Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada

Fluoróforos y sus aplicaciones

Chris Wood
Octubre 2015
 Una breve historia de fluoróforos…

Coatli .....patli, yoan aqujxtiloni, matlatic iniayo axixpatli..

“it is a medicine, and makes the water of blue color, its
juice is medicinal for the urine”

Sahagún, Florentine Codex Vol. III f. 266; CM-RAH, f. 203v.

La primera reporte de fluorescencia se escribió en Mexico por el misionario franciscano

Bernardo de Sahagún
 Charles de L’Écluse (1526-1609) llamó el palo Ligno
Nephriticum por sus propiedades medicinales en
mejorar el funcionamiento del riñon en 1574

John Frampton escribió un poco más tarde sobre un “.. white woodde which
gives a blewe color” que es muy bueno “for them that doeth not pisse liberally
and for the pains of the Raines of the stone..”
 Robert Boyle (1670) atribuyó el color a un “sal esencial” ya que con
tiempo inmerso la madera perdió su propiedad. También descubrió
que los ácidos destruyen el efecto y que se puede recuperar la
fluorescencia agregando sustancias alcalinas.

Es decir, inventó el primer sensor de pH!

La identidad exacta de L. nephriticum se perdió, y no se descubrió otra vez hasta el
siglo pasado

Y no fue hasta 2009 hasta que se caracterizó el fluoróforo

 Matlaline

Prof David Jameson

 Fluorescencia

Un fenómeno asociado con moléculas policíclicas

aromáticas altamente conjugadas
Transferencia de energía y transiciones
electrónicas representadas en
el “diagrama de Jablonski”
Cada fluoróforo tiene su espectro de excitación
(absorción) y emisión
 Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbancia

de un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de

emitir un fotón para cada fotón absorbido
 Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbancia

de un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de

emitir un fotón para cada fotón absorbido

“Brightness” = Ɛɸ
 Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbancia

de un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de

emitir un fotón para cada fotón absorbido

“Brightness” = Ɛɸ

3. Vida media o “Lifetime” de la fluorescencia

 Vida media de la fluorescencia
Si damos un pulso de luz de excitación a una
población de fluoróforos en un solvente unforme,
la fluorescencia se decae exponentialmente.

La mayoría de los fluoróforos tienen una vida media (τ)

en el rango de nansegundos
 Vida media de la fluorescencia
1. Independiente de la concentración de
fluoróforo, y fenómenos como fotoblanqueo.

2. Sensible a interacciones en el entorno

molecular del fluoróforo – solventación,
oxígeno, pH, proximidad a otros fluoróforos
etc

3. Medir la vida media convierte algunos

fluoróforos en sensores moleculares de
temperatura, pH, iones, oxígeno etc
 “Quenching” y fotoblanqueo
1. El quenching (cuencheo?) es la disminución en
la emisión fluorescente por la actividad de
mecanismos de regreso al estado energético
basal no radiativos.

2. El fotoblanqueo es la destrucción permanente

del fluoróforo por modificación covalente de
su estructura.
 Propiedades idóneas de los
fluoróforos
1. Buen coeficiente de absorción y de
rendimiento cuántico
2. Resistencia a fotoblanqueo y entrar el estado
triplete

Secundarias: Solubilidad, baja toxicidad

(sistemas biológicas), un Stokes shift grande,
estable, barato, espectros compatibles con líneas
laser comunes, entre otras
 Alexa Fluor 488 vs
2x Real Time
Fluorescein fotoblanqueo

Cortesia invitrogen.com
 Clases de fluoróforo
Fluoróforos intrínsecos naturales
1. Triptofano , tirosina y fenilalanina

Espectro se desplaza por

grado de solventación,
susceptible al quenching
por aa ácidos como Asp
y Gln en proximidad
cercana

Utilizado para estudios estructurales sobre proteínas y péptidos, cambios

conformacionales, seguimiento de plegamiento etc
 Fluoróforos intrínsecos naturales
2. Metábolitos (NADH, FAD)

Varone et al CancRes 2014;74:3067-3075

midieron la variación en estado redox
entre diferentes regions en tejidos.
Vida media de NADH cambia si
está libre en solución o unido a
proteínas, y la proporción
libre:unido es relacionado al
equilibrio entre glicólisis y
OXPHOS en los tejidos

En este estudio, midieron y

mapearon los cambios en esta
proporción (y por ende la
transición en su estado
metabólico) durante la
diferenciación de células
troncales germinales a
gamétos en C. elegans

Stringari et al (2011) PNAS 108

(33) 13582–13587
 Fluoróforos intrínsecos naturales
3. Clorofila

www.nasa.gov
 Fluoróforos intrínsecos naturales
4. Proteínas fluorescentes

Shimomura, Johnson and Saiga (1962)

discovered Green Fluorescent Protein in
the Aequorea victoria jellyfish
 Purificaron 70 mgs de GFP de unas 30,000
Medusas con un peso total de 1.5 toneladas

Aislaron los “anillos exteriores”

de las medusas. Empezaron con
tijeras, pero al final diseñaron y
construyeron un equipo “corta-
anillos” para aumentar el
rendimiento
En.wikipedia.org/wiki
/fluorescence
 Múltiples colores Medir la expresión de
genes

Marcar organelos Generar organismos

subcelulares transgénicos

Fusionarla con otras Convertirlo en un

proteínas sensor
Actina-GFP en las raíces de Arabidopsis
noble.org
 Múltiples colores Medir la expresión de
genes

Marcar organelos Generar organismos

subcelulares transgénicos

Fusionarla con otras Convertirlo en un

proteínas sensor
Microscopyu.com
 Múltiples colores Medir la expresión de
genes

Marcar organelos Generar organismos

subcelulares transgénicos

Fusionarla con otras Convertirlo en un

proteínas sensor
Visualización de procesos dinámicos in vivo

Epithelial cell migration and interchange

during angiogenesis in the retina of zebra
fish embryo (48hpf) depends on VEGF
signalling

Jakobsson et al Nature Cell Biology 12, 943–953 (2010)

Proteínas fluorescentes como sensores de parámetros
intracelulares

Algunas FPs son intrínsecamente sensibles

al estado de su entorno, e.g. pH, cloro

La proteína se fusiona con un dominio

sensor. Cambios conformacionales
provocados por unión de ligando o
modificación del dominio sensor se trasmite
al dominio FP y la fluorescencia aumenta o
disminuye.
Cambios de Ca2+ intracelular en subdominios de células de astrocito,
medido a través de los cambios de intensidad de fluorescencia en el
sensor genético CGamP2

Shigetomi et al J Gen Phys (2011) 141, 633-647

Transferencia de energía por resonancia

1 – Sobrelape entre los espectros de emisión del donador y de excitación del aceptor
2 – una proximidad en el rango de 2 – 10 nm
A B A B

CFP YFP CFPYFP

 CFP-NIPP1 YFP-IPP1
(proteína de (proteína
andamio Eficiencia FRET
fosfatasa)
nuclear)

1 -10nm

CFP-NIPP1- YFP-IPP1
MUTANTE
Cortesía
www.olympusamerica.com
 FRET Intramolecular

Truong et al. Nat Struct Biol, 8: 1069

Existen sensores para Ca2+, actividad de cinasas, proteasas, nucleótidos cíclicos,

el cociente ATP/ADP, superóxido, peróxido, potencial de membrana etc etcc
 Proteínas fluorescentes fotoactivables

Fotoactivación paGFP-Actina 5 minutos después 60 minutos después

J. Cell Science 2007,120, 4257
Proteínas fluorescentes reversibles

DRONPA-actina

J. Cell Science 2007,120, 4257

Proteínas fluorescentes fotocrómicas

Dendra2-actina

Fotoconversión 20 minutos después 40 minutos después

J. Cell Science 2007,120, 4257

 Fluoróforos extrínsecos
1. Fluoróforos orgánicos
 ¿Como generamos especificidad
molecular en las tinciones?

Algunos fluoróforos como DAPI tiñen moléculas blancos específicas

(el ADN en este caso)

Otros no tienen ningún especificidad intrínseca, pero se puede

acoplar a otros moléculas que si tienen esta característica.
 Marcaje directo con fluoróforos químicos
• Life Technologies, Thermo, Pierce y otros venden kits
para marcar y purificar casi cualquier proteína
• Conjugan el fluoróforo con lisinas y cisteínas

• Requiere proteínas recombinantes

• Requiere lisinas o cisteínas reactivos
expuestos
• Puede interferir con función
• Difícil controlar la estequiometria
 Marcaje indirecto con fluoróforos químicos
(vía anticuerpos)

• No requiere proteínas recombinantes (pero si un anticuerpo primario)

• Puede interferir con función
• Puede generar puentes (aglomeraciones) en proteínas membranales
• En células fijadas para proteínas intracelulares
Afinidad directa Indirecta

DAPI marca ADN Anticuerpos fluorescentes

 Múltiples colores Microscopyu.com

Azul – citoesqueleto Rojo – mitocondria Verde - núcleo

 Sensores

Ca2+

Calcium Green

pH

BCECF
Proteínas marcados con fluoróforos
compatibles pueden reportar
cambios conformacionales

www.olympusmicro.com
 “Quantum dots” – fluoróforos
inorgánicos

Cristales semiconductores de dimension nanométrica,

clásicamente con composición de un centro de CdSe envuelta en
una cápsula de ZnS y una capa externa polimérico

La supercicie se funcionaliza uniendo anticuerpos, péptidos,

lípidos etc
Las longitudes de emisión dependen del tamaño del nanocristal:
mientras más grande, el espectro recorre hacía el rojo.

Los QDs contienen desde 100 hasta 100,000 átomos y tienen un

diámetro de ~ 10 a 50 átomos equivalente a 2 a 10 nanómetros,
hasta 15nm con sus grupos funcionales, el tamaño de una
proteína grande
Sus picos de emisión son simétricos y estrechos, y por la relación
tamaño-longitud, es fácil generar uno con las características
exactas de espectro deseadas

Altamente resistente al fotoblanqueo, con coefficientes de

absorción grandes

Químicamente estables

Emisión discontinua (alta taza de parpadeo)

Toxicidad por contener cadmio o otros metales pesados

Biocompatibilidad celular – permeabilidad de membranas y

secuestro en organelos
 “Quantum dots” 650nm
Franziska Curdt, LNMA

• Nuevas materiales libres de metales pesados

• Nuevas formulaciones con tazas de parpadeo reducidas

• Capas poliméricas más delgadas (20 -> 9nm)

Nature Communications 5,Article number: 3796

BMC Biotechnology 2007, 7:67

 Los vicios de ayer son las virtudes
de hoy…
Nuevos paradigmas en microscopía han cambiado nuestra visión sobre lo que
constituye un “buen fluoróforo”

Microscopía de súper-resolución
Haydee Hernández, Adan Guerrero,
LNMA, datos no publicados
 Ensayo bi-color
Análisis 3B

Verde: p52 -YFP

Rojo: Histone H2av-RFP

Mandy Juarez, Mario Zurita, Adán Guerrero, unpublished

En ciertas implementaciones, la súper-resolución se
genera a través del análisis estadístico de la emisión
discontinua de fluoróforos adyacentes, para
determinar la posición del fluoróforo con mayor
precisión (mayor resolución espacial)

¡VIVA EL PARPADEO!
Fluoróforos para microscopía
multifotónica

Parece que los espectros de absorpción en modalidad de dos

fotones deben estar alrededor del doble de λ
En realidad tienden ser espectros más anchos y
corridos hacía el azul
 Two-photon cross section (GM)
• Por lo general empleamos los mismos fluoróforos para
estudios en 2 fotón que en 1 fotón.

• Estos fluoróforos tiene valores de GM en el rango de 1

a 10 hasta 100.

• Fluoróforos desarrollados y optimizados

específicamente para uso en estudios de multifotón
desde hace 20 años

• Tienden tener sistemas conjugados grandes, y los

valores de GM alcanzan hasta dos órdenes de magnitud
mayor
Algunos ejemplos
200 m2 purpose-built facility with 6 dark rooms
 Microscopes & Imaging
Equipment
• 3 confocal microscopes (2 equipped for multiphoton
excitation)
• Spinning disk confocal microscope (with FLIM module)
• Total Internal Reflection Microscope (TIRF)
• Macroscope
• Bioluminescence microscope
• Imaging citometer (flow microscope)
• Bioimager (whole-organism)
• 2 Epifluorescence microscopes
 Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada
www.lnma.unam.mx
www.facebook.com/lnma.mexico

• Oportunidades de ser anfitrión a estudiantes de posgrado y

investigadores pos-doctorales

• Posgrado de Ciencias Bioquimicas (PNPC – Internacional)

• Ciencias Biomédicas, Ciencias Computacionales, Disciplinas en

Óptica

• Cursos de entrenamiento y capacitación.

• Colaboraciones en proyectos de investigación

 Técnicas disponibles y en desarrollo
• Rastreo de partículas/moléculas individuales
• FRET y Complementación Bimolecular
• Fluorescence Correlation Spectroscopy /FCCS/
Number&Brightness
• Bioluminiscencia
• TIRF
• Macroscopía
• Imagenología in vivo
• Súper-resolución
• FLIM
• Microscopía de flujo
• Análisis de imágenes
 www.lnma.unam.mx

16/10/2015
 Arturo Alberto
Pimentel Darszon

Haydee Hernández Rodrigo Migueles

Franziska Curdt

Xochitl Andrés
Alvarado Saralegui

Aimée Bastidas Maria Cruz

Adán Guerrero Daniel Fuentes
Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada

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LNMA

CONACyT & CIC UNAM

Instituto de Biotecnología,
UNAM
Red Temática en Biofotónica

Fisicos Ópticos Biólogos

Médicos
 Gracias por su atención!

Dr. Rachel O. Wong

and Philip Williams,
Department of
Biological Structure,
www.lnma.unam.mx University of
Washington
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