Química Biológica I - 2013

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

Y NATURALES Y AGRIMENSURA

QUIMICA BIOLÓGICA I

Guías de Trabajos Prácticos de Laboratorio

Alumno:

Carrera:

∼ Año 2013 ∼

029
QUIMICA BIOLOGICA I

Docentes

Dra. Laura C. Leiva de Vila

Profesora Titular

Dra. Soledad Bustillo

Jefe de Trabajos Prácticos

Dra. Claudia Carolina Gay

Bioq. Silvina Echeverría
Bioq. Gabriela Gómez
Auxiliares Docentes de Primera

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 Química Biológica I - 2013

REGLAMENTO GENERAL PARA EL CURSADO DE LOS

TRABAJOS PRACTICOS DE LABORATORIO

Para el desarrollo y aprobación de los Trabajos Prácticos de Laboratorio se deben tener en

cuenta las siguientes pautas:

1. ASISTENCIA. Los TP de laboratorio se dictarán en siete (7) clases prácticas de cuatro (4)
horas de duración cada una (8.00 a 12.00 h) los días miércoles o jueves según distribución de
grupos. Se podrá tener como máximo dos (2) inasistencias o desaprobados durante el
cursado, SIN EXCEPCIÓN. Los TP no desarrollados por inasistencia o desaprobado se
recuperarán al final del cursado.

2. PUNTUALIDAD. El ingreso al Laboratorio es a las 8.00 h para rendir el coloquio. Una vez
que se haya entregado el primer coloquio resuelto, ya no se admitirá el ingreso de ningún
alumno SIN EXCEPCIÓN, deberá retirarse y recuperar el TP. Asimismo el horario de
salida es a las 12.00 h y deberá ser respetado del mismo modo que el horario de inicio.

3. EVALUACIÓN. La evaluación se inicia con un coloquio referido al tema a desarrollar. En

caso de desaprobar, deberá retirarse del Laboratorio y recuperar el TP al final del cursado.
No obstante, se continuará evaluando durante todo el trabajo práctico. Es decir, los docentes
podrán preguntar a los alumnos qué están realizando (él o sus compañeros de comisión) y
los fundamentos correspondientes en cualquier momento de la clase. Si no saben responder,
serán automáticamente desaprobados aunque hayan aprobado inicialmente el coloquio.

4. COMISIONES. Los alumnos se agruparán en comisiones de 3 a 4 integrantes. En cada TP

se elegirá un “Responsable” por comisión para entregar el Informe correspondiente. El
mismo se corregirá en el día y servirá de “Modelo” para el resto de los integrantes de la
comisión que entregarán sus respectivos informes la clase siguiente. Se debe tener en cuenta
que no se admitirán errores ya corregidos previamente al Responsable, en los informes
entregados por el resto de la comisión. Si esto ocurriera, tendrá desaprobado el TP. Es
importante aclarar que si bien se elige un Responsable, toda la comisión debe trabajar y
desarrollar el informe hasta el final de la clase. No podrá haber alumnos ociosos.

5. INFORME. Esta guía cuenta con los respectivos informes para cada TP para que se
vuelquen los resultados, cálculos, gráficos, observaciones, discusión y conclusiones.
Respetar los espacios para cada sección. Tener en cuenta que en “Resultados” se colocan los
valores obtenidos de cada ensayo en las tablas o espacios correspondientes. Se deberá
indicar un solo ejemplo de cálculo si correspondiera. En “Observaciones” se indicará lo que
se apreció visualmente y detalles técnicos que se quieran consignar. Los “Gráficos” deberán
realizarse correctamente en papel milimetrado y no deberán entregarse sueltos, sino pegados
o abrochados. En “Discusión” se analizarán los resultados obtenidos (ej. La reacción de
Benedict fue positiva en la muestra…..). En “Conclusión” ya no se detallan ni se discuten los
resultados, sino que se consigna lo comprobado en el TP de laboratorio (ej. La reacción de
Benedict es un buen método cualitativo para determinar hidratos de carbono reductores en
una muestra”).

6. LIMPIEZA. Se asignará una “Comisión de Limpieza” por TP de laboratorio. La función de

esta comisión es unicamente controlar que cada comisión haya lavado el material que utilizó.
Solamente se hará cargo de la limpieza/lavado del material común a todo el TP.

He leído y acepto los términos y condiciones para el desarrollo de los Trabajos Prácticos de
Laboratorio de Química Biológica I – Química Bioorgánica

---------------------------------------------------
Firma del alumno

-------------------------
Aclaración

-------------------------
L.U.
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

Primera Parte: DETERMINACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

OBJETIVOS:

1. Detectar azúcares reductores mediante el Reactivo de Benedict.

2. Determinar cuantitativamente azúcares reductores por el método de Somogyi-Nelson.

DETECCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE EL REACTIVO DE BENEDICT

El trabajo práctico consistirá en la detección de azúcares reductores en distintas muestras: solución

de sacarosa 1%, solución de glucosa 1%, solución de almidón 0,5%, suero sanguíneo humano; las
cuales se enfrentarán al Reactivo de Benedict. Se realizará también una quinta prueba con una
solución previamente hidrolizada en medio ácido.
Por ser un ensayo cualitativo se informará el cambio de color observado, considerándose positivo la
aparición de un precipitado rojo.

REACTIVOS

Reactivo de Benedict: Disolver en 100 ml de agua caliente 17,3 g de CuSO4.5H2O. Disolver aparte
en 800 ml de agua 173 g de citrato de sodio y 100 g de Na2CO3. Esta última solución se agrega
sobre la primera. Completar a 1 litro con agua.

MUESTRAS

 M1: Glucosa 1%
 M2: Sacarosa 1%
 M3: Almidón 0,5%
 M4: Suero sanguíneo humano
 M5: Sacarosa hidrolizada en medio ácido

TÉCNICA OPERATORIA

1. Hidrólisis ácida (M5): A 2,5 ml de la solución de sacarosa 1% agregar 0,5 ml de HCl 1N.
Llevar 10 minutos a baño maría, dejar enfriar y luego añadir 0,5 ml de NaOH 1 N.

2. Protocolo de Trabajo:

M1 M2 M3 M4 M5
Volumen de
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
muestra
Reactivo de
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Benedict
Baño maría 3 minutos. Retirar
OBSERVAR COLORACIÓN

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CUANTIFICACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO REDUCTORES

EMPLEANDO EL MÉTODO DE SOMOGYI – NELSON

El trabajo práctico consiste en realizar una curva de calibración y la determinación de la

concentración de un monosacárido reductor en una muestra.

REACTIVOS

-Reactivo de Somogyi: 28 g de Na2HPO4 anhidro (disolver Na2HPO4 en 700 ml de H2O), 40 g de

tartrato de Na y K, 100 ml NaOH 1 N, 8 g de CuSO4.5H2O (previamente disuelto em 80 ml de H2O),
180 g de Na2SO4 anhidro. Llevar a un litro.
Nota: - Mantener en agitación constante durante la preparación
- Agregar según el orden indicado
- Dejar estacionar el reactivo 1 o 2 días antes de utilizar
- Filtrar la solución antes de utilizar
- Conservar a 25-37 º C en frasco color caramelo

-Reactivo de Nelson: 50 g de molibdato de amonio anhidro, 900 ml de H2O, 42 ml de H2SO4

concentrado, 6 g de Na2HAsO4.7H2O (previamente disuelto em 50 ml de H2O). Llevar a un litro.
Nota: - Mantener en agitación durante la preparación
- Estacionar 24 hs a 37º C
- Guardar en frasco color caramelo

-Testigo: Solución de glucosa 0.5 mM.

-Muestra (M1): Solución de concentración incógnita de glucosa.

TÉCNICA OPERATORIA

Se realizará mediante el siguiente protocolo de trabajo:

Curva de Calibración
M1 B1 Test. 1 Test. 2 Test. 3 Test. 4 Test. 5
Testigo o
Muestra 1 - 1 0,7 0,5 0,3 0,2
(ml)
H2O (ml) - 1 - 0,3 0,5 0,7 0,8
Rvo.
0,75 ml
Somogyi
Calentar 10 minutos a 100º C. Enfriar
Rvo.
0,75 ml
Nelson
H2O dest. 2,50 ml
LEER ASBSORBANCIA A 530 nm

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INFORME - Trabajo Práctico Nº 1

Primera Parte: DETERMINACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

DETECCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Suero Sacarosa
MUESTRA Glucosa 1% Sacarosa 1% Almidón 1%
humano hidrolizada
COLOR
RESULTADO
(+, - o indet)

Observaciones y Discusión

CONCLUSIONES

CUANTIFICACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO REDUCTORES

Curva de Calibración
M1 B1 Test. 1 Test. 2 Test. 3 Test. 4 Test. 5
Abs Muestra
Abs Muestra ó
Test– Abs B
C (mM)

Cálculos (un ej de cálculo):

Concentración de la Muestra incógnita (M1):

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Observaciones y Discusión

Conclusiones

Anexar gráfico

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TRABAJO PRACTICO Nº 1

Segunda Parte: SEPARACIÓN DE ALMIDÓN Y GLUCOSA

OBJETIVO

Separación de almidón y glucosa por técnicas cromatográficas de filtración por gel.

FUNDAMENTO

La filtración por gel se basa en la separación de compuestos según el tamaño molecular y se

fundamenta en que las partículas de menor tamaño quedan retenidas en los poros del gel mientras
que las de tamaño mayor son excluidas y avanzan más rápidamente con el solvente.

MATERIALES
 Glucosa 1%
 Almidón 0,5%
 Sephadex G25 fino
 Columna: 9 cm de largo, 0,63 cm de diámetro
 Volumen de siembra: 0,5 ml
 Eluyente: buffer fosfato 50 mM pH 8
 Número de fracciones: 10 de 0,5 ml cada una

TÉCNICA OPERATORIA

1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la siembra.

2. Preparar la solución a sembrar mezclando 1 ml de glucosa 1% y 1 ml de almidón 0,5%,

obteniéndose así concentraciones de 0,5 % y 0,25 % respectivamente. De ésta solución se tomarán
0,5 ml para sembrar en la columna.

3. Desde el momento de la siembra se recogerán 10 fracciones de 0,5 ml c/u, aproximadamente, en

tubos de ensayo numerados.

4. Pruebas cualitativas:

 Almidón: Se colocará en cubetas pequeñas, en primer lugar una gota de Lugol seguido de
una gota del eluido. Reacción positiva: color azul pardo. Ver gráfico 1).
 Glucosa: A lo que resta del eluido en el tubo de ensayos se le agrega 0,5 ml del Reactivo de
Benedict. Calentar el tubo a baño maría aproximadamente 10 minutos. Reacción positiva:
precipitado rojo-naranja. Ver gráfico 2)
Estas pruebas cualitativas se realizarán para cada una de las 10 fracciones recogidas.
1 gota
de eluido

1) 1 gota 2) 0.5 ml de Rvo de

de Lugol Benedict

Baño María

Fracción recogida/
Eluido Resto de eluido

NOTA: La columna no debe secarse en ningún momento, para ello debe agregarse el buffer
constantemente.

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INFORME - Trabajo Practico Nº 1

Segunda Parte: SEPARACIÓN DE ALMIDÓN Y GLUCOSA

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

RESULTADOS

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Glucosa
Almidón

*Los resultados cualitativos se indicarán con signos “+” ó “–“. La intensidad de una reacción
positiva se indicará colocando 1, 2 ó 3 signos “+”.

Observaciones y Discusión

Conclusiones

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
LIPIDOS: ACCIÓN HEMOLÍTICA DE LISOFOSFOLÍPIDOS
OBJETIVO: - Comprobar la acción hemolítica de los lisofosfolípidos
FUNDAMENTO:
Los lípidos complejos que participan en la constitución de membranas celulares están en
permanente recambio. El proceso de degradación es cumplido por enzimas específicas que
catalizan la hidrólisis de las uniones entre los componentes de la molécula.
Los glicerofosfolípidos requieren un conjunto de enzimas para su total degradación. La
fosfolipasa A2 cataliza la hidrólisis de la unión éster del ácido graso en posición 2, con lo cual se
forman un lisofosfolípido y un ácido graso libre, generalmente insaturado. Otras fosfolipasas,
A1, C y D, son responsables del clivaje de otros enlaces éster de la molécula del
glicerofosfolípido.
Las fosfolipasas A2 (PLA2), están ampliamente distribuídas, habiéndose encontrado en casi
todos los tipos celulares. Las más estudiadas son las de origen pancreático y las presentes en
venenos de serpientes.
En este trabajo práctico se estudiará la acción de la PLA2 presente en veneno de yarará grande
(Bothrops alternatus) sobre fosfolípidos presentes en yema de huevo (rica especialmente en
lecitinas), se comprobará su acción hemolítica “indirecta”, cuando se enfrentan estas enzimas a
una suspensión de GR y yema de huevo, donde los lisofosfolípidos generados de su acción son
capaces de lisar los hematíes por su acción detergente.

MATERIALES:

 Veneno de Bothrops alternatus

 Yema de huevo
 Solución fisiológica
 Glóbulos rojos

PREPARACIÓN DE REACTIVOS:

 Solución de Veneno de B. alternatus: se pesan 10 mg de veneno y se disuelven en 10 ml de

solución fisiológica (concentración final: 1mg/ml) *
 Solución de yema: se disuelven 4 ml de yema de huevo en 12 ml de solución fisiológica
(NaCl 0.15 M)
 Solución de glóbulos rojos: Lavado de los glóbulos rojos: a 2 ml de sangre anticoagulada
con citrato 3.8%, se le agregan 5 ml de solución fisiológica. Se homogeniza en forma suave
y luego se centrífuga durante 5 minutos. Repetir este procedimiento 3 veces. Al pellet de
glóbulos rojos obtenido de la última centrifugación se lo resuspende con 4 ml de solución
fisiológica.
: manipular con guantes, usar barbijo.
* Soluciones a preparar para uso de todas las comisiones.

ACCIÓN HEMOLÍTICA DE LISOFOSFOLÍPIDOS

Preparar 3 tubos de centrífuga y en ellos colocar:

1. Tubo 1: 2.8 ml de la solución de yema + 0.2 ml de solución de veneno + 1 ml de la

suspensión de glóbulos rojos.
2. Tubo 2: 2.8 ml de la solución de yema + 0.2 ml de solución fisiológica + 1 ml de la
suspensión de glóbulos rojos.
3. Tubo 3: 2.8 ml de solución fisiológica + 0.2 ml de solución de veneno + 1 ml de la
suspensión de glóbulos rojos.
4. Homogeneizar e incubar los tres tubos durante 45 minutos a 30ºC.
5. Centrifugar durante 5 minutos y observar el sobrenadante.

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INFORME - TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

LÍPIDOS: ACCIÓN HEMOLÍTICA DE LISOFOSFOLÍPIDOS

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3

Esquema

(indique lo que
observa luego del
centrifugado,
sobrenadante y pellet)

¿Qué ocurrió en el
tubo?

¿Qué se comprueba
en este tubo?

CONCLUSION GENERAL:

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 3

CUANTIFICACION DE PROTEINAS

OBJETIVOS:

1. Comparar diferentes métodos utilizados en el dosaje de proteínas: Biuret, UV

y Coomassie Blue.
2. Determinar cuantitativamente proteínas en suero y en una muestra incógnita.

El trabajo práctico consistirá en realizar curvas de calibración de los distintos métodos a evaluar y
determinar la concentración de proteínas en suero y en una muestra incógnita.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE BIURET

Fundamento: Se basa en que las proteínas dan la reacción de Biuret. El Biuret es un compuesto que
se forma cuando se calienta la urea a 180 ºC, el cual en presencia de Cu++ en solución alcalina forma
un complejo de color violeta.
Se requieren al menos dos enlaces peptídicos para dar positiva esta reacción. El máximo de
absorción del complejo proteína-Biuret se produce a 545 nm, cuando se lee la absorbancia frente a
un blanco constituido por el reactivo Biuret.
MATERIALES:

 Solución testigo: albúmina 5 mg/ml

 Solución fisiológica
 Suero (S) (ver dilución correspondiente al método)
 Muestra incógnita (M)
 Reactivo de Biuret:
- Solución A:
Tartrato de sodio y potasio.4 H2O (quelante) 18,06 g
CuSO4.5H2O 6,00 g
KI (estabilizante) 2,00 g
NaOH 2 N 40 ml
Agua destilada 200 ml
- Solución B:
10 g de KI en 160 ml de NaOH 2 N.
- Solución C: (preparada en el momento por la cátedra)
Sol. A 10 ml
Sol. B 8 ml
Agua destilada 100 ml
Sensibilidad: 1 mg/ml de solución de proteína.
TÉCNICA OPERATORIA: Protocolo (curva de calibración)
TUBO B 1 2 3 4 5 6 S M
Testigo (ml) - 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 - -
S. fisiol. (ml) 5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 - - -
Muestra (ml) - - - - - - - 1 1
transferir 1 ml de cada una de las soluciones a tubos
- -
limpios
NAOH 2N 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Rvo. C de
2 2 2 2 2 2 2 2 2
Biuret (ml)
H2O (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Agitar, esperar 30 min. a T amb. Leer Abs. a 545 nm, antes de 1h.
Abs 545
Abs - AbsB
C (mg/ml)
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CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS POR UV

Fundamento: La presencia de aminoácidos aromáticos en las proteínas da como resultado que éstas
tengan un máximo de absorción a 280 nm; la comparación de los valores de absorción a esta
longitud de onda de la muestra frente a la de un estándar proporciona un método sensible de
cuantificación.

MATERIALES:

 Solución testigo: albúmina 1 mg/ml

 Solución fisiológica
 Suero (S) (ver dilución correspondiente al método)
 Muestra incógnita (M)

Sensibilidad: 10-100 µg/ml de solución de proteína.

TÉCNICA OPERATORIA: Protocolo (curva de calibración)

TUBO B 1 2 3 4 5 6 S M
Testigo (ml) - 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 - -
S. fisiol. (ml) 5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 - - -
Muestra (ml) - - - - - - - 1 1
Leer directamente Abs. a 280 nm
Abs 280
Abs - AbsB
C (mg/ml)

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS POR COOMASSIE BLUE

Fundamento: este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de
proteínas. Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una
proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína
estándar. El complejo colorante-proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm.
Solución de Azul Brillante de Coomassie: 600 mg de Azul brillante de Coomassie G-250 se
disuelven en 1 l de ácido perclórico 2%. Filtrar con papel de filtro. Esta solución es estable
indefinidamente.

MATERIALES:

 Solución testigo: albúmina 0.02 mg/ml

 Solución fisiológica
 Suero (S) (ver dilución correspondiente al método)
 Muestra incógnita (M)
 Reactivo de Coomassie Blue

Sensibilidad: 1-10 µg/ml de solución de proteína.

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 Química Biológica I - 2013

TÉCNICA OPERATORIA: Protocolo (curva de calibración)

B
TUBO 1 2 3 4 5 6 S M
Testigo (ml) - 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 - -
S. fisiol.
5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 - - -
(ml)
transferir 1.5 ml de cada una de las soluciones a tubos limpios - -
Muestra
- - - - - - - 1.5 1.5
(ml)
Rvo.
Coomassie
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Blue (ml)
Agitar, esperar 2 minutos. Leer Abs a 595 nm antes de 1 hora
Abs 595
Abs - AbsB
C (mg/ml)

CALCULOS Y RESULTADOS:

Incluirlos en las tablas correspondientes.

GRAFICOS:

- Graficar curvas de calibración en gráficas independientes:

1. Absorbancia Método de Biuret vs C (mg/ml) de proteína. Indicar el factor correspondiente.
2. Absorbancia 280 vs C (mg/ml) de proteína. Indicar el factor correspondiente.
3. Absorbancia Método Coomassie Blue vs C (mg/ml) de proteína.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION PROTEICA DE SUERO Y MUESTRA

INCOGNITA

Para cada método de dosaje utilizar muestra incógnita sin diluir y muestra de suero diluida tal como
se indica en la siguiente tabla:

Método Diluciones de suero Muestra incógnita

Biuret 1/20 Sin diluir
UV 1/200 Sin diluir
Coomassie Blue 1/20000 Sin diluir

A partir de la absorbancia leída por cada método y utilizando la curva de calibración

correspondiente, calcular la concentración de proteínas en suero y en muestra incógnita y volcar los
resultados en la tabla provista en la sección “INFORME”.

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 Química Biológica I - 2013

INFORME - TRABAJO PRACTICO Nº 3

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

CURVAS DE CALIBRACIÓN: (pegar los gráficos correspondientes en el reverso de la hoja)

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN SUERO Y EN UNA MUESTRA INCÓGNITA:

Cálculos y resultados:

Método Suero (mg/ml) Muestra incógnita (mg/ml)

Biuret
UV
Coomassie Blue

-Concentración verdadera de la Muestra incógnita: _____________(valor que dará el docente al

finalizar la clase de laboratorio)
-Concentración normal de proteínas totales en suero: 60– 80 mg/ml

Observaciones y Discusión:

CONCLUSIONES:

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO

OBJETIVOS: - Separar albúmina y glucosa por técnicas de cromatografía en columna:

filtración por gel e intercambio iónico.
- Comparar ambas técnicas.

A) Separación de albúmina y glucosa por cromatografía de filtración por gel

Fundamentos:
La filtración en gel es un método de cromatografía líquida conocido también como
cromatografía de exclusión molecular. La estructura del gel contiene poros de diámetro variable
hasta un tamaño máximo. Las moléculas de la muestra pasan a través de la columna, de tal modo
que las que son más grandes que los poros se excluyen de las partículas del gel. Las moléculas más
pequeñas, sin embargo, penetran en el gel en una extensión variable según su tamaño, retardando así
su paso a través de la columna. La elución, por tanto va en orden decreciente de tamaños.
Existen en el mercado una gran variedad de medios utilizables para la filtración en gel, se
clasifican generalmente según su límite de exclusión, que es el peso molecular por encima del cual
todas las moléculas se excluyen de la estructura del gel. El Sephadex, es el medio utilizado
originalmente, se compone de dextrano (un polímero lineal de glucosa) que se modifica para
obtener distintos grados de entrecruzamiento, lo que determina el tamaño del poro del material. Es
un polímero fuertemente hidrofíIico que se hincha considerablemente en agua: por lo tanto, antes de
que se prepare la columna, el gel debe hidratarse completamente.

Materiales:

 Solución de volúmenes iguales de Albúmina 0.5 % y Glucosa 2%. (1ml + 1ml)

 Sephadex G25 fino
 Columna: 9 cm de largo, 0,63 cm de diámetro
 Volumen de siembra: 0,5 ml
 Eluyente: buffer fosfato 50 mM pH=7
 Número de fracciones: 10, 0,5 ml c/u

TÉCNICA OPERATORIA:
1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la
siembra.
2. De la solución de albúmina y glucosa se tomarán 0,5 ml para sembrar en la columna.
3. Desde el momento de la siembra se recogerán 10 fracciones de 0,5 ml c/u aproximadamente
en tubos de ensayo numerados.
4. Pruebas Cualitativas:

 Albúmina: Se colocará en cubetas pequeñas, en primer lugar una gota de Azul

brillante de Coomassie seguido de una gota del eluido. Reacción positiva: color
azul.
 Glucosa: A lo que resta del eluido en el tubo de ensayos se le agrega 0.5 ml de
Reactivo de Benedict. Calentar el tubo a baño maría aproximadamente 10’.
Reacción positiva: precipitado rojo-naranja.
Estas pruebas cualitativas se realizarán para c/u de las 10 fracciones recogidas.

NOTA: La columna no debe secarse en ningún momento, para ello debe agregarse el buffer
constantemente.

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 Química Biológica I - 2013

B) Separación de albúmina y glucosa por cromatografía de intercambio iónico

Fundamentos:
El intercambio iónico es un intercambio reversible y estequiométrico de iones entre una fase
sólida iónica y una fase líquida externa, sin cambio sustancial en la estructura del sólido.
Las fases sólidas usadas son por lo general resinas o redes tridimensionales de cadenas
poliméricas entrecruzadas con cortas cadenas que contienen grupos funcionales ionizados
(intercambiadores). Así existe una fase insoluble pero permeable, que contiene grupos iónicos
fijados a su estructura, mientras que especies de cargas opuestas están libres para moverse dentro
del líquido externo y ser reemplazadas por otros iones de igual carga, manteniendo la
electroneutralidad. Estas especies que se sustituyen son llamadas contraiones.
Los intercambiadores se denominan aniónicos o catiónicos según tengan afinidad por iones
negativos o positivos respectivamente. La DEAE celulosa pertenece al primer grupo, posee grupos
dietil-aminoetil.
Las separaciones en los intercambiadores iónicos se efectúan generalmente por variaciones de la
fuerza iónica o pH del eluyente o ambas cosas a la vez.

Materiales:

 Jeringa de 5ml con DEAE-celulosa de 1 x 5 cm con previamente equilibrada con buffer

fosfato 50 mM (pH=7).
 Buffer fosfato 50 mM (pH=7), NaCl 500 mM
 Reactivo de Benedict para determinar azúcares reductores.
 Reactivo Coomassie Blue para determinar proteínas.
 Solución de Albúmina 0.5% y glucosa 2% en buffer fosfato 50 mM (pH=7.5).

TÉCNICA OPERATORIA:
1. Armar la columna cromatográfica, lavar la misma con 5 ml de buffer fosfato antes de la
siembra.
2. Sembrar 0,2 ml de la solución de trabajo en la columna. Recolectar 1.5 ml de eluido en cada
tubo de ensayo. Agregar 10 ml de buffer fosfato 50 mM PH=7. Luego, agregar 10 ml de buffer
fosfato 50 mM pH=7, NaCl 500 mM. Anotar en que tubo se realizó el cambio de buffer.
Mantener continuamente en la jeringa un nivel de buffer de 0.5 cm por encima de la columna
de DEAE-celulosa.
3. Pruebas Cualitativas:
 Albúmina: Se colocará en cubetas pequeñas, en primer lugar una gota de Azul
brillante de Coomassie seguido de una gota del eluido. Reacción positiva: color
azul.
 Glucosa: Agregar al resto de eluído 1 ml de Reactivo de Benedict. Calentar el tubo
a baño maría aproximadamente 10’. Reacción positiva: precipitado rojo-naranja.
Reacción positiva: precipitado rojo-naranja.

NOTA: El trabajo práctico finaliza desarmando la columna con DEAE-celulosa. Regenerar la resina
usada agregando volúmenes iguales de NaOH 1 N y HCl 1 N, en ese orden. Luego lavar la misma
con agua (tres veces).

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INFORME-TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

A) Separación de Albúmina y Glucosa por Cromatografía de Filtración por gel

RESULTADOS:

Tubo Albúmina Glucosa

Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Anotar los resultados cualitativos en la tabla.

-- precipitado: no visible / sin color, + poco, ++ intermedio, +++ gran cantidad

B) Separación de Albúmina y Glucosa por Cromatografía de Intercambio Iónico

RESULTADOS:

Tubo Albúmina Glucosa

Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Anotar los resultados cualitativos en la tabla. Indicar el tubo en el que se realiza el cambio de
buffer.
-- precipitado: no visible / sin color, + poco, ++ intermedio, +++ gran cantidad

Observaciones y Discusión

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 Química Biológica I - 2013

CONCLUSIONES:

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 Química Biológica I - 2013

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
OBTENCIÓN DE ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO (ADN) BACTERIANO

OBJETIVO:

1. Extraer ADN a partir de una cepa bacteriana ATCC

2. Analizar los resultados de la extracción por electroforesis en gel de agarosa

Fundamentos:

La extracción del ADN celular es una etapa clave en muchos procedimientos de biología molecular
y aplicaciones de ingeniería genética. El método varía dependiendo de la célula o tejido desde donde
se necesita extraer el ADN, sin embargo, cualquier protocolo tiene las siguientes etapas básicas.
Primero las células deben ser lisadas (rotas) para liberar el núcleo (si
está presente). El núcleo también debe ser roto para liberar el ADN, en este punto debe ser
protegido de enzimas que podrían degradarlo (nucleasas). Una vez que el ADN es liberado, debe ser
precipitado con alcohol (etanol) para purificarlo y concentrarlo. Dependiendo de las
aplicaciones posteriores, puede ser necesario someter el ADN a etapas de purificación adicionales.
Usualmente el ADN extraído se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa y/o
espectrometría UV.

Materiales:

√ Cepa bacteriana ATCC en fase logarítmica de crecimiento

√ Buffer de lisis: Tritón 1% Tris HCl-EDTA (pH 8.0)
√ Agua bidestilada estéril
√ Agarosa
√ Buffer Tris borato EDTA 0,5 – 1 x (TBE)
√ Etanol 96% y etanol 70%

TÉCNICA OPERATORIA:

1. Tomar una ansada de colonias de la cepa bacteriana y resuspender en 100 μl de Tritón 1% en

buffer Tris HCl-EDTA (pH 8.0).
2. Incubar 15 minutos en baño de agua a 100ºC.
3. Centrifugar a 10.000 rpm/min y separar el sobrenadante
4. Agregar al sobrenadante 100 μl de etanol 96% en frío para precipitar el ADN.
5. Centrifugar a 10.000 rpm/min y descartar el sobrenadante.
6. Agregar al pellet 100 μl de etanol 70% frío, resuspender.
7. Centrifugar a 10.000 rpm/min y descartar el sobrenadante.
8. Dejar secar los restos de alcohol y resuspender el ADN en 20 μl de H2O destilada estéril.
9. Preparar un gel de agarosa al 2 % con el agregado de 1 µL de Bromuro de etidio (10 mg/mL)
Este procedimiento se realizará con la ayuda del personal docente de la cátedra debido
a los riesgos de contaminación.
10. Realizar la corrida electroforética en buffer TBE 0.5x utilizando una de las calles de corrida
para el Marcador de peso molecular (MPM) y el resto para las muestras de ADN.
11. Sembrar 10 µL de MPM/muestra de ADN
12. Correr 30 minutos a 100 V y observar en transiluminador UV.

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 Química Biológica I - 2013

INFORME-TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
OBTENCIÓN DE ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO (ADN) BACTERIANO

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

Observaciones en el gel

Banda Longitud Estimada (pb):

Complete el esquema del gel de agarosa:

MPM Muestra

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 Química Biológica I - 2013

TRABAJO PRÁCTICO Nº 6

ENZIMAS – Parte I
OBJETIVO GENERAL: Estudiar el comportamiento cinético de la enzima ureasa contenida en un
extracto crudo obtenido a partir de harina de soja.
Objetivos Parte I:
- Determinar KM y VM para la enzima ureasa en buffer fosfato de pH 7.
- Comprobar el uso de la ureasa en determinación de urea en muestras biológicas
(suero humano).

INTRODUCCIÓN:
La ureasa cataliza la hidrólisis específica de la urea:

CO(NH2)2 + 2 H2O =======> 2 NH4+ + CO2

La ureasa existe en muchas bacterias, varias especies de levaduras y en grandes plantas. Dos de las
mejores fuentes son: porotos (Canavlia ensiformis) del cual ha sido cristalizada y minuciosamente
estudiada, y Bacillus pasteurii. En este estudio se trabajará con ureasa presente en harina de la soja
(Glycine max).

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se utilizará método discontinuo.

FUNDAMENTO
La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco; éste
reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol , que se
determina colorimétricamente.
ureasa
CO(NH2)2 + 2 H2O =======> 2 NH4+ + CO2

OH-
NH3 + fenol + NaClO =======> azul de indofenol

1) PREPARACION del EXTRACTO CRUDO

• Suspender agitando enérgicamente, 500 mg de harina de soja en 5mI de buffer Pi (l0mM, PH=7).
• Centrifugar 3000 rpm 10’
• Trasvasar 0,25 ml del sobrenadante a un tubo de ensayo y agregar 9,75ml de buffer, (dilución 1/40
de ureasa, volumen total: 10ml).

2) CURVA DE CALIBRACIÓN

Realizar una curva de calibración para NH4 + según el protocolo presentado, con el objeto de
expresar los resultados de actividad enzimática en unidades internacionales.

Reactivos

1. NH4Cl 20 mM
2. Reactivo 1: fenol 10 ml
nitroprusiato de sodio 50 mg
H2O c.s.p. 200 ml
3. Reactivo 2: NaOH (10 N) 14 ml
Hipoclorito de sodio comercial 10 ml
H2O c.s.p. 200 ml
4. Buffer Pi (l0mM, PH=7)

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Blanco 1 2 3 4 5
VNH4 Cl (ml) - 0.5 1 1.5 2 2.5
V agua (ml) 10 9.5 9 8.5 8 7.5
Cf (mM) - 1 2 3 4 5

• De cada tubo tomar una alícuota de 0.25 ml

• Agregar 0.5 ml del R1 y 0.5 ml del R2
• Incubar a 37º C durante 5’
• Agregar 7.5 ml de H2Od
• Leer absorbancia a 530nm
• Graficar Absorbancia vs. Concentración de NH4Cl – Calcular el coeficiente de absortividad

3) DETERMINACIÓN DE KM y VM
Para estudiar la variación de la velocidad en función de la concentración de sustrato, trabajar con 1
ml de ureasa 1/40, fijar el tiempo de incubación en 10 minutos, variar la concentración de sustrato
(6 puntos) utilizando Vf = 5ml y como sustrato una Solución de urea 6.10‫־‬² M.
Trabajar según el protocolo, respetando el orden de agregado de buffer, ureasa y urea.

Tubo
B1 1 2 3 4 5 6
buffer (ml)
1 3.8 3.6 3 2 1 -

ureasa (ml) - 1 1 1 1 1 1

Preincubar durante 5 minutos a 37º C

Sn. urea (ml) 4 0.2 0.4 1 2 3 4

• Inmediatamente incubar 5 minutos a 37º C.

• De cada tubo tomar una alícuota de 0.25 ml
• Agregar sobre tubos preparados con 0.5 ml del R1 a fin de cortar la reacción enzimática.
• Agregar 0.5 ml del R2
• Incubar a 37º C durante 5’
• Agregar 7.5 ml de H2Od
• Leer absorbancia a 530nm

4) USO DE LA UREASA EN ANÁLISIS DE UREA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos
biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. En general una
elevación de la concentración sérica de urea se interpreta como una posible disfunción renal.

En este trabajo utilizamos la actividad catalítica de la ureasa para cuantificar la urea en la muestra
de suero.
Valores de referencia: (0,20 - 0,40) g/l

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 Química Biológica I - 2013

Técnica operatoria:

B T suero
Agua destilada 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Suero - - 20 µl
Testigo urea (0.6 g/l) - 20 µl -
Ureasa (extracto 1 gota 1 gota 1 gota
crudo)

• Mezclar suavemente e inmediatamente incubar 5 minutos a 37º C

• Agregar a cada tubo 1 ml del R1
• Agregar a cada tubo 1 ml del R2
• Agitar suavemente e incubar 5 minutos a 37º C
• Agregar a cada tubo 10 ml de agua destilada
• Leer absorbancia a 530nm

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 Química Biológica I - 2013

INFORME – TRABAJO PRACTICO Nº 6

ENZIMAS – Parte I
APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

1) CURVA DE CALIBRACIÓN

Tubo Blanco 1 2 3 4 5

C (mM) - 1 2 3 4 5

Absorbancia

Abs - Bco

• Graficar Absorbancia vs. C (mM)

2) DETERMINACIÓN DE KM y VM
• Con los datos de Abs., teniendo en cuenta la curva de calibración, calcular la velocidad de
transformación de sustrato en UI/L (µmol de sustrato transformados por minuto por litro de
extracto crudo diluido 1/40). Volcar los resultados en la siguiente tabla:

Tubo B1 1 2 3 4 5 6
C urea (mM)
Absorbancia
Abs - Bco
V (UI/L)
1/ Curea
1/ V

• Graficar Actividad enzimática (UI/L) vs. concentración de sustrato (mM)

• Realizar gráfico de Lineweaver-Burk
• Calcular Km y Vmax

3) USO DE LA UREASA EN ANÁLISIS DE UREA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

Absorbancia de la muestra: ........................

Absorbancia del testigo: .............................
Concentración del testigo: ............................

Concentración de urea en muestra: ....................................

Observaciones y Discusión

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 Química Biológica I - 2013

CONCLUSIONES

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 Química Biológica I - 2013

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7

ENZIMAS – Parte II

OBJETIVO GENERAL: Estudiar el comportamiento cinético de la enzima ureasa (urea

aminohidrolasa, EC 3.5.1.5) contenida en un extracto crudo obtenido a
partir de harina de soja.

OBJETIVO PARTE II:

Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la ureasa.

INTRODUCCIÓN:
La ureasa cataliza la hidrólisis específica de la urea:

CO(NH2)2 + 2 H2O =======> 2 NH4+ + CO2

La ureasa existe en muchas bacterias, en varias especies de levaduras y en grandes plantas, dos de
las mejores fuentes son: porotos (Canavlia ensiformis), del cual ha sido cristalizada y
minuciosamente estudiada, y Bacillus pasteurii. En este estudio se trabajará con ureasa presente en
la harina de soja (Glycine max).

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se utilizará método discontinuo.

FUNDAMENTO:
La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco; éste
reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol , que se
determina colorimetricamente.
ureasa
CO(NH2)2 + 2 H2O =======> 2 NH4+ + CO2

OH-
NH3 + fenol + NaClO =======> azul de indofenol

Reactivos:

Urea ............................................................................ 1M

Reactivo 1: fenol ................................................. 10 ml

nitroprusiato de sodio ....................... 50 mg
H2O c.s.p.......................................... 200 ml

Reactivo 2: NaOH (10 N) .................................... 14 ml

Hipoclorito de sodio comercial ........ 10 ml
H2O c.s.p.......................................... 200 ml

Buffers de pH 3; 4; 5; 6; 7; 8,5; 10 y 13 .................... 10 mM

Enzima: ureasa (dilución 1/40 a partir del extracto crudo)

Preparación del extracto crudo

• Suspender 500 mg de harina de soja en 5mI de buffer Pi (l0mM, PH=7)
• Centrifugar 3000 rpm 10’
• Trasvasar 0,25 ml del sobrenadante a un tubo de ensayo y agregar 9,75ml de buffer (dilución 1/40
de ureasa, volumen total: 10ml).

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 Química Biológica I - 2013

Preparar una dilución 1/40 en buffer Pi 10 mM pH=7

Parte A: Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Se determinará la actividad enzimática a distintos pH (buffers de pH 1.0 - 3.0 - 4.0 - 5.0 – 6.0 - 7.0
- 8.5 – 10.0 – 12.0) siguiendo el protocolo indicado y en el orden siguiente:

1ºEnzima 2ºBuffer 4º Urea

Tubo 3º
dil 1/40 Pi 6-2M
Bco 0,4ml 1,6 ml * -
pH 1 0,4ml 1,4 ml 0,2ml
pH 3 0,4ml 1,4 ml 0,2ml
pH 4 0,4ml 1,4 ml Preincubar 0,2ml
pH 5 0,4ml 1,4 ml durante 5 0,2ml
pH 6 0,4ml 1,4 ml minutos a 0,2ml
pH 7 0,4ml 1,4 ml 37ºC 0,2ml
pH 8,5 0,4ml 1,4 ml 0,2ml
pH 10 0,4ml 1,4 ml 0,2ml
pH 13 0,4ml 1,4 ml 0,2ml

* Para el Blanco usar el Buffer de pH 7.

• Incubar 5 min a 37ºC.

• Cortar la reacción, sacando una alícuota de 0,2 ml de cada tubo, agregando sobre tubos que
contienen 0,4 ml Reactivo 1.
• Agregar 0,4 ml Reactivo 2.
• Incubar 5 min a 37ºC.
• Agregar 3 ml H2O destilada.
• Leer absorbancia a 530 nm contra blanco.

Parte B: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Se determinará la actividad enzimática en función de la temperatura (0- 10- 37-50- 70 y 90°C)

siguiendo el protocolo indicado:
Blanco 0 °C 10 °C 25 ºC 37 °C 50 °C 70 °C 100 ºC
(Tº amb)
1ºEnzima (dil 1 /40) 0,4ml 0,4ml 0,4ml 0,4ml 0,4ml 0,4ml 0,4ml 0,4ml
2ºBuffer Pi (*) 1,6ml 1,4ml 1,4ml 1,4ml 1,4ml 1,4ml 1,4ml 1,4ml
Preincubar 5 min la enzima y el buffer a la temperatura correspondiente, luego agregar:
3º Urea 6-2M - 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml

(*) usar el pH óptimo determinado en la parte A

• Incubar 5 min a la temperatura correspondiente

• Cortar la reacción sacando una alícuota de 0,2ml de cada tubo y colocar cada alícuota sobre
0,4ml de Reactivo 1, luego agregar a cada tubo 0,4ml de Reactivo 2.
• Incubar 5 min a 37ºC.
• Agregar 3 ml H2O destilada.
• Leer absorbancia a 530 nm contra blanco.

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INFORME - TRABAJO PRÁCTICO Nº 7

ENZIMAS – Parte II

APELLIDO Y NOMBRE:
COMISIÓN Nº:
GRUPO:
FECHA:

Parte A: Efecto del pH sobre la actividad enzimática

pH
B 1 3 4 5 6 7 8.5 10 13
del medio
Abs
530 nm

Abs530 - B

Gráfico de la absorbancia medida a 530 nm vs. pH (pegar en reverso de la hoja)

Parte B: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Temperatura
B 0 10 25 37 50 70 100
(ºC)
Abs
530 nm

Abs530 - B

Gráfico de la absorbancia medida a 530 nm vs. temperatura (°C) (pegar en reverso de la hoja)

Observaciones y Discusión

CONCLUSIONES:

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