en 1 mL.
El ácido gálico se disuelve en metanol al 80%. Utilice metanol al 80%
como blanco.
2. A 1.5 mL de reactivo de Folin (diluido 1:10 en agua) agregar 0.3 ml de
extracto (diluido 1:10 en metanol) o 0.3 mL de solución estándar de
ácido gálico.
3. Después de 1 minuto adicionar 1.2 mL de Na2CO3 al 7.5%, agitar.
4. Reposar en la oscuridad por 90 minutos y leer la absorbancia contra un
blanco de metanol al 80%, a 765 nm.
5. Reportar el resultado como mg equivalentes de ácido gálico por g de
peso de muestra fresca.

III. Cuantificación de flavonoides por el método de Zhishen

1. Realizar una curva de calibración con catequina empleando
concentraciones de 0.02, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 y 0.2 mg en 1 mL. La
catequina se disuelve en metanol al 80 %.
2. En un matraz volumétrico de 10 ml se colocan 4 mL de agua destilada y
se agrega 1 mL de extracto (diluido 1:10 en metanol) o 1 mL de solución
estándar de catequina.
3. Al tiempo 0 agregar 0.3 mL de NaNO2 al 5%
4. Al minuto 5, agregar 0.3 mL de AlCl3 al 10%
5. Al minuto 6, agregar 2 mL de NaOH 1M, aforar con agua y agitar.
6. Leer a 510 nm con un blanco de agua en un tiempo no mayor a 30 min.
7. Reportar el resultado como mg equivalentes de catequina por g de peso
de muestra fresca.

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 PRACTICA 1
Parte III

Determinación de la capacidad antioxidante

IV. Ensayo DPPH

1. Realizar una curva de calibración con el estándar Trolox a 0.025, 0.05,
0.1, 0.15, 0.2 y 0.25 mg en 1 mL.
2. Disolver perfectamente 2 mg de DPPH en 50 mL de metanol. Medir y
corregir su absorbancia a 1 inmediatamente antes de usar (añadiendo
un poco más de DPPH o diluyendo con metanol si es necesario).
3. A 2.8 mL de reactivo DPPH añadir 0.2 mL de extracto (diluido 1:10 en
metanol) o añadir 0.2 mL de las soluciones de la curva de calibración.
4. Incubar a temperatura ambiente por 30 min en la oscuridad y leer a 480
nm. Utilizar metanol como blanco.
5. La cuantificación se realiza por medio del % de inhibición. Por lo cual,
no olvide anotar la absorbancia inicial del reactivo DPPH:
% inhibición= [(abs inicial – abs final) / abs inicial] x 100
6. Los datos obtenidos se reportan directamente como mg Eq Trolox/g de
muestra

IV. Ensayo FRAP

1. El reactivo FRAP está constituido por 50 mL de buffer de acetatos 300
mM pH 3.7, 5 mL de TPTZ 10 mM en HCl 40 mM (TPTZ= tripiridil-2-
tiazide, PM= 312.34g/mol) y 5 mL de FeCl3 20 mM.
2. Realizar una curva de calibración con el estándar Trolox a 0.025, 0.05,
0.1, 0.15, 0.2 y 0.25 mg en 1 mL.
3. Colocar alícuotas de 2.8 mL de reactivo FRAP y añadir 0.2 mL de
extracto (diluido 1:10 en metanol) o 0.2 mL de las soluciones estándar
de Trolox.
4. Reposar en la oscuridad por 30 min y leer a 630 nm.
5. Los datos obtenidos se reportan directamente como mg Eq Trolox/g de
muestra.

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 PRACTICA 2
Parte I

Obtención de alcaloides tropánicos a partir de especies del

género Datura

Obtención de los alcaloides de Darura stramonium

1. El proceso de basificación del material vegetal se realiza por
homogenización del material vegetal seco y fragmentado (50g) con KOH
al 10% p/v (impregnarlo cbp, aprox. 75mL).
2. El homogenado resultante se macera con 200ml de CHCl3 cada veinte
minutos durante una hora. Al término de la extracción, las soluciones
resultantes (fase orgánica) se concentran a presión reducida.
3. El residuo obtenido se resuspende en 50ml de CHCl3 y se somete a un
fraccionamiento mediante un proceso de partición con HCl 1N (50 ml).
Este procedimiento se repite tres veces.
4. La solución acuosa ácida se basifica mediante la adición gota a gota de
hidróxido de amonio concentrado hasta obtener un pH de 10.
5. Esta solución se somete de nueva cuenta a un proceso de partición con
CHCl3 (50 mL), de nuevo por triplicado. Al término del proceso de
partición, las soluciones orgánicas se concentran a presión reducida
hasta sequedad.
6. Finalmente se realiza el análisis cromatográfico en capa fina sobre
placas de aluminio recubiertas de gel de sílice. El proceso de elución se
lleva a cabo con una mezcla de CHCl3: MeOH:NH4OH (9:1:1); el agente
cromógeno será el reactivo de Dragendorff.

Puntos para investigar

1.-Describa efecto farmacológico de los tres principales alcaloides del genero
datura y atropa y concluya si este tipo de plantas sirven para “embrujar” según
la creencia popular.
2.- Describa brevemente el sistema nervioso entérico y concluya porque es útil
en ensayo de ileon aislado de rata para la evaluación de esta clase de
compuestos.

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 Parte II
EVALUACIÓN DE ATROPINA SOBRE LA CONTRACTILIDAD DE
SEGMENTOS DE ÍLEON AISLADOS DE RATA

Se evaluará el efecto de la atropina sobre segmentos de íleon aislado de

rata macho de aproximadamente 250 g de peso. Las ratas se sacrificarán
por decapitación e inmediatamente después se realizará una incisión
abdominal para extraer el íleon, el cuál se colocará en un recipiente con
solución de Krebs-Henseleit (Cuadro 1) a 37 °C, gasificada constantemente
con 95% de O2 y 5% de CO2.

Cuadro 1. Composición de la solución de Krebs-Henseleit para el ensayo de

íleon aislado de cobayo.

Composición (mM)

NaCl 118

KCl 4.7

NaHCO3 25

KH2PO4 1.2

MgSO4 1.2

Dextrosa 11

CaCl2 2.5

El íleon se cortará en fracciones de 5 cm aproximadamente, cada porción se

lavará haciendo pasar por su interior un poco de la solución de Krebs-
Henseleit con la ayuda de una jeringa con aguja de punta roma. Después de
limpiar los tejidos, se cortarán segmentos de 1 cm aproximadamente y se
montarán en celdas que contengan la solución de Krebs-Henseleit gasificada
constantemente con 95% de O2 y 5% de CO2.
6   LABORATORIO  DE  EXPERIMENTACIÓN  QUÍMICA  FARMACÉUTICA  
Las contracciones espontáneas de cada tejido aislado se registrarán
isométricamente por medio de transductores de fuerza acoplados a un
polígrafo de 4 canales. Todos los tejidos montados se ajustarán a una tensión
basal de 10 mN. Después de un tiempo de estabilización de 30 min, se
registrará un periodo control de 10 min y después de este tiempo se aplicará la
sustancia a evaluar disuelta en agua desionizada.

Se evaluará el efecto de la atropina purificada a una concentración de 10

µg/ml. En otro tejido se evaluará el efecto de la atropina pero después de un
periodo de 5 min se evaluará el efecto de la acetilcolina (10 µg/ml) sobre el
mismo tejido. Finalmente, en otro tejido se evaluará el efecto de la acetilcolina
para comparar los efectos.

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 PRACTICA 3

Síntesis de Difenilhidantoína

1. En un matraz de 100ml mezclar 2.5g de bencilo, 1.5g de urea, 10ml de

NaOH al 10% y 50ml de etanol.

2. Adapte un refrigerante para montar a reflujo y calentar a ebullición

3. Calentar la mezcla a ebullición durante 1 hora.

4. Dejar enfriar a temperatura ambiente y verter posteriormente sobre 75ml

de agua. Filtrar la suspensión obtenida.

5. El filtrado se acidifica con HCl concentrado, apareciendo un precipitado

blanco que se recoge por filtración al vacío y se seca.

6. Recristalizar con etanol.

7. Determine rendimiento.

8. Realice la determinación del punto de fusión para corroborar la identidad

del producto obtenido.

Puntos para investigar

1. ¿Cuál es el mecanismo de reacción por medio del cual se realiza esta

síntesis?

2. ¿Proponga un mecanismo de reaccion para el producto alternativo

difenilacetilendiureina?

3. ¿Cuál es el uso terapéutico de este compuesto y cómo fue descubierto?

4. ¿Se presentan las hidantoínas en algún producto natural?

8   LABORATORIO  DE  EXPERIMENTACIÓN  QUÍMICA  FARMACÉUTICA  

 PRACTICA 4

Obtención del ácido acetilsalicílico por medio de un proceso de

química verde

1. En un vaso coloque 0.56g de ácido salicílico y 1.2mL de anhídrido

acético. Con un agitador mezcle bien los dos reactivos.
2. Una vez que se obtenga una mezcla homogénea, adicionar 1g de NaOH
(o bien, 2.4g de carbonato de sodio), previamente molido y agitar
nuevamente la mezcla con el agitador de vidrio por 10 minutos.
3. Adicionar lentamente 6ml de agua destilada y posteriormente una
disolución de ácido clorhídrico al 50% hasta obtener una disolución con
un pH de 3.
4. La mezcla se deja enfriar en un baño de hielo.
5. El producto crudo se aísla por medio de una filtración al vacío. Lavar los
cristales de ácido acetilsalicílico con agua fría.
6. Determine el rendimiento y el punto de fusión.

Puntos para investigar

1. Escriba la reacción efectuada y proponga un mecanismo para la misma.

2. ¿Por qué este proceso se denomina de “química verde”?

3. ¿Qué tratamiento daría a los residuos generados durante la reacción?

4. ¿Qué procedimiento utiliza la industria farmacéutica para la síntesis de

este compuesto?

5. Describa los usos y mecanismos de acción del ácido acetil salicílico

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