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Materiales y Métodos:

Aislamiento de microorganismo
Los microorganismos fueron aislados de muestras de sedimentos de aguas
residuales con grasas provenientes de un restaurant de comida rápida. Para el
aislamiento se utilizó el método de siembra por extensión en superficie sobre
ASD o Czapek a 25°C.
Las cepas seleccionadas fueron purificadas por siembra en medio de cultivo
sólido PDA (papa dextrosa agar, Merck) a 25-30°C por 72 horas. Posteriormente,
cada aislamiento fue conservado por triplicado en microtubos con caldo
conteniendo glicerol al 40% y almacenados a -20°C.
Microorganismos y desarrollo de los cultivos
Se empleó un medio de cultivo con la composición siguiente (g/L): NaH2PO4 12;
KH2PO4 2; MgSO4.7 H2O 0,3; CaCl2 0,25 y como fuentes de nitrógeno y
carbono sulfato de amonio al 1% y aceite de oliva al 2% respectivamente
Para el cultivo del hongo se tomaron alícuotas de las soluciones de esporas y
se adicionaron a 20 mL de medio estéril contenidos en erlenmeyers de 100 mL,
de modo que la concentración final en el medio fuera de 106 esporas/mL. El
cultivo se desarrolló a 30 ºC y 100 rpm 8 días.
Obtención del crudo enzimático
Los cultivos de hongos se filtraron y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante
5 min. Los sobrenadantes obtenidos que contienen los crudos enzimáticos de
lipasas extracelulares colectados se congelaron a 0 ºC para su posterior análisis.
Efecto del pH en la producción de la enzima.
Para la determinación del pH óptimo de crecimiento del microorganismo y para
la producción de la enzima
El efecto del pH en la actividad lipolítica se estudió a 37 ºC y se varió el pH del
medio de reacción desde 4 hasta 10 consecutivamente. La influencia del pH en
la estabilidad de la enzima fue estudiada por la exposición del crudo enzimático
a valores de pH de 4 y 5 (tampón acetato de sodio 0,05 M), 6 y 7 (tampón fosfato
de sodio 0,05 M), 8, 9 y 10 (tampón carbonato de sodio 0,05 M) y a 30 ºC durante
5 h y se determinó la actividad residual, la cual se expresó como un porciento de
la actividad inicial que presentó la enzima
Cada valor de pH se ensayó por triplicado. Con el control negativo (medio de
cultivo sin inóculo) se hizo el mismo procedimiento, así, como también con el
control positivo
Purificación parcial de la enzima y electroforesis en gel
El microorganismo seleccionado se cultivó en 250 mL del medio de cultivo
mínimo FAM + aceite de oliva (1% v/v) a 30°C, por 48 horas a pH 8.0 a 250 rpm.
Luego se centrifugó a 8500 rpm por 15 minutos a 4°C y el sobrenadante se hizo
pasar a través de un filtro de 0,45 micras. Las proteínas allí presentes, fueron
precipitadas con acetona y etanol [12]. Los precipitados se resuspendieron en
25 µL de Tris HCl 100 mM pH 7,0, para ser separados por electroforesis en gel
de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 10 y 12% y
determinar el peso molecular de las proteínas parcialmente purificadas. Se
utilizaron como marcadores una mezcla de estándares de alto peso molecular
para electroforesis SDS (Sigma). Los geles fueron teñidos con azul de Coomasie
R-250 y nitrato de plata.

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