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Ramkumar Dhandapani
El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -graphein
que significa escribir. El primer uso registrado de la cromatografía en columna se le otorga al
científico ruso Mikhail Tsvet que trituró carbonato de calcio en un tubo y posteriormente
agregó hojas de una planta verde homogeneizadas, seguido de un solvente orgánico. Tsvet
observó bandas de colores separadas a medida que el solvente pasaba a través del tubo. Así es
como la cromatografía práctica comenzó al principio, separando con éxito varios pigmentos de
las hojas. En el mundo de hoy, hay muchos analitos que son incoloros y están separados por
técnicas cromatográficas, todavía se le conoce con el mismo nombre.
Es un tipo de cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace pasar una
mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase
móvil. La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene la fase
estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la
interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria.
Es una tecnología basada en el principio de que un tamaño de partícula menor conlleva una
mayor eficiencia, rápidas separaciones con mayor resolución y sensibilidad. Sin embargo, para
resistir la presión extrema de las partículas más pequeñas de 2 µm, el equipo necesita ser capaz
de trabajar a alta contrapresión. La eficiencia de estas columnas no debe perderse en el resto del
equipo, debido al volumen muerto, por ello se diseñaron equipos capaces de trabajar a altas
presiones.
Debido a que los instrumentos de UHPLC tienen un coste elevado, a finales del 2000,
Phenomenex lanzó las columnas Kinetex 2,6 μm con tecnología Core-Shell, que proporciona
un rendimiento UHPLC en un equipo HPLC tradicional. De esta forma se puede utilizar el
instrumento de HPLC tradicional que se posee en el laboratorio y lograr un rendimiento
equivalente de UHPLC.
Modos de separación.
Hay muchos modos de separación en cromatografía y cada uno tiene sus propios principios.
A continuación presentamos una guía de selección de columnas de HPLC para ayudar a los
lectores a elegir el modo de análisis correcto. Aunque hay muchos modos de separación
disponibles para resolver las mezclas en un cromatógrafo la separación mediante Fase Reversa
(RP) es el modo más común en cromatografía líquida.
La respuesta es simple:
El uso de una fase estacionaria no polar, con una fase móvil polar ayudó a separar estos analitos
hidrofóbicos. Dado que esta práctica es inversa a la fase normal, se utiliza el término fase
reversa. Esto es similar a llamar a un jugador de ping-pong derecho como normal y un jugador
de ping-pong zurdo como el original.
Proceso de separación en Fase Reversa
Ahora que sabemos que el modo más popular de cromatografía líquida es la fase reversa,
vamos a explorar cómo funciona.
Esto incluye:
1. Interacciones hidrofóbicas
2. Interacciones polares
3. Interacciones iónicas
Interacciones Hidrofóbicas
Ésta es una interacción débil y transitoria entre una fase estacionaria no polar y las moléculas,
que incluye interacciones hidrofóbicas y de van Der Waals. Se puede predecir una estimación
razonable de la retención basada en el valor Log P, o coeficiente de coeficiente de reparto
octanol-agua. El Log P es la Relación entre octanol y agua en una extracción líquido-líquido.
En otras palabras, cuanto más hidrofóbica es una molécula, mayor es el valor de Log P que
tiene, lo que se traduce en mayor retención en RP-HPLC.
Interacciones Polares
Estas son interacciones que ocurren entre los grupos funcionales polares de los analitos.
También se producen entre silanoles residuales, grupos polares incrustados, grupos polares
superficiales o grupos terminales polares en la fase estacionaria. Interactúan con el analito a
través de enlaces de hidrógeno y dipolo-dipolo. Estas interacciones son relativamente débiles y
transitorias en comparación con la interacción de intercambio iónico.
Interacciones de Intercambio Iónico
Escala semi – preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar pequeñas
cantidades (inferior a 0.5g).
Escala preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar cantidades mayores
(superior a 0.5g).
Para trabajar a estos niveles es necesario modificar algunas características del equipo de HPLC,
entre ellas los volúmenes de solvente utilizado y tipo de material de empaque (selectividad del
sistema). Pero, para soportar las cantidades específicas de cada método, es necesario tener una
columna apta para cada escala, por lo cual se debe modificar el tipo de volumen de la columna (que
implica cambiar de columna, ver tabla 1).
Para esto existen diferentes tipos de columnas, de diferentes diámetros, largos, materiales de
empaque y tipo de material de construcción; capaces de resistir altas presiones y ser totalmente
inerte a reaccionar con los componentes de la muestra. Entre estos se encuentran: los construidos
en plástico, en vidrio o en acero inoxidable.
A partir de esto se desprenden varias definiciones acerca de la capacidad del equipo para separar
los componentes de la muestra, a esto se le llama Resolución y la conforman dos habilidades: La
separación mecánica (Eficiencia) y la separación química (Selectividad).
Por ejemplo: Una columna el doble de larga puede mejorar la separación de dos picos, pero
duplicaría el tiempo de corrida y la presión necesaria para hacer fluir el solvente, también al doble.
Si por el contrario, se utiliza la misma columna inicial pero rellena con un tamaño de partícula dos
(2) veces menor, es posible obtener picos en mejor resolución con el mismo tiempo de retención
pero con un aumento en la presión hasta veinticinco (25) veces mayor.
Por otro lado, mejorar la Selectividad es el método más efectivo para lograr una mejor separación
sin tener que modificar la columna o sus características. Esto se realiza mediante una correcta
selección del solvente (puro o mezcla), con su respectivo gradiente; de modo que la interacción de
la muestra, con la fase estacionaria y la fase móvil, sea selectiva para cada tipo de componentes,
logrando la separación de la muestra.