PRÁCTICA No 9 EXTRACCIÓN DE ADN

I. OBJETIVOS:
 Extraer el ADN de un tejido animal y confirmar su estructura fibrilar.
 Utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural.

II. INTRODUCCIÓN:

El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo suizo,
en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos
desechados y en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque
no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery

La estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos. La estructura

de doble hélice del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick.
Una larga hebra de ácido nucleico está enrollada alrededor de otra hebra formando
un par entrelazado. Dicha hélice mide 3,4 nm de paso de rosca y 2,37 nm de
diámetro, y está formada, en cada vuelta, por 10,4 pares de nucleótidos enfrentados
entre sí por sus bases nitrogenadas.
La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en ésta actividad práctica) está
constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una
doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN,
se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas
de ambas cadenas que quedan apareadas. La unión de las bases se realiza
mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado
químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la
Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN está definida
por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo
precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden
en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por
tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones
del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es
decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético. La estructura en
doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (AT; G-C), implica que
el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el
orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez
conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la
secuencia de bases de la complementaria. Partiendo del hecho de que para el
estudio de las otras biomoléculas: lípidos, proteínas, enzimas, carbohidratos y
vitaminas, no sólo existen diversos procedimientos prácticos para complementar la
parte teórica, sino que además, son moléculas que por su importancia en la
alimentación y en la salud humana, son más conocidas y reconocidas por los
alumnos (y en general por todas las personas), no así, para el caso del ADN, pues
éste ni forma parte directa de nuestra dieta, ni lo podemos consumir en su esencia
 como consumimos vitaminas a partir de frutas y vegetales, y aún más, su grado de
abstracción nos resulta aún mayor. Además, por todas las implicaciones y
aplicaciones que del estudio y manipulación de la molécula de ADN se derivan, se
considera el descubrimiento de la misma como la segunda gran revolución científica
(la primera fue para el campo de la física, con la bomba atómica).

La purificación del DNA es importante porque permite:

1. Identificar mutaciones.
2. Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).
3. Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).
4. Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.
5. Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes
patogénicos.
6. Identificar resistencia microbiana.
7. Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, inmunológicos.
8. Medicina forense para la identificación de personas.
9. Para hacer test de paternidad.

Procedimiento Básico de aislamiento Los pasos básicos de aislamiento de ADN son

la interrupción de la estructura celular para crear un lisado, la separación del ADN
soluble de desechos celulares y otros materiales insolubles y la purificación del ADN
de interés de las proteínas solubles y otros ácidos nucleicos. Históricamente, esto se
hizo mediante la extracción orgánica (por ejemplo, el fenol y cloroformo), seguida por
la precipitación de etanol. Para facilidad de uso, en la actualidad se ofrece una gama
de productos de purificación ADN convenientemente envasados que permiten aislar
el ADN en poco tiempo usando métodos mucho más seguros. La interrupción del
cultivo celular se realiza por medio de sales chaotropic, detergentes o
desnaturalización alcalina, y el lisado resultante se elimina por centrifugación,
filtración o de compensación magnética. El ADN es purificado de la porción soluble
del lisado. Cuando se usan las matrices de sílice, el ADN es eluido en un tampón
acuoso como agua libre de nucleasa. El ADN purificado de alta calidad está listo para
usar en una amplia variedad de aplicaciones exigentes, tales como PCR, transcripción
in vitro / sistemas de traducción, transfección y reacciones de secuenciación. El EDTA
es un quelante que se une al magnesio presente en el ADN purificado y puede ayudar
a inhibir la actividad nucleasa de posibles contaminante.

III. MATERIALES.
Estudiantes

- Hígado de pollo
- Alcohol de 96%
- Arena.
- Trocito de tela para filtrar (gasa)
- SDS (detergente lavavajilla)
- Cloruro sódico 2M (sal de mesa)
 Laboratorio

- Varilla de vidrio
- Mortero
- Vasos de precipitado
- Pipeta
- Probeta

IV. PROCEDIMIENTO
1. Triturar el Hígado de pollo en un mortero. Añadir arena para que al triturar se puedan
romper las membranas y queden los núcleos sueltos.
2. Añadir al triturado, 50 centímetros de agua. Remover hasta hacer una especie de
papilla o puré.
3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan
quedado por romper.
4. Medir el volumen del filtrado con una probeta.
5. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos
producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
6. A continuación se añade 1 centímetro cúbico de SDS. (Nota: Si no se dispone de
este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas. La acción de este
detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos
quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.
7. Añadir mediante una pipeta 50 centímetros cúbicos de alcohol de 96% Hay que
hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos
capas. En la interface, precipita el ADN.
8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla
se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado
de la agrupación de muchas fibras de ADN.
9. Realizar una tinción específica de ADN. Tenemos que tomar una muestra de las
fibras que se van depositando sobre la varilla de vidrio y depositarlas sobre una
lámina porta objeto. Teñir durante unos minutos con un colorante básico. (azul de
metileno)
Observar al microscopio.
Resultado del experimento del hígado: Apreciamos el ADN.

CONCLUSIONES:

- En primeras instancias batimos para que se rompan las células y los núcleos estén
sueltos.

- En esta práctica se logró el objetivo principal y planteado que es la extracción del

ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo una serie de pasos
para poder lograrlo, así se pudo separar de otros componentes como proteínas,
lípidos, carbohidratos y se pudo distinguir cual era cual y el resultado final fue la
extracción y separación del ADN. Esta práctica fue un éxito ya que se siguió paso
a paso como se debe de extraer y separar el ADN y por qué se hizo en presencia
de una persona capacitada y que fue verificando cada uno de los pasos y
resultados que se obtuvieron.

- El objetivo principal de este experimento es poder observar sin ayuda de un objeto

óptico los Ácidos Nucleicos del hígado de pollo, reconocer su presencia mediante
una reacción coloreada específica y confirmar su estructura fibrilar. Utilizamos la
sal ya que produce el estadillo de los núcleos quedando libre las fibras de
cromatinas. El detergente lo utilizamos para que las proteínas puedan formar un
complejo y separarse del ADN.
BIBLIOGRAFÍA:
- http://biologocalentano.blogspot.com/
- https://www.youtube.com/watch?v=r7M9zPbgyNY
- http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/MaterialDidactico/Micro/BioCelul
ar/Practica/extraccion_adn.pdf
- http://www.juntadeandalucia.es/averroes/iesvicen/depart/biolog/pdf/p3.pdf