GUÍA DE LABORATORIO N°4:

ENZIMAS

INTEGRANTES:
 MARQUEZ QUINTERO LINA MARCELA - 10501828595
 LOZANO GUARNIZO DANIELA SOFIA - 10501822551
 LARA MORA DANIELA - 10501821651
 MICAN PELAEZ DARLING DAYANA – 10501825725

GRUPO: 1

PROFESORA: DIANA GARCÍA VARGAS

OBJETIVOS:

 General

Describir la estructura y función de las enzimas, modos de inhibición y condiciones

óptimas para la actividad enzimática.

 Específicos

- Predecir como los cambios en temperatura y pH afectan la acción enzimática.

-Utilizar como modelo de estudio la catalasa, enzima capaz de catalizar la hidrólisis

del peróxido de hidrógeno y de la diastasa responsable de la hidrólisis del almidón.
 Usando el gotero, coloque 5 gotas del
homogeneizado sobre el vidrio de reloj y añada
PROCEDIMIENTO: tres gotas de peróxido de hidrógeno.

Reconocimiento de la catalasa I

Consigne sus resultados y observaciones. Tome

fotos.

Rotule cinco tubos de ensayo 1-5.

Añada 5ml de hígado homogeneizado a cada

tubo.

Mantenga los tubos a las siguientes

temperaturas (Ver Tabla 1).
Catalasa

Reconocimiento de catalasa II
Preparación del homogenizado :
- Corte pedazos pequeños de hígado de res.
Añada 10 gotas de peróxido de hidrogeno a los
- Colóquelos dentro del mortero junto con un poco de tubos 1 a 5.
agua hasta diluir parte de la muestra. Tenga cuidado
de no moler excesivamente para que no queden
pedazos muy pequeños del material.
- Fíltrelo utilizando el trozo de gasa.
- Pase el líquido filtrado a un tubo de ensayo Mida el tiempo transcurrido desde que se añadió
el peróxido hasta que se inicia la producción de
burbujas y regístrelo en la tabla.

Compare sus resultados en términos de tiempo

de reacción vs temperatura. Tome fotos

Rotule tres tubos de ensayo (1-3).

Añada 3 ml de homogeneizado de hígado a cada

tubo.

Añada 2 ml de: HCl 3M (Tubo 1), NaOH 3M

Efecto del pH sobre la catalasa (Tubo 2), agua destilada (Tubo 3) (Ver Tabla 2)
y agite suavemente hasta mezclar.

Añada 10 gotas de peróxido de hidrogeno a los

tubos 1 a 3. Mida el tiempo transcurrido desde
que se añadió el peróxido hasta que se inicia la
producción de burbujas y regístrelo en la tabla.

Compare sus resultados en términos de tiempo

de reacción vs temperatura. Tome fotos.
RESULTADOS

PARTE A

● RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA 1:

FIGURA 1. Reacción de la catalasa con peróxido de hidrógeno.

Al momento de agregar el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada) a la muestra de

homogeneizado de hígado de res, se observó una reacción evidente con un burbujeo
debido al desprendimiento de oxígeno.

● RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA 2:

Tabla 1. Efecto de la temperatura sobre la catalasa.

Tubo Temperatura Tiempo

1 80°C durante 15 min No hubo reacción

2 37°C durante 15 min 2,15 segundos

3 Temperatura ambiente (11°C) 2,10 segundos

4 Refrigerado por 30 min 2,60 segundos

5 Congelador (Hielo | - 4°C) por 30 min 3 segundos

Tabla 2. Efecto del pH sobre la catalasa

Tubo Reactivo Tiempo que toma la Observación

1 2ml HCl 3M
2 2ml NaOH 3M
3 2ml Agua destilada
reacción en
completarse
No hubo reacción Se pudo observar un
precipitado color café –
amarillo oscuro.
16,02 segundos El contenido mostró 2
fases, en la parte
superior un líquido color
amarillo oscuro y en la
parte inferior un líquido
color anaranjado ladrillo.
2,05 segundos Mantuvo su coloración,
sin embargo, el burbujeo
a causa de la liberación
de oxígeno, mostró una
mayor duración.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

● RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA 1

La catalasa es una enzima de óxido reducción que cataliza la descomposición del

peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada) en agua y oxígeno. [1]
2H2O2 + enzima --------> O2 + 2H2O.

En la reacción de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos

moléculas de peróxido de hidrógeno en la cual una funciona como donador y otra como
aceptor de electrones. El mecanismo de reacción se lleva a cabo en dos pasos. En el
primero la catalasa se oxida por una molécula de peróxido formando un intermediario
llamado compuesto I. El compuesto I se caracteriza por tener un grupo ferroxilo con FeIV
y un radical catiónico de porfirina. En esta reacción se produce una molécula de agua
(Reacción 1). En el segundo paso de la reacción, el compuesto I es reducido por otra
molécula de peróxido regresando la catalasa a su estado inicial y produciendo agua y
dioxígeno (Reacción 2). [2]

Reacción 1: Enz (Por-FeIII) + H2O2 → Compuesto I (Por+•-FeIV-O) + H2O

Reacción 2: Compuesto I (Por+•-FeIV-O) + H2O2 → Enz (Por-FeIII) + H2O + O2
El hígado es el órgano principal del “reciclaje” de hierro, ya que el hígado se basa en un
sistema amortiguador que consiste en monocitos derivados de médula ósea que
consumen los glóbulos rojos dañados en la sangre y se establecen en el hígado, donde
se convierten en los macrófagos transitorios capaces de reciclar el hierro, también, el
hígado contiene varias oxidasas, enzimas que pueden oxidar H de diversas sustancias
orgánicas. Los aminoácidos y los ácidos grasos pueden ser oxidados en los peroxisomas
en el metabolismo natural. Además, las enzimas de los peroxisomas oxidan sustancias
tóxicas como el alcohol. Por ello, son muy abundantes en el hígado, donde se tiene que
detoxificar del alcohol y otras sustancias nocivas. Un producto intermedio de las
reacciones de oxidación del metabolismo es el H₂O₂, un compuesto potencialmente
tóxico. Sin embargo, los peroxisomas contienen catalasa que descompone el H₂O₂ en
compuestos menos peligroso. [4]

Se pude determinar la presencia de la enzima catalasa en nuestra muestra

homogenizada de hígado de res, y se llegó a la conclusión de que la catalasa se
encuentra en alto contenido en el tejido que conforma este órgano vital para el animal,
pues como se mencionó anteriormente está en los peroxisomas de las células de este
órgano, esta afirmación se la fundamenta con el intenso y prolongado burbujeo que
existió al momento de colocar una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno en la
muestra de hígado.

● RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA 2

 Efecto de la temperatura sobre la catalasa:

La funcionalidad de la actividad enzimática se puede ver afectada principalmente por 3

por factores: Temperatura, concentración de sales y cambios en el pH. Las enzimas
hacen parte de las proteínas, y estas poseen estructuras tridimensionales que pueden
afectarse a causa de los factores ya mencionados, por lo cual, cada enzima tiene una
mayor eficiencia gracias a las condiciones óptimas que brinda su medio y favorecen el
desarrollo de su función. Figura 2

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC
de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por
enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta
temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la
actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. [3]. Entonces al llegar a la
temperatura óptima, se incrementa la velocidad de reacción enzimática, puesto que los
sustratos colisionan con los sitios activos con más frecuencia cuando las moléculas se
mueven con mayor rapidez. Mientras que, por encima de dicha temperatura, la velocidad
 decrece, dando paso a una
desnaturalización de la enzima, debido
a que la agitación térmica de la
molécula rompe los puentes de
hidrógeno, los enlaces iónicos y otras
interacciones débiles que estabilizan la
estructura activa, esto se evidenció al
colocar la enzima catalasa presente en
nuestra muestra homogenizada a 80
°C, ya que no observamos
desprendimiento de O2, por lo que se
determinamos que no ocurrió reacción
alguna. Figura 3.
FIGURA 2. Rotulación de 5 tubos con 5ml de hígado.

FIGURA 3. Observación de cada tubo después de su temperatura correspondiente .

Cuando nuestra muestra estuvo a 37 °C, reaccionó rápidamente, debido a que en el

bovino la temperatura óptima para el desarrollo de sus procesos metabólicos es de 38.3°C,
es decir que los 37°C están muy cerca de su temperatura óptima, por lo que la velocidad
de reacción fue máxima, permitiendo un mayor número de colisiones moleculares y una
conversión más rápida y efectiva de reactivos a productos, esto se observó claramente en
el desprendimiento casi inmediato de burbujas (O2) como reacción. [3]
 Por otro lado, cuando se disminuyó la
temperatura, la velocidad de reacción
de la enzima decrece rápidamente
debido a que el movimiento de las
moléculas es menor y chocan menos,
disminuyendo así la actividad catalítica
de la enzima, es decir, la
transformación de reactivos a
productos casi hasta anularse.

FIGURA 4. Adición de 10 gotas de peróxido de

hidrogeno a cada tubo.

Esto se observó, cuando se colocó la muestra temperatura ambiente (11 °C), pues el
tiempo de reacción fue menor comparado con el tubo expuesto a 37°C, de igual manera
sucedió con las muestras puestas en el refrigerador y en el congelador por 30 min, su
reacción disminuyó proporcionalmente a la temperatura.

IMAGEN 1. Efecto de la temperatura sobre la enzima

 Efecto del pH sobre la catalasa:

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -
SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio,
estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la
conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH
en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el
llamado pH óptimo. [5]
Todas las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias
maneras:

-El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden
variar con el pH.

-El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Sabiendo que las enzimas son proteínas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el
carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las
propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la
desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación. El pH del peróxido de
hidrógeno en conjunto con nuestros reactivos no afecta la actividad enzimática como tal,
sino la concentración de protones – iones de Hidrógeno. Estos además de alterar la
estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar también en la reacción como
sustrato o producto. En esos casos, la concentración de Hidrogeniones afecta
directamente la velocidad de la reacción. Siendo el 7,6 el pH óptimo de la catalasa (Figura
3) se observaron los siguientes resultados:

IMAGEN 2 - pH óptimo de la catalasa

REACTIVOS MUESTRA ¿REACCIONÓ? IMAGEN ANALISIS
No se presentó reacción
catalítica alguna debido a
que, al adicionar el ácido
(dador de iones de Hidrógeno,
H+), el pH de la solución se
HCl (Tubo 1) HIGADO NO alteró en cuanto la
concentración de
hidrogeniones. Lo que generó
que al ser este pH ácido
hubiera una disminución total
en la velocidad de la
reacción al punto de anular
la actividad enzimática.

Para este tubo se presentó

una actividad enzimática
lenta, pues al añadir nuestra
base (aceptor de iones de
Hidrógeno, H+), el pH se tornó
básico, desnaturalizó nuestra
NaOH (Tubo 2) HIGADO SI enzima, es decir
disminuyendo
considerablemente la
velocidad de la reacción
catalítica,

Presenta reacción catalítica

sin ningún tipo de alteración
esto debido a que la enzima
se encuentra en condiciones
AGUA optima de pH, por ende, la
enzima conserva su
DESTILADA HIGADO SI
(Tubo 3) estructura tridimensional así
que puede llevar a cabo su
proceso catalítico.
 1. Llevar la cebada germinada a un mortero, cubrala
Reconocimiento de la
con 5 ml de agua destilada y macere hasta obtener un
extracto lechoso.

2. Filtrar el extracto lechoso, colecte el liquido filtrado

Diastasa

en un tubo de ensayo y proceda a centrifugarlo.

3. Tomar dos tubos de ensayo (A Y B) y agregarle 2 ml

de sobrante del producto de la centrifugacion, calentar
el tubo B por 5 min hasta ligera ebullicion y dejarlo
enfriar, luego a cada tubo agregarle 0,5ml de almidon
al 1%

4. Dejar reporar por un lapso de 10 min y luego

agregar 3-4 gotas de la mezcla (A Y B) en dos vidrios
de reloj y adicionar a cada uno 1-2 gotas de lugol
PARTE B

ANALISIS DE RESULTADOS

Las enzimas son encargadas de acelerar o de contribuir en las reacciones químicas como
desdoblar moléculas más grandes. Durante la práctica se comprueba el funcionamiento
de la enzima. Por otro lado, la concentración de esta afecta el producto final de la reacción,
además se pueden ver afectadas por factores como son la temperatura, la concentración
de la enzima o del tiempo que puede ser proporcional o no a este.

La diastasa es una enzima de origen vegetal que se encuentra en determinadas semillas

germinadas y otras plantas. Su función es la de catalizar la hidrólisis, primero del almidón
en dextrina e inmediatamente después, en azúcar o glucosa. La alfa amilasa degrada el
almidón en una mezcla de disacáridos: maltosa, maltotriosa trisacárido la cual contiene
tres α (1-4)-residuos de glucosa y o ligosacáridos conocidos como dextrinas, que

contienen la α (1-6) ramas de glucosa. [6]

La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en las plantas, pero abunda más
en aquel que ha sido parcialmente germinado.

 GERMINACION DE CEBADA: La cebada germinada es tan alta en cuanto al

contenido en amilasa que la industria (incluida la dietética y la farmacéutica) utilizan
este brote para extraerle sus enzimas y preparar con ellas productos “digestivos”
que ayuden a las personas con mala tolerancia a los almidones (la mayoría de los
cuales no necesitarían recurrir a estos productos si aprendiesen a comer los
alimentos amiláceos correctamente combinados). Así pues, tenemos que la
cebada germinada, y la leche que se prepara con la misma, es un gran enzimático
 que puede ayudar a digerir los almidones y las grasas. Como son demasiado duros
se suelen tomar sus brotes cocinados más que crudos, especialmente en forma de
sopas de vegetales.

La cebada llevo a cabo un proceso de homogenización al causar una ruptura y se lleva

a cabo mediante la acción de moler el tejido con el mortero y con la licuadora y luego
una centrifugación donde la fuerza gravitacional creciente hará que se sedimenten
diferentes componentes de las células, la enzima se mantiene disuelta gracias a su
interacción con el agua, al haber menor agua disponible para hidratar las proteínas
estas comienzan a interactuar hidro fóbicamente entre ellas.

RECONOCIMIENTO DE LA DIASTASA

 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA DIASTASA: En la enzima el

aumento en la temperatura mostró que esta enzima posee una resistencia al calor
y esto se evidenció en el tiempo tan prolongado que tuvo que exponerse a este
para lograr una reacción. Tomando como referencia que esta enzima a 70°C
conserva un 70% de su actividad enzimática vimos que al cumplirse los cinco
minutos de la muestra sometida al calor se observa que no hubo mayor reacción
diferente a la liberación de calor en el tubo de ensayo.

FIGURA 5. En cada tubo 2 ml de sobrenadante, producto después de la

centrifugación. FIGURA 6. Tubo de ensayo calentado con un lapso de 5 minutos.
  SOBRENADANTE CALIENTE Y ALMIDON AL 1%: debido a que esta contiene
diastasa y otras enzimas al exponerla al calor el almidón sufre una decoloración
debido a la presencia de dichas enzimas Figura 7. El sustrato de almidón se inocula
con la muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática, que se determina por el
agregado de solución de yodo, el que produce coloración con el remanente de
almidón no hidrolizado. La disminución del color que se produce en los tubos de
ensayo después de incubarlos, con respecto a un testigo, no dará idea de la medida
de la actividad diastática de la muestra, que se expresa en escala Gothe.
La concentración del sustrato (almidón) dispone la labor enzimática debida con la
velocidad de la catálisis enzimática [8].

FIGURA 7. De la mezcla (A-B) 3-4 gotas de cada tubo con almidón al 1% y 2 gotas de
Lugol.

CONCLUSIONES
1. Se evidenció que tanto la temperatura como el pH influyen directamente en la
actividad enzimática, ya que estos en condiciones no óptimas producen la
desnaturalización de las proteínas y por lo tanto alteran el adecuado funcionamiento
de las mismas.
2. Se realizó un comparativo funcional de las condiciones óptimas y desfavorables
para que las enzimas catalasa y diastasa fueran reconocidas, denotando así que
las mismas presentan diferencias estructurales y funcionales. Una diferencia es que
la diastasa al estar compuesta de la alfa- amilasa y la beta- amilasa se desnaturaliza
con una temperatura muy baja a diferencia de la catalasa que lo hace a
temperaturas altas.
3. La concentración de el sustrato es un factor principal porque de este depende la
saturación de la enzima.
4. Las condiciones de operación de las enzimas están delimitadas por las propiedades
específicas de cada una como las físicas y las químicas del sustrato sobre el que va
intervenir.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Lledías F., Rangel P, Hansberg W. Oxidation of catalase by singlet

oxygen. JBC. 1998;273(10630): 10630-10637.
[2]. Díaz, A. La estructura de las catalasas. REB. 2003;22(1665-1995): 76-84.
[3] Neil A. Campbell, Jane B. Reece. Biología. 7ma Ed. Madrid. Ed. Médica
Panamericana, 2007. pág. 154.
[4] Bohinski, R. Bioquímica Addison Wesley Longman. 1ra Ed. Ed. Rétreve. México.
1986, pág. 230.

[5] Claude A. Villee, Biología, 7ma Ed, Editorial McGraw-Hill, 1996. pág. 134 - 137.

[6] M, Dumas, Luciano Martinez.Tratado de quimica aplicada a las artes.Tomo

VII.Facultad de Ciencias Quimica Madrid.Madrid.1847.pag 122-130.

[7] AGUIRRE OBANDO, O.A.; MORALES ÁLVAREZ, E.D.: Reconocimiento

decarbohidratos.Universidad de Quindio.Facultad de Educación. Pag 110-112

[8] Alan Fersht.Estructura y mecanismo de los enzimas.Editorial everte

S.A.Barcelona.1980.Pag 23-30