Introducción al laboratorio

01 octubre 2018
Santiago

El objetivo de estas clases no es para que ustedes realicen una prueba de

laboratorio sino para que la puedan interpretar
Vamos a ver unos principios básicos fundamentales para las pruebas de
laboratorio:

Interpretación #1: Cuando se hace una evaluación frente a un posible diagnóstico

de infecciones hay 2 probabilidades:

1. Buscar el agente etiológico-biológico de la enfermedad, ósea buscar el

microrganismo.

Herramientas para buscar microrganismos:

- Cultivos
- Detección del antígeno específico: cada microrganismo tiene unos
antígenos que lo diferencian de otro.

2. Evaluar la Respuesta Inmune al microrganismo

Como se quiere hacer un dx especifico habría que hacer una evaluación de la

respuesta inmune específica y ¿cuál es la especifica? La respuesta inmune
adaptativa, porque la innata no me da mucha orientación. Ejemplo mando un hemograma
para ver un reflejo de la R.I.Innata determinando concentraciones celulares. Determino la cantidad de
monocitos (que se convierten en macrófagos) y están aumentados por encima de 10 (lo normal es de 5 a
10%) entonces sospecho de infección, pero estos se activan frente a bacterias, virus, parásitos, hongos o si
se está infartando también, porque también reconocen DAMPS, entonces es muy inespecífica la R.I.Innata.

Para hacer el diagnostico específico tomo como herramienta la respuesta inmune

adaptativa que está compuesta por:

 LTCD4: Se podría Evaluar Citoquinas (perfil de citoquinas) ya que son

secretadas por los LTCD4, pero estas son proteínas súper lábiles, aparte
hay muchísimas citoquinas secretadas y ¿cuál de todas determino?, y
tampoco me sirven porque los LTCD4 no son las únicas células en liberar
esas citoquinas. NO ME SIRVE EVALUAR CITOQUINAS COMO
RESPUESTA ESPECIFICA.

 LTCD8: son citotóxicos, y ¿cómo evaluó la acción citotóxica? Me queda

muy complicado, entonces NO SE EVALUA TAMPOCO.

 LB: Su función es producir anticuerpos que son moléculas específicas para

los antígenos. POR ESTO ESTA ES LA ELECCION para hacer el
diagnóstico y se descarta LTCD4 Y LTCD8.
3 condiciones o principios para tener presentes cuando se quiera evaluar
anticuerpos:

1. Una persona solo produce anticuerpos para los antígenos a los cuales
se ha expuesto.

Ósea A través de la determinación de anticuerpos se puede evaluar la

exposición específica a un antígeno.

Ejemplo: Si yo sospecho de un paciente con dengue solicito anticuerpos anti-

dengue, si me da positivo esto quiere decir que se ha expuesto al virus, pero
de acuerdo al isotipo de anticuerpos puedo decir si es una infección en curso
(IgM) o si es una infección pasada (IgG). SOLAMENTE se producen
anticuerpos anti dengue si me he expuesto al virus dengue, si NUNCA me he
expuesto NO produzco anticuerpos. Por esto buscar anticuerpos específicos
para un antígeno implica la exposición a ese antígeno.
Si sospecho de un paciente con sífilis mando anticuerpos anti-sifilis,
toxoplasma anticuerpos anti-toxo, VIH anticuerpos anti-VIH.

2. Una persona puede tener anticuerpos específicos para un antígeno

sin haberse expuesto al antígeno.

Debido a la inmunización pasiva que es la transferencia de anticuerpos de un

organismo inmune a un organismo no inmune.

Ejemplo: Mujer VIH positiva que queda en embarazo y cuando él bebe nace se
quiere evaluar si el niño está infectado. Si le hacen un ELISA saldrá positivo
¿pero son Anticuerpos del niño? No lo sé, porque la madre durante la
gestación le transfiere anticuerpos al bebe y probablemente esos anticuerpos
que se detectan en la ELISA son de la madre. ¿Entonces se puede hacer
diagnostico con esto? NO. La madre si cumplió el primer principio: se expuso al VIH y por esto
tiene los Ac anti VIH.

Ejemplo 2: Paciente mordido por un animal (murciélago, perro, gato, ardilla)

sospecho de virus rabia, el protocolo es darle suero anti rábico y después le
hago una prueba buscando anticuerpos, me puede salir positiva, pero
¿confirmo infección? NO, porque le trasfirieron los anticuerpos. Se debe tomar
una muestra antes de la inmunización para poder confirmar la infección.

3. Una persona por la exposición a un antígeno no siempre va a producir

anticuerpos específicos para el antígeno.

Debido a la variabilidad del HLA. Ejemplo: Se vacuna, luego le toman títulos y

le dan negativos. Posiblemente alelicamente en el HLA la persona no pudo
generar una presentación que condujera a la respuesta inmune humoral
(producir anticuerpos).
Ejemplo: Niño vacunado con sarampión y le da sarampión pudo ser por el HLA
pero si también digamos que el mismo niño tiene vacuna contra fiebre amarilla
pero le da fiebre amarilla ya no responder a dos vacunas, NO ES POR EL HLA ya
es un defecto inmunológico.

Historia: dos estudiantes paramédicos que por riesgo de exposición se hicieron un

ELISA para VIH y no sabían leer el resultado. A uno la prueba le dio 0
interpretación NO REACTIVA. Al otro le dio 0,5 interpretación NO REACTIVO.
Los números son una unidad cuantitativa, en el estudiante que le dio 0 no se
detectó ningún Ac específico para VIH y se interpreta NO REACTIVO. Pero al otro
estudiante la prueba si le encontró anticuerpos, cuantitativamente si hubo una
detección de anticuerpos pero la interpretación era igual NO REACTIVA.

¿Por qué se interpretan igual si a uno le salieron anticuerpos específicos para

VIH? Había cursado con un cuadro viral reciente de zyka, por lo que hubo
reacción cruzada.En las pruebas de laboratorio hay sensibilidad y especificidad. Una prueba sensible
determina hasta pocas concentraciones de un analito (analito es la muestra que busco), la especificidad
detecta positivamente lo que estoy buscando, ósea el analito excluyendo otros analitos. Si me dice que la
especificidad es de 93% significa que es muy buena pero que hay un rango posible que me detecte moléculas
que no son las específicas.

Entonces lo que paso con el estudiante fue que acababa de cursar con una
infección muy aguda y había hecho unos títulos de anticuerpos muy grandes
contra zyka y se tomó la prueba ELISA y la prueba detecto esos anticuerpos. Pero
la interpretación sigue siendo NO REACTIVA.

Otro principio de las pruebas:

Hay pruebas que pueden dar reacciones cruzadas:

La reacción cruzada es un efecto que se puede dar en una prueba. Es una prueba
que buscando un analito (es lo que se busca puede ser Ag o Ac) pueda detectar
otros que no sean los específicos.

Si en la prueba saliera mayor a 1 si tendría anticuerpos anti VIH. Este ejemplo fue
breve porque le salió 0,5 y uno dice no tiene Acs anti VIH, pero es jartisimo si el
resultado es 0.9, entra en un límite que se llama zona gris (zona indeterminada).
Con un resultado en la zona gris yo no le puedo decir no es VIH positivo pero
tampoco le puedo decir que si lo es. El procedimiento seria repetirla en 1 semana
porque si los anticuerpos que se están detectando no son los específicos
probablemente en una semana o 15 días estarían disminuidos, si no han
disminuido puedo solicitar otra prueba. Western blot no se hace hasta que el Elisa
de REACTIVO.
Historia: A veces los resultados de laboratorio hay que saberlos interpretar. Mi
prima llevaba hospitalizada 3 días enferma, me mando el hemograma que le
hicieron y decía:

 Recuento de Leucocitos: 22.000 (lo normal es hasta 11.000)

 Pero en porcentajes aparecía:
 Neutrófilos: 65% - normal de 40-70%
 Linfocitos: 28% - normal de 30 – 40%
 Monocitos: 7% - normal de 5 – 10%
 Eosinofilos: 3 - normal de 1 – 3%
 Basofilos: 0.1 - menor al 1%

¿Cual tiene alterado? Ninguno. Tiene una leucocitosis pero el porcentual no me

dice dónde está el aumento.

Para saber cual tiene alterado no hay necesidad de repetir los exámenes, hay que
hacer un hemograma especifico: esto significa hacer un coteo visual celular. En el
específico ya vimos que tenía una neutrofilia.

Las pruebas de laboratorio son pruebas que están basadas en la detección de un

anticuerpo o un antígeno.

- Si solicito la determinación de un Ag, estoy buscando la infección

- Si solicito la determinación de un Ac, estoy buscando la respuesta
inmune a ese microorganismo.

¿Qué es mejor?
La determinación de antígenos.
Es muy buena, y los antígenos pueden aparecer antes que los anticuerpos. Es
decir que pueden aparecer antes de desencadenar una RI adaptativa humoral.

 Gold standard: es el cultivo, por que buscando antígenos puedo resultar

con una reacción cruzada, por que el Ag es una molécula, una proteína,
pero si el microorganismo crece significa que ahí esta presente.

Así el cultivo sea el gold standard, es decir lo mejor, esto no es lo que mas
se manda por que 1) hay microorganismos que tienen una taza de
crecimiento muy lenta, y de ahí a que crezcan el paciente ya se murió o ya
se mejoro. 2) No todos los microorganismos se dejan cultivar, en el
laboratorio a veces no se pueden reproducir todas las condiciones
fisicoquímicas que requiere el microorganismo para su crecimiento.
 2. Se emplean Ac o AG comerciales

Uno compra un reactivo y esa es la molécula que va a determinar la presencia del

analito
 Analito: lo que quiero buscar
 Reactivo: con lo cual lo voy a buscar

Si la prueba de laboratorio utiliza como reactivo un Ac, el analito es un Ag

Si voy a buscar un Ac, el reactivo será un Ag

Cuando hicimos hemo-clasificación estábamos buscando Ag, entonces en los

reactivos habían Ac específicos  buscando Ag eritrocitarios usamos como
reactivos Ac

 Para que las pruebas de laboratorio sean útiles deben cumplir unos
parámetros:

- Que sean rápidas: lo son. Hay pruebas que arrojan los resultados en
minutos
- Que no sean costosas: hay pruebas asequibles, por ejemplo la hemo-
clasificación.
- Que se puedan estandarizar: que se puedan aplicar en diferentes
laboratorios

Para que cumplan la condición de especificidad, generalmente en las pruebas se

utilizan anticuerpos monoclonales. Cuando uno compra sueros o anticuerpos nos
los pueden ofrecer monoclonales o policlónales.

o Reactivo monoclonal: hay anticuerpos provenientes de la misma clona, o

sea que tienen la misma especificidad.

o Reactivo policlónal: reactivo que tiene anticuerpos provenientes de distintas

clonas  son específicos para diferentes antígenos o para diferentes
epitopes del mismo antígeno.

 El uso de Ac monoclonales aumenta la especificidad de las pruebas.

¿Para qué se utilizan?
Las pruebas de laboratorio tienen un rango muy amplio:

- Diagnostico de agentes infecciosos

- Diagnostico de enfermedades autoinmunes o por inmunodeficiencias.

Por ejemplo si queremos evaluar la RI humoral buscamos Ac,
sospechamos una inmunodeficiencia de complemento entonces
cuantifico el complemento.

- Diagnostico de tumor o cáncer: ahí se producen antígenos específicos

del tumor o del cáncer

Cada prueba acepta un rango de distintas muestras:

- suero
- sangre completa
- plasma
- fluidos corporales; saliva, orina…
- biopsias

La selección de la muestra va a estar asociado a lo que se esta sospechando, ahí

hacemos la determinación de la muestra.

Hay dos tipos de pruebas de laboratorio o inmuno-ensayos:

1) Pruebas que utilizan Ag o Ac marcados

2) Pruebas que utilizan Ag o Ac no marcados

 Los que utilizan Ag o Ac marcados: es por que al anticuerpo se le adiciono

otra molécula: un fluorocromo, una enzima o un isotopo radioactivo.
Esa molécula adicionada al reaccionar con el analito va a inducir una
fluorescencia, una emisión de luz, una emisión radioactiva o una reacción
enzimática.

La evaluación de la reacción se hace emitiendo luz o emitiendo color.

 Los que utilizan Ag o Ac no marcados: se hacen determinando la

aglutinación; es una unión molecular entre el Ac y el Ag.
Nosotros agregamos (en el lab) el reactivo, agitamos para que se diera la
reacción, y empezamos a ver que podían aparecer grumos, eso es una
aglutinación.

*Cuantos antígenos habían sobre los eritrocitos que medimos?

A y B.
 *Que cantidad había de A y que cantidad de B?
No lo contamos, solo “contamos” si había presencia o ausencia, es decir
que hicimos una prueba cualitativa. Hay pruebas que si determinan la
cantidad, esas serian pruebas cuantitativas.

1) Prueba de aglutinación
En el laboratorio hicimos una prueba de aglutinación, la aglutinación tiene algunos
principios:
- Se utilizan Ac que se van a unir a Ag expresados en la célula

Hay varios tipos de pruebas de aglutinación:

 Aglutinación directa
 Aglutinación indirecta
Vamos a ver el principio de dos pruebas de aglutinación:
 Hemoclasificación
 Pruebas de Coombs

Si yo agrego Ac a una solución o a una muestra donde hay Ag específicos para

esos Ac, los Ac se van a unir a los Ag expresados y comienzan a agrupar las
células que tienen el Ag. Cuando se da esa aglutinación, esa formación de
grumos, entonces aparecen los grumos ya observables. Eso fue lo que nosotros
hicimos (en el lab).

En esta imagen vemos dos círculos donde se trato de hacer una

hemoclasificación:

 Se observa en la muestra de la izquierda la presencia del Ag.

 Cuando hay aglutinación es porque hay presencia del Ag.

Si yo agrego el Ac y aglutina es por que en esa muestra esta el Ag especifico

 Si lo comparamos con el de la derecha, agregando el Ac no hay

aglutinación, esto indica ausencia del Ag.

o La hemoclasificación es una aglutinación directa, ahí buscamos dos tipos

de antígenos:
- Unos Ag que son carbohidratos: Azúcar A y Azúcar B
- Uno Ag que es una proteína: proteína Rh

Cada eritrocito tiene muchos mas antígenos que estos, pero esos son los que
mayormente se consideran.
 o Cada eritrocito sobre su membrana tiene una gran cantidad de Ag distintos.

Basados en esos Ag aparecen los grupos sanguíneos:

1. Eritrocito con Ag A
2. Eritrocito con Ag B
3. Eritrocito con Ag A y Ag B (AB)
4. Eritrocito que no tiene ninguno

Basados en la proteína:
- Los que tienen la proteína
- Los que no tienen la proteína

Cuantos grupos posibles basados en el sistema ABO Rh tenemos? 8.

Cada uno de nosotros entra en alguno de esos grupos.

*Cual es el del “pueblo”? O

Estamos hablando de ANTIGENOS, que pasa con estos: pueden inducir

respuestas inmunes.
 Cuando un Ag induce una RI se le llama inmunogeno.

De acuerdo a los antígenos es que la persona puede ser trasfundida. Una

trasfusión se realiza cuando hay una perdida en el numero de eritrocitos.

 Los antígenos ABO son carbohidratos, inducen a la producción de Ac IgM,

son procesos Timo-independientes, no hay reacción del centro germinal.

 El antígeno Rh es proteico e induce a la producción de Ac IgM pero sobre

todo IgG. Son procesos Timo-dependientes y hay reacción del centro
germinal.

 CARBOHIDRATOS  IgM
 PROTEINAS  IgG

Frente a los Ag ABO y Rh hay un principio: no debo producir Ac contra los Ag de

mis eritrocitos, o sea que el principio mencionado anteriormente es frente Ag extraños, por que
frente a Ag propios no debe haber respuesta inmune. La consecuencia si contra Ag propios
se produjeran Ac seria la autoinmunidad.
Una persona produce Ac contra los Ag eritrocitarios que no tiene.

Ejercicio:
1) Haga un eritrocito y de acuerdo a esto (las formas de ABO y Rh dibujadas
en el tablero) dibuje su grupo sanguíneo.
 2) Entendiendo que el prefijo “Anti” indica la especificidad de anticuerpos,
escriba los anticuerpos “Anti” que usted tiene. Y para ayudarnos
recordemos el anterior enunciado: Una persona produce Ac contra los Ag
eritrocitarios que no tiene.

A tener en cuenta: A es un Ag, B es otro Ag, no existe el Ag AB. Los del

grupo sanguíneo Ab tienen los dos antígenos.

Ahora el Ag O existe? No. Ósea que el grupo sanguíneo O no es un Ag, es

ausencia de de los otros dos.

Voy a hacer un cuadro con los posibles grupos sanguíneos

Ahora pregunta de parcial:

Miren la pregunta: Un niño al momento de nacer se hemoclasifica y produce
anticuerpos contra el antígeno que no tiene, como se puede dar eso? Si se
supone que tenemos anticuerpos para los antígenos a los cuales nos hemos
expuesto?

Si yo soy grupo sanguíneo A como voy a tener anticuerpos anti B si yo no expreso

el antígeno B?
 Hay bacterias intestinales que tienen esos mismos antígenos (A y B) y ahí
es donde se da la exposición. Algunas cepas de bacterias contienen esos
mismos carbohidratos.
 Pero por que no produzco contra los que si tengo? Por la tolerancia
inmunológica.
 El Rh por su parte no esta en bacterias, pues este esta en eritrocitos. Ósea
que una persona con el Rh negativo, no tiene anti Rh, a menos que se haya
expuesto al antígeno Rh…que sea por eritrocitos, es decir que solo se
puede hacer por transfusiones o partos.

Si mi grupo sanguíneo es A, estoy expuesto al antígeno A y no produzco

anticuerpos contra el por que es mío, pero si produzco anticuerpos contra el B por
que hay bacterias que tienen el B.
Si soy A positivo pues el Rh es mío entones no voy a producir anticuerpos contra
Rh pero si soy A negativo cuando nazco no tengo esto y voy a producir anti B solo
si me expongo al antígeno Rh, que puede ser por transfusiones, embarazos,
accidentes.

Ahora con este principio es que salen las transfusiones sanguíneas. No se puede
transfundir con antígenos a los que una persona reaccione por que si lo hago van
a destruir el eritrocito.
Entonces si una persona tiene un grupo sanguíneo A..
 Lo puedo transfundir con unidades de sangre A? SI.
 Lo puedo transfundir con sangre B? NO ( por que esos anticuerpos
destruirían el eritrocito)
 Lo puedo transfundir con sangre O? SI, por que el eritrocito no tiene ningún
antígeno
 Si es positivo, puedo poner A positivo? SI
 Si es positivo, puedo poner O positivo? SI
 ….., …. A negativo? Si
 …..,….. O negativo? SI

Pero si yo soy A negativo..

 Me pueden poner A? SI
 Me pueden poner O?SI
 Me pueden poner A positivo? NO
 Me pueden poner A negativo? SI
 Me pueden poner O negativo? SI

Y cual es el riesgo de que me pongan A positivo? Reacción al Rh y produzca

anticuerpos contra ese Antígeno

*Completa el cuadro

 Con esto al grupo sanguíneo O se dice que le puede transfundir a quien? A

todos, por lo tanto se considera el donante universal
 Cual es el súper universal? O negativo
 Quien puede recibir de todos? AB

QUIZ

1. En el primer paciente hubo aglutinación en A, hubo aglutinación en B, hubo

aglutinación en D, ósea que es un AB positivo
2. Hubo aglutinación en A, no hubo aglutinación en B y hubo aglutinación en
D, es decir, es A positivo.

En donde se encuentre el antígeno va a aglutinar