AGROPECUARIA

Y AGROINDUSTRIAL

MICROSCOPIA Y TINCIONES

Informe de laboratorio

NOMBRE: Paula Aravena/ Tomas Casanova/ Fabiola Muñoz

CARRERA: Ing. Química Industrial
ASIGNATURA: Microbiología
PROFESOR: Ruth Ortega
FECHA: 7/septiembre/2018
 AGROPECUARIA
Y AGROINDUSTRIAL

Introducción

La tinción Gram es el proceso donde las moléculas del colorante se absorben en la superficie del
peptidoglicano que se encuentra en la pared celular de las células de los microorganismos.

El uso de colorante permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar
la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin
algún tratamiento previo. De acuerdo con la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

- Simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

- Diferencial: El colorante utilizado pone en manifiesto diferencias entre células bacterianas
o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tinción.

Los colorantes más usados son: azul de metileno. Cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y
se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso
conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce
generalmente encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las células parezcan
mayores de lo que son realmente.

Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un constituyente celular
y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.
Objetivos Generales:
- Realizar técnicas de tinción bacteriana para el reconocimiento de morfología y agrupación
por medio de microscopia óptica.

Objetivos específicos:
- Realizar las tinciones microbianas: Gram, negativa (capsula) y de esporas.
- Observar las muestras en el microscopio reconociendo la respuesta a la tinción, morfología
y agrupaciones.
- Analizar los resultados de las tinciones de acuerdo con los fundamentos teóricos de cada
una.
 Materiales y metodología
Procedimiento experimental

Materiales

™ Portaobjetos y cubreobjetos.

™ Gotario.

™ Vaso de precipitado.

™ Piseta con agua destilada.

™ Asa loop.

™ Papel tisú.

™ Alcohol isopropílico.

™ Aceite de inmersión.

™ Papel filtro.

™ Tinción de Gram.

™ Tinta china.

™ Verde de malaquita.

Preparación de un Frotis o Extensión

Desde cultivo en medio sólido:

1. En un portaobjetos colocar una gota de agua destilada.

2. Tomar el asa con la mano hábil y quemar en la parte alta de la llama del mechero.

3. Tomar la colonia seleccionada con el asa previamente enfriada.

4. Esparcir la colonia sobre la gota de agua.

 5. Dejar secar al aire.

6. Fijar la muestra pasándola por la llama del mechero 3 a 5 veces.

Desde un cultivo líquido:

1. Tomar el asa con la mano hábil y quemar en la parte alta de la llama del mechero.

2. Con la mano contraria tomar el tubo con cultivo.

3. La misma mano que porta el asa, debe destapar el tubo, con el dedo meñique y nunca
se debe soltar la tapa o tapón de algodón.

4. Pasar la boca del tubo por la llama.

5. Tomar la muestra con el asa previamente enfriada.

6. Esparcir la muestra sobre la gota de agua.

7. Dejar secar al aire.

8. Fijar la muestra pasándola por la llama del mechero 3 a 5 veces.

Protocolo 1: Tinción de Gram

1. Realizar una extensión o frotis de la muestra.

2. Aplicar gotas de cristal violeta y dejar actuar 1 minuto.

3. Lavar suavemente con la piseta de agua destilada.

4. Aplicar Lugol y dejar actuar por 1 minuto.

5. Lavar con alcohol: cetona, dejando escurrir sobre la muestra.

6. Lavar suavemente con la piseta de agua destilada.

7. Aplicar gotas de safranina y dejar actuar 2 minutos.

8. Lavar con agua destilada de la piseta.

9. Secar al aire o por contacto.

10. Poner cubreobjetos y sobre él una gota de aceite de inmersión.

11. Observar con objetivo de inmersión (100X).

Protocolo 2: Tinción Negativa de Cápsula

 1. Poner una gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio.

2. Poner una porción de cultivo con asa loop (sobre la gota de agua).

3. Agregar una gota de tinta china y homogeneizar con asa loop.

4. Dejar secar al aire.

5. Agregar una gota de safranina y poner un cubreobjetos.

6. Remover el exceso con papel secante.

7. Observar en aumento de 40X.

Protocolo 3: Tinción de Esporas

1. Sobre un frotis bacteriano, situar un trozo de papel filtro que no sobresalga del
portaobjetos y tomarlo con pinza de madera.

2. Humedecer totalmente el papel con verde de malaquita.

3. Pasar por la llama del mechero suavemente y hasta que salgan vapores.

4. Ir agregando verde de malaquita, mientras se realiza este proceso por tres minutos.

5. Una vez frío el portaobjetos, sacar el papel filtro y lavar con agua corriente, hasta
remover todo el colorante en exceso.

6. Agregar safranina, esperar 2 minutos.

7. Lavar con agua destilada y secar por contacto o al aire.

8. Poner cubreobjetos y aceite de inmersión.

9. Observar en 100X.
 Resultados
Resultados obtenidos: Los resultados esperados en laboratorio no fueron satisfactorios. Resultados
no registrados.

Resultados esperados:

Se esperaba observar en el presente práctico dos tipos de bacterias patógenas que tengan resultados
diferentes en la tinción Gram con el fin de reconocerlas a través de su resultado y forma.

imagen 1: Staphylococcus aureus: racimos de cocos Gram positivos (coloración morada)

imagen 2: Escherichia coli: bacilos Gram negativo (coloración rosada)

 Discusión

¿Cuáles son los motivos por lo que los resultados obtenidos no fueron satisfactorios?
Algunas de las causas probables mas importantes se observaron en las áreas de la
metodología y el manejo de las técnicas mayormente provocados por error humano.
Especificando en este punto anterior los errores cometidos mas probables identificados
fueron en primera instancia la nula agitación del tubo antes de sacar la muestra,
posteriormente la mala manipulación y secado del portaobjetos, también es importante
incluir la mala limpieza del microscopio junto con la dificultad para enfocar las bacterias.
De todas maneras, de manera bibliográfica podemos afirmar que la muestra de
Staphylococcus aereus presentaría forma de estafilococo y presentaría una coloración
morado intenso indicando Gram positiva, debido a una pared gruesa de peptidoglucano lo
que le permite absorber las moléculas del complejo cristal violeta. En cambio, las bacterias
de Escherichia coli, presentan forma de bacilo y tienen una coloración rosado pálido
indicando Gram negativo por una capa delgada de peptidoglucano que al agregarle el
complejo de cristal violeta este no lo absorbe por lo que al agregar alcohol cetona este barre
el cristal violeta quedando incolora, posteriormente al agregar safranina queda con este
color.
 Conclusión

La tinción Gram es un método utilizado para separar a las bacterias en dos grandes grupos, la Gram
negativas y las Gram positivas.
En el momento que se realiza el laboratorio no se obtuvieron los resultados esperados a errores
humanos como la mala manipulación de los instrumentos y el uso del microscopio.
 Bibliografía

- José amaro Suazo. (2018). Morfología y estructura bacteriana [E-book]

- Brock. (2003). Biología de los microorganismos. University Carbondale: Pearson