Microbial enzymes: tools for biotechnological processes.

Jose L Adrio, Arnold L Demain, Biomolecules. 03/2014; 4(1):117-39.

ABSTRACT: Microbial enzymes are of great importance in the development of industrial

bioprocesses. Current applications are focused on many different markets including pulp and
paper, leather, detergents and textiles, pharmaceuticals, chemical, food and beverages, biofuels,
animal feed and personal care, among others. Today there is a need for new, improved and more
versatile enzymes in order to develop more novel, sustainable and economically competitive
production processes. Microbial diversity and modern molecular techniques, such as
metagenomics and genomics, are being used to discover new microbial enzymes whose catalytic
properties can be improved or modified by different strategies based on rational, semi-rational
and random directed evolution. Most industrial enzymes are recombinant forms produced in
bacteria and fungi.

Enzymes used in detergents: Lipases

Fariha Hasan, Aamer Ali Shah, Sundus Javed, Abdul Hameed African Journal of Biotechnology Vol.
9(31), pp. 4836-4844, 2 August, 2010, at http://www.academicjournals.org/AJB ISSN 1684–5315

ABSTRACT: Microbial lipases are an important group of biotechnologically valuable enzymes,

because of the versatility of their applied properties and ease of mass production. Lipases of
microbial origin are widely diversified in their enzymatic properties and substrate specificity, which
make them very attractive for industrial applications. This review describes the applications of
microbial lipases in detergents. Enzymes can reduce the environmental load of detergent products
as the chemicals used in conventional detergents are reduced; they are biodegradable, non-toxic
and leave no harmful residues. Besides lipases, other enzymes are widely used in household
cleaning products, in laundering, medical, agriculture, etc. This article also reviews the use of
enzymes, especially lipases as detergents and different types of lipase containing detergents
available in the market.

Lipases: an overview.
Leticia Casas-Godoy, Sophie Duquesne, Florence Bordes, Georgina Sandoval, Alain Marty Methods
in molecular biology (Clifton, N.J.) 01/2012; 861:3-30.

ABSTRACT: Lipases are ubiquitous enzymes, widespread in nature. They were first isolated from
bacteria in the early nineteenth century and the associated research continuously increased due
to the particular characteristics of these enzymes. This chapter reviews the main sources,
structural properties, and industrial applications of these highly studied enzymes.
 INHIBICION ENZIMATICA
La actividad enzimática se puede inhibir, es decir, reducir o eliminar la actividad
enzimática o catalítica de enzimas específicas.
La inhibición puede ser:
A) Irreversible - el inhibidor se une covalentemente a la enzima, casi siempre a un grupo
de la cadena lateral de los amino ácidos en el foco activo. La enzima queda inactiva
permanentemente.
Por ejemplo, la aspirina o ácido acetilsalicílico (ASA) inhibe irreversiblemente la acción de
la sintetasa de prostaglandina:

Algunas prostaglandinas producen dolor e inflamación. Al quedar bloqueada su síntesis se

reduce la inflamación y se alivia el dolor.
B) Reversible: el inhibidor puede disociarse de la enzima porque no se une por enlaces
covalentes. Esta inhibición puede ser competitiva o no-competitiva.
(a)Inhibición Competitiva - el inhibidor competitivo es muy similar al sustrato normal de la
enzima. Dada esa similitud estructural, este tipo de inhibidor se une reversiblemente al foco
activo de la enzima.

El inhibidor forma un complejo enzima-inhibidor equivalente al complejo enzima-sustrato:

Como hay un equilibrio, la rapidez de las reacciones de formación y separación del

complejo EI se igualan:
r[EI] = k1*[E]*[I]-k-1*[EI] 1
por lo que:
k1[E][I] = k-1[EI]
de aquí que:

2
donde KI es la constante de disociación (o constante de inhibición) de EI. Esta constante se
usa para describir cuán fuerte se une el inhibidor a la enzima.
De acuerdo a esta expresión,

por lo que [ EI ] es directamente proporcional a [ I ] e inversamente proporcional a KI.

O sea, a mayor valor de KI , más débil la unión del inhibidor con la enzima, el complejo EI
se disocia fácilmente, y el sitioo activo vacante puede estar disponible para unirse a su
sustrato.
No hay reacción productiva mientras el inhibidor se une a la enzima, por lo que la actividad
de la enzima declina.
El efecto del inhibidor competitivo en la actividad enzimática se revierte por un aumento en
la concentración del sustrato: a altas concentraciones todos los focos activos se combinan
con el sustrato y la actividad enzimática se normaliza.

El balance de enzima en el medio es:

ET = [E]+[ES]+[EI] 4

𝑟𝑝 𝑘3 [𝐸𝑆]
=
𝐸𝑇 [𝐸] + [𝐸𝑆] + [𝐸𝐼]

𝑟𝑝 𝑘3
=
𝐸𝑇 [𝐸] [𝐸𝑆] [𝐸𝐼]
+ +
[𝐸𝑆] [𝐸𝑆] [𝐸𝑆]

Sustituyendo [EI] en la ecuación de rp/ET

𝑟𝑝 𝑘3 𝑘3
= =
𝐸𝑇 [𝐸] [𝐸][𝐼] [𝐸] 𝐼
+1+ (1 + 𝐾 ) + 1
[𝐸𝑆] [𝐸𝑆]𝐾𝐼 [𝐸𝑆] 𝐼

sustituyendo el valor de [E]/[ES] y multiplicando por S y por ET ambos términos de la

ecuación
𝑟𝑃 𝑘3
=
𝐸𝑇 𝐾𝑀 (1 + 𝐼 ) + 1
𝑆 𝐾𝐼
 𝑘3 𝐸𝑇 𝑆
𝑟𝑃 =
𝐼
𝐾𝑀 (1 + 𝐾 ) + 𝑆
𝐼
5
En donde rpmax =k3*ET
que es la velocidad máxima de reacción enzimática porque ocurre cuando el total de la
enzima Et es convertida al complejo ES.

La rPmax se mantiene constante con o sin inhibidor competitivo. Sin embargo, cuando está
presente el inhibidor KM aumenta y rPmax se alcanza solo a muy altas concentraciones:

A baja [S] ([S] <<Km), la enzima está predominantemente en la forma libre, E. El inhibidor
competitivo puede combinarse con E, por lo que la presencia del inhibidor disminuye la
rapidez cuando [S] es baja. En estas condiciones la expresión de rapidez es:
ro = rPmaxS/Km.

También hay un aumento en Km’ según aumenta [I]. Por lo tanto, en la inhibición
competitiva se afecta la pendiente pero no hay efecto en rPmax.

(b) Inhibición No-Competitiva: el inhibidor se combina con la enzima en un lugar distinto

al sitio activo. Tanto EI como EIS se forman:
La unión del inhibidor afecta la configuración tridimensional de la enzima y bloquea la
reacción. Este tipo de inhibidor no compite directamente con el sustrato para unirse a la
enzima (no afecta la unión ES), por lo tanto, este tipo de inhibición no es reversible cuando
aumenta la concentración del sustrato.
Esta inhibición disminuye la Vmax según aumenta [ I ], pero no afecta Km (la enzima
puede unirse al sustrato):

Inhibición Incompetitiva o Acompetitiva: el inhibidor se combina sólo con ES (no con la

enzima), por lo que el inhibidor ejerce su efecto sólo a altas concentraciones de sustrato en
las que hay gran cantidad de complejo enzima-sustrato (ES). Por lo tanto, variando la [S]
no afecta o evita la unión con el inhibidor. Por otro lado, es evidente que el sustrato y el
inhibidor se combinan con la enzima en lugares diferentes.
A bajas concentraciones de sustrato ( [S]--->0), la enzima está libre (E). Como el inhibidor
no se combina con E, éste no afecta la velocidad.

Las ecuaciones cinéticas que describen las inhibiciones no competitiva y a competitiva son:
k1 k3
E + S === ES --- E + P
k2

k6
I + ES===IES 6
k7

r[IES] = k6*[ES]*[I]-k7*[IES] 7
por lo que:
k6[ES][I] = k7[IES]

y la constante de disociación es:

𝑘7 [𝐸𝑆][𝐼]
= = 𝐾𝐼𝐼 8
𝑘6 [𝐼𝐸𝑆]
De acuerdo a esta expresión,

[𝐸𝑆][𝐼]
[𝐼𝐸𝑆] =
𝐾𝐼𝐼
9
por lo que [IES] es directamente proporcional a [I] e inversamente proporcional a KII.
O sea, a mayor valor de KII , más débil la unión del inhibidor con la enzima, el complejo
IES se disocia fácilmente, y el sitio activo vacante puede estar disponible para unirse a su
sustrato.

El balance de las formas en las que se encuentra la enzima es:

ET = [E] + [ES] + [EI] + [IES]

Dividiendo la velocidad de formación de producto entre la enzima total

𝑟𝑝 𝑘3 [𝐸𝑆]
=
𝐸𝑇 [𝐸] + [𝐸𝑆] + [𝐸𝐼] + [𝐼𝐸𝑆]

𝑟𝑝 𝑘3
=
𝐸𝑇 [𝐸] [𝐸𝑆] [𝐸𝐼] [𝐼𝐸𝑆]
+ + +
[𝐸𝑆] [𝐸𝑆] [𝐸𝑆] [𝐸𝑆]

Sustituyendo los valores de {E]/[ES] y de [EI]/[ES] de la ecuación 3 y [IES]/[ES] de la

ecuación 9

𝑟𝑃 𝑘3
=
𝐸𝑇 𝐾𝑀 (1 + 𝐼 ) + 1 + 𝐼
𝑆 𝐾𝐼 𝐾𝐼𝐼
Multiplicando por S y por ET
𝑘3 𝐸𝑇 𝑆
𝑟𝑃 =
𝐼 𝐼
K M (1 + 𝐾 ) + 𝑆(1 + 𝐾 )
𝐼 𝐼𝐼

Dividiendo entre (1+ I/KII) tenemos la ecuación general de la cinética enzimática

𝑘3 𝐸𝑇
𝐼 ∗𝑆
1+𝐾
𝐼𝐼
𝑟𝑃 =
𝐼
1+𝐾
𝐼
KM 𝐼 +𝑆
1+𝐾
𝐼𝐼
10

Que podríamos simplificar como:

𝑟𝑃𝑚𝑎𝑥 ′ ∗ 𝑆
𝑟𝑃 =
KM′ + 𝑆
11
 𝑟𝑃𝑚𝑎𝑥
𝑟𝑃𝑚𝑎𝑥 ′ =
𝐼
1+𝐾
𝐼𝐼
12
𝐼
1+𝐾
𝐼
𝐾𝑀 ′ = K M
𝐼
1+𝐾
𝐼𝐼
13
Que representan la velocidad máxima y la constante de afinidad en presencia de inhibidor.
Nótese que si no hay inhibidor (I = 0) o su efecto es muy pequeño (I/Ki 0) en donde el
subíndice i puede ser I ó II.
𝑟𝑃𝑚𝑎𝑥 ′ = 𝑟𝑃𝑚𝑎𝑥

KM’ = KM

Inhibición por sustrato

El exceso de sustrato puede causar interferencias en los sitios activos de la enzima

formando un complejo enzimático saturado con sustrato que no es útil para la reacción

rp = k3 [ES].

k1 k3
E + S === ES  E + P
k2

k8
S + ES===SES 14
k9

rES = k1 E.S – k2 [ES]-k3[ES] = 0

rSES = k8 S [ES] – k9 [SES] = 0
Balance de la enzima ET = E + ES + SES

𝑟𝑃 𝑘3 ∗ [𝐸𝑆]
=
𝐸𝑇 E + 𝐸𝑆 + 𝑆𝐸𝑆

Rearreglando y sustituyendo como ya se ha hecho antes

 𝑘3 ∗ 𝐸𝑇 ∗ 𝑆
𝑟𝑃 =
𝑆2
KM + 𝑆 + 𝐾
𝐼𝑆

CONCLUSIONES
a. Si KII >> KI es muy grande tenemos la inhibición competitiva
b. Si KII = KI tenemos la inhibición no competitiva
c. Si KII << KI ¿Qué tenemos?

Ejercicio:
1. demuestre las conclusiones a. y b. y conteste la c.
2. Complete el siguiente cuadro de resumen

Resumen:
Efecto cinético en reacción con inhibición relativa a la reacción sin inhibir:
Tipo de Inhibición KM ’ rmax’
Sin inhibición No cambia No cambia
Competitivo Aumenta No cambia
No competitivo
A competitivo
Por sustrato No cambia No cambia