ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA

Universidad San Ignacio de Loyola

Facultad de Ingeniería

Profesor: Saldaña Serrano, Miguel Ángel

Informe de practica N° 7

Ensayo de Toxicidad Aguda con Neonatos de Daphnia Magna (Pulga de Agua), Expuestos a

diferentes agentes tóxicos.

Integrantes: Código:

Jesús Zea, Diana Carolina 1521168

Mantari Sairitupac, Luigui Erick 1521279

Millones Cumpa, Leslye Alexandra 1611233

Minaya Buiza, Wendy Saly 1521351

Quispe Huaroto, Kelvin Yersohon 1521592

2018 – 02
LIMA
 CONTENIDO

INTRODUCCION ...................................................................................................................1
OBJETIVOS ...........................................................................................................................1
Objetivos generales ............................................................................................................1
Objetivos específicos ..........................................................................................................1
MARCO TEORICO .................................................................................................................2
METODOLOGIA .....................................................................................................................3
MATERIALES .....................................................................................................................3
PROCEDIMIENTO..............................................................................................................4
RESULTADOS .......................................................................................................................6
DICUCIONES .........................................................................................................................9
CONCLUSIONES .................................................................................................................10
CUESTIONARIO ..................................................................................................................10
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................12
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INTRODUCCION

El cambio de estilo de vida de las personas en las últimas décadas y la migración de estas del
campo a la ciudad, ha incrementado el consumo de diversos productos, entre ellos los de
limpieza. Si bien estos productos en un inicio no representaban un problema significativo, ahora
con el incremento de la población y su uso es necesario verificar los efectos que podrían estar
generando en los ecosistemas acuáticos.
Los detergentes ocasionan varios impactos sobre el ambiente como es la eutrofización, debido
a los altos niveles de fósforo procedentes del tripolifosfato, principal ingrediente de las
formulaciones detergentes. Además, pueden aumentar los niveles de cloro y de compuestos
organoclorados; algunos posiblemente de carácter tóxico y carcinógeno (Lechuga 2005). Así
también como lo señala Romero (1996), causan problemas de espuma en aguas superficiales,
lagos, ríos y plantas depuradoras de aguas residuales.
En esta práctica de laboratorio lo que se pretende es realizar una prueba preliminar teniendo
como organismo prueba a Daphnia magna y como agente toxico a un detergente comercial. En
este sentido se llegará a tener una noción de la concentración de este contaminante que ocasiona
efectos en los organismos a utilizar.

OBJETIVOS

Objetivos generales
• Evaluar los efectos nocivos causados por diferentes agentes tóxicos sobre el cladócero
Daphnia Magna (pulga de agua) realizando pruebas preliminares de toxicidad.
Objetivos específicos
• Determinar el efecto que causa el detergente comercial sobre las Daphnias Magnas.
Evaluando parámetros de Cl50.
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MARCO TEORICO

DAPHNIAS
Son micro - crustáceos característico de agua dulce, pertenecientes del género planctónico,
en la orden cladócera. (Díaz-Báez, Bustos López, & Espinosa Ramírez, 2004) Este organismo
es empleado para la evaluación o monitoreo de diferentes espacios geográficos dulceacuícolas.
Destacando su alta tolerancia a la exposición a medios salinos, como es en el caso de la Daphnia
magna. (Kluwer Academic Publishers, 1995) Además, cabe destacar que los medios de cultivo
son actualmente modificados para reducir costos en los ensayos. (Núñez & Hurtado, 2013).

Imagen. Daphnia sp. (Fuente: Popia)

Además de la Daphnia Magna, existen otras especies empleadas para los ensayos
ecotoxicológicos, tal es el caso de D. pulex, D. reticulada y D. obtusa, pero su efectividad y fácil
manejo en etapas tempranas, la convierte en la más recomendable. (Díaz-Báez, Bustos López,
& Espinosa Ramírez, 2004)

DETERGENTE COMERCIAL
Los efluentes de origen doméstico tienen en su contenido restos de jabones, detergentes,
lejía, entre otros materiales empleados para la limpieza y aseo personal. (Castanheira & Paula,
2010) De esta manera, el empleo de detergentes comerciales y naturales se ha visto evaluado
de tal manera que los primeros presentan un CL50 mayor a los segundos, esto evaluado en
especies como las Physa cubensis, caracoles que tienden a encontrarse en agua dulce. (Marcel,
2010)

ENSAYOS ECOTOXICOLÓGICOS AGUDOS

Los ensayos agudos en ecotoxicología, son aquellos que, por su corta duración, tiene por
objetivos determinar las concentraciones de mortalidad e inmovilidad, como es el caso del CL50.
(Camacho, 2012) Tiene una duración máxima de 96 horas. En este periodo de tiempo, también
se puede identificar los DL90, LJ50, esto considerando que las concentraciones no reflejan la
realidad y que las mismas pueden ser elevadas en comparación con los ensayos crónicos. (Martí,
2007)
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METODOLOGIA

MATERIALES
7 vasos de precipitado de 100 ml por mesa 1 vaso de precipitado de 500 ml por mesa

1 pipeta volumétricas graduadas de 1ml, 2ml, 1 probeta de vidrio 100 ml

5ml y 10 ml.

1 probeta de vidrio de 250 ml Agua San Mateo

Pipetas Pasteur Microscopio

 4

PROCEDIMIENTO

Principio de la prueba
Las especies del género Daphnia son las más utilizadas como organismos de prueba o de
referencias en pruebas de toxicidad por su amplia distribución geográfica, la importancia que
cumplen al interior de la comunidad zoo planctónica, la facilidad del cultivo en el laboratorio, la
reproducción partenogenética( lo cual asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de
vida con la reproducción de un alto número de crías, han hecho de este grupo de especie un
ideal para la evaluación de toxicidad. (Castillo, 2004).

Las Daphnias son utilizadas extensivamente en pruebas de toxicidad, por lo que existe una
extensa información sobre las técnicas de cultivo, los requisitos de temperatura, luz y nutrientes,
así como su respuesta a diferentes compuestos tóxicos. Este organismo permite determinar la
letalidad potencial de sustancias puras, aguas residuales domesticas e industriales, lixiviados,
aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua de poro de sedimentos, entre otros.
(Díaz, Pica &, Ronco, 2004).

Fuente: propia
 5

Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda con Daphnia

magna

Los cultivos deben mantenerse a una temperatura de 21± 2 °C, con un fotoperiodo aproximado
de 16 horas luz, 8 de oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 luxes. Es
recomendable determinar la concentración de oxigeno del agua, la cual debe estar por encima
de 6 mg/L, y la dureza que debe estar a un intervalo de preestablecido de 160 a 180 mg CaCO3
/L. En caso de que alguno de estos parámetros se encuentre fuera de los intervalos
mencionados, el agua debe desecharse. (Díaz, Pica &, Ronco, 2004).

Al implementar bioensayos y pruebas de toxicidad es necesario efectuar su estandarización,

para establecer la sensibilidad de la especie y la reproducibilidad del experimento frente al agente
toxico. Donde se asegura que la respuesta de la población expuesta a cierto agente toxico se
deba al efecto de este y no a variaciones de la sensibilidad de los organismos. La estandarización
permite comparar resultados entre diferentes laboratorios siguiendo una metodología común, por
lo que deben calibrar constantemente su método y elaborar cartas de control de vigilancia con
cada una de las especies empleadas como organismos prueba. (Silva, Torrejon, Bay-Schmith &
Larrain, 2003).
Pasos para el bioensayo de toxicidad.
1. Para el desarrollo de pruebas de toxicidad aguda con D. magna se emplean neonatos
(< 24 horas de nacidos) expuestos a diferentes concentraciones de detergente
comercial durante un período de 48 horas. Cuando no hay un conocimiento del origen
de las muestras o de su toxicidad, es recomendable llevar a cabo una prueba
preliminar, en la cual se prepara un amplio intervalo de concentraciones sin réplicas
(por ejemplo: 0.001, 0.01, 0.1, 1,10, y 100%).
2. Las pruebas definitivas requieren 5 diluciones, (preparar un mínimo de 160mL por
dilución). Este volumen será suficiente para el llenado de las tres réplicas (40mL en
cada uno) de cada concentración. Además, se debe preparar, un control negativo con
agua reconstituida y un control positivo preparado a partir de dicromato de potasio.
3. Una vez preparadas cada una de las soluciones, se transfieren diez neonatos de
menos de 24 horas de nacidos a cada uno de los recipientes. Terminada la
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transferencia, se cubren los vasos con papel Parafilm y se colocan bajo condiciones
controladas de iluminación y temperatura por un período de 48 horas.
4. Transcurrido el tiempo establecido, se revisan los vasos de prueba y se registra el
número de organismos muertos en cada uno. La muerte se reconoce, por la carencia
de movilidad o la ausencia de ritmo cardíaco. Antes de efectuar las lecturas se agitan
los recipientes en forma circular para reactivar el movimiento de los organismos que
se posan inmóviles en el fondo. Aquellos que no presenten movilidad pueden
observarse con un microscopio estereoscópico para confirmar la ausencia de ritmo
cardíaco.

RESULTADOS

Evaluación y recopilación de datos a las 24 horas:

Tabla 1: Valores de sobrevivencia y mortalidad
Tratamiento Sobrevivientes Muertos Total

1 0 10 10

2 0 10 10

3 0 10 10

4 5 5 10

5 10 0 10

Evaluación a las 24 horas.

12

10

0
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

Sobrevivientes Muertos

Gráfico 1: evaluación de la sobrevivencia durante 24 horas.

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Tabla 2: Relación de los tratamientos y su concentración.

Concentraciones
Tratamiento
(mg/L)

1 180

2 72

3 28.8

4 11.52

5 4.61

Concentración - Mortalidad
12
10
8
6
4
2
0
180 mg/L 72 mg/L 28.8 mg/L 11.52 mg/L 4.61 mg/L

Organimos muertos

Gráfico 2: Concentración y mortalidad dentro de las 24 horas.

Evaluación y recopilación de datos a las 48 horas:

Tabla 3: Valores de sobrevivencia y mortalidad
Tratamientos Sobrevivientes Muertos Total

1 0 10 10

2 0 10 10

3 0 10 10

4 2 8 10

5 6 4 10
 8

Evaluación a las 48 horas

12
10
8
6
4
2
0
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

Sobrevivientes Muertos

Gráfico 3: evaluación de la sobrevivencia durante 48 horas.

Tabla 4: Relación de los tratamientos y su concentración.

Tratamiento Concentraciones
(mg/L)

1 180

2 72

3 28.8

4 11.52

5 4.61

Concentración - mortalidad
12
10
8
6
4
2
0
180 mg/L 72 mg/L 28.8 mg/L 11.52 mg/L 4.61 mg/L

Organismos muertos

Gráfico 4: Concentración y mortalidad dentro de las 24 horas.

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Control negativo y positivo

24 HORAS

Control negativo Control positivo

Sobrevivientes Muertos Sobrevivientes Muertos

10 0 0 10

48 HORAS

Control negativo Control positivo

Sobrevivientes Muertos Sobrevivientes Muertos

6 4 0 10

DICUCIONES

En la evaluación realizada a las 24 horas, se pudo notar el efecto que tuvo el contaminante
(en nuestro caso, el detergente comercial) en el organismo. Obteniendo en nuestra gráfica que
las mayores concentraciones (180 mg/L) llegaron a acabar con todos los organismos, tal como
se ve en el tratamiento 1, 2 y 3, mientras que en el tratamiento 4 y 5 se encontraron
sobrevivientes, debido a que la concentración del contaminante usado fue menor.
Este aumento de mortalidad en los tratamientos según su concentración puede deberse al
compuesto biodegradable que contienen la mayoría de los detergentes llamado LAS (sulfonato
de alquilbenceno lineal), este tensoactivo está presente en la mayoría de los detergentes
comerciales, siendo este compuesto responsable de la acción limpiadora (Temara et al 2001,
citado por UC, R. & Delgado, V. , 2011).
Los tensoactivos son ingredientes peligrosos para la fauna acuática ya que tienen un modo
de acción amplio debido al carácter anfifílico, propiedades de solubilización de membranas y
disrupción endocrina que poseen. Por otro lado, la presencia de agentes reforzadores con
polifosfatos es nocivo para la fauna acuática porque la hidrólisis que se lleva a cabo genera
productos que contienen fósforo, siendo responsable de la eutrofización en cuerpos de agua
(León, 2006, citado por UC, R. &Delgado, V. , 2011).
En cuanto a los controles negativo y positivo, los resultados fueron los esperados, ya que se
obtuvieron la sobrevivencia al 100% en el control negativo (agua mineral) y la mortalidad al 100
% en el control positivo (dicromato de potasio), por lo tanto, con los resultados obtenidos, se
puede decir que la prueba tiene validez.
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CONCLUSIONES

La aplicación de Daphnia magna como población experimental, favorece ventajas como, por
ejemplo: son económicos, no requieren mucho espacio, y presentan una reproductibilidad
confiable, ya que realizan una reproducción partenogenética. Se logró determinar que el efecto
que produce el detergente sobre la población de Daphnia Magna, es muy agresiva a
concentraciones pequeñas, esto generado por la presencia de tensoactivos (LAS) que se
encuentran en forma natural o sintética en los detergentes, brindándoles aroma, inhibidores de
corrosión, blanqueadores entre otros. por tanto, el conocimiento de procesos básicos para su
filtración es vitalmente un importante reto para la ingeniería ambiental. Además, por el lado de la
eficiencia, al tratarse de un procedimiento para detergentes comerciales, muchas veces utilizado
como desinfectante y limpiador, se considera que la sustancia toxica evaluada en su versión en
polvo presenta una actividad letal para microorganismos. Y es muy recomendable trabajar con
las laeonereis culveri, especie que es mucho más resistente a altas concentraciones de LAS a
diferencia de la Daphnia Magna. ( (Giovanni, 2011)

CUESTIONARIO

1._Comparar sus resultados con los resultados de otros artículos y/o publicaciones.
Tabla 1: Resultados obtenidos en otros estudios ecotoxicológicos.
ESTUDIO AUTOR ORGANISMO/A.T RESULTADOS
Toxicidad y Pettersson _Daphnia magna Solo uno de los detergentes
desintoxicación A, Adamsson _Detergentes tenía un CE50 de 48 h> 100 mg / L.
de detergentes y M, Dave G. El CE50 de 48 h para los otros 25
productos detergentes varió de 4 a 85 mg /L.
suavizantes
suecos.
(2000).
Determinación Russell _Laeonereis CL50-48 h: Foca (fórmula: 59.56;
de la Giovanni UC- culveri. LAS: 12.88 en ppm) > Blanca
concentración PERAZA y Nieves (fórmula: 70.79; LAS:
letal media (cl50) Víctor Hugo _Sulfonatos de 13.03 en ppm) > Roma (fórmula:
de cuatro DELGADO- alquilbenceno lineales 89.12; LAS: 13.48 en ppm) > Puro-
detergentes BLAS (LAS). Sol (fórmula: 91.83; LAS: 14.12 en
domésticos ppm).
biodegradables
en laeonereis
culveri (2011).
Efecto del José _Caracoles CL50,48 horas.
detergente Iannacone dulceacuícolas: M. tuberculata 201,07 mg/L, P.
doméstico alquil y Lorena Melanoides venustula 71,41 mg/L y H.
aril sulfonato de Alvariño tuberculata, Physa cumingii 82,93 mg/L
sodio lineal venustula y Heleobia
(LAS) cumingii.
sobre la _Surfactante
mortalidad de tres aniónico alquil aril
caracoles sulfonato de sodio
dulceacuícolas en lineal (LAS).
el Perú (2002).
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2. ¿Cómo se podrían disminuir los posibles errores del experimento?

- Los materiales a utilizar en los laboratorios deben de estar correctamente lavados y libre de
posibles contaminantes.
-Los reactivos (Agentes tóxicos) deben de contener una pureza superior a los 99%.
-Se deben de establecer los parámetros fisicoquímicos y verificar las variaciones.
-Se deben seleccionar organismos en el mismo estadio y evitar errores por la resistencia de
estos.
3. ¿Qué otros tipos de parámetros podría usted determinar para evaluar los efectos del
tóxico?
En la Daphnia magna se podrían evaluar efectos crónicos (NOEC, LOEC). Asi también se
podría determinar el tiempo en el que las Daphnias tardan en morir al ser expuestos a los agentes
tóxicos en una prueba aguda.
4. Que recomendaciones brindaría para mejorar la experiencia.
-En el practica de laboratorio que se realizó se deberían de realizar pruebas definitivas que
permitan hacer un análisis más profundo y de esta manera hacer uso de herramientas
estadísticas (uso como las tablas probit).
-por otro lado, para disminuir errores y realizar ensayos más reales, se deberían disponer en
ambientes controlados las muestras, y de esta manera determinar la variación de los parámetros
fisicoquímicos.
5. Proponga un caso real en el cual emplee este bioensayo como herramienta de
evaluación o diagnóstico ambiental. Explique

Los ensayos ecotoxicológicos son una herramienta que nos permite sustentar un probable
problema de contaminación en las diferentes matrices ambientales. En este sentido si se
observan en las playas de Lima que hay una disminución poblacional de ciertas larvas de peces
y de la Daphnia, se puede inferir y sustentar que la probable causa es las altas concentraciones
de detergentes que se podrían estar ingresando al mar provenientes de la ciudad de Lima con
las aguas domesticas si tratamiento, están causando tales disminuciones de población. Por otro
lado, si se observa cierta formación de espuma en el agua y además de esto se determina
concentración mayor a 5mg/L se estaría detectando un medio toxico para las especies acuáticas
Con los resultados obtenidos de concentraciones de detergentes que causan efecto a las
especies se podrían exigir a las autoridades que se regule y se adecue mejor la gestión de las
aguas residuales. Es necesario comparar resultados con otros estudios similares para que tenga
mayor relevancia los resultados obtenidos.
Cabe mencionar que en esta práctica solo se realizó una prueba preliminar que no nos brinda
resultados más detallados y reales. También tiene la limitación de para aplicar herramientas
estadísticas. Sin embargo, es útil para servir como guía en la determinación de concentraciones
más específicas en pruebas definitivas de toxicidad.
 12

BIBLIOGRAFÍA

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