PERFIL DE YESOTOXINAS EN MOLUSCOS PROCEDENTES DE LA

REGIÓN DE LOS LAGOS, ASOCIADO A FLORACIÓN DE

PROTOCERATIUM RETICULATUM
X. Vivanco1, G. Pizarro2, B. Paz3, P. Álvarez-Chaver3, C. Hernández4 y C. Zamora2
1Institutode Fomento Pesquero (IFOP), Puerto Montt, Chile; 2Instituto de Fomento Pesquero (IFOP), Punta Arenas, Chile;
3Servicio Determinación Estructural, Proteómica y Genómica, Unidad de Proteómica, Centro de Apoyo Científico y Tecnológico a la Investigación (CACTI), Universidad de Vigo, Vigo, España;
4Laboratorio Ambiental Llanquihue, Seremi de Salud de Los Lagos, Puerto Montt, Chile

ximena.vivanco@ifop.cl

Introducción
Las yesotoxinas (YTXs) son toxinas con estructura de poliéter di-sulfatado, de
efectos cardiotóxicos (Terao et al. 1990) en ratones. Estas provocan la muerte
cuando son inyectadas por vía intraperitoneal, no así si se les administra
oralmente (Aune et al. 2002, Miles et al. 2004). No tienen efectos diarreogénicos
en los humanos (e.g. Ogino et al. 1997), sin embargo producen falsos positivos
al utilizar el bioensayo de ratón en la detección del veneno diarreico de los
mariscos (VDM,i.e. ácido okadaico y sus derivados las dinofisitoxinas). Las
yesotoxinas han sido detectadas en moluscos de Japón, Noruega, Nueva
Zelandia, Italia, Chile, España, Canadá y Rusia (Paz et al. 2008).
Las especies de microalgas productoras de YTXs son Protoceratium reticulatum,
Lingulodinium polyedrum y Gonyaulax spinifera, siendo la primera la más citada
mundialmente en relación a los episodios tóxicos que provoca (e.g. Miles et al.
2005, Paz et al. 2008).
En Chile, las YTXs fueron reportadas por primera vez en moluscos procedentes
de la región de Aysén (Yasumoto & Takizawa 1997) y, al igual que en el resto del
mundo, de las tres especies productoras, la más frecuente en presencia y
abundancia a lo largo del país ha sido P. reticulatum (e.g. Álvarez et al. 2011,
Guzmán et al. 2010).
En este trabajo se presenta el perfil de toxinas en choritos (Mytilus chilensis) y
cholga (Aulacomya ater) recolectados en diferentes localidades de la región de
Los Lagos (Figura 1) durante 2011, durante y posterior a un episodio de floración
de P. reticulatum y asociado a mortalidades anómalas por bioensayo de ratón
para la detección de Veneno Diarreico de los Moluscos (VDM).
Figura 1. Localidades de origen de muestras de choritos, fitoplancton y quistes en
sedimentos recolectadas en la región de Los Lagos durante el año 2011.
Materiales y métodos
Toma de muestras y análisis:
Período: Abril a Agosto 2011
Fitoplancton cualitativo: Arrastres verticales 20m-superficie con red de 20
Abundancia relativa y Nº falsos positivos VDM
Imágenes SEM de Protoceratium
reticulatum durante la floración de 2011
Resultados
• Durante enero a marzo de 2011 se observa un aumento de abundancia relativa
y densidad de Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum (Fig. 2).
• Inicio de la detección de mortalidades anómalas con bioensayo ratón
(mortalidades > 22 hrs, sin síntomas característicos) con 1 mes aprox de
desfase de inicio bloom P. reticulatum, y mantención hasta después de
disminución de floración en el área.
• Las mayores abundancias relativas y densidades de estas especies se
observaron en estaciones del Estuario y Fiordo Reloncaví, mientras que las
mayores abundancias de quistes en sedimento se observaron en la costa W
del Seno Reloncaví, máx de 325 quistes/cm3 de sedimento en Chayahué
(L04N3) en abril.
• 8 de 10 muestras analizadas fueron positivas sólo a la presencia de YTXs
(Tabla 1). Las muestras negativas corresponden a muestras colectadas en ago
2011, coincidiendo con bajas abundancias de especies nocivas, pero con
presencia menor de falsos positivos.
• Los cuatro iones mayoritarios detectados corresponden a [M-2Na-SO3]-, de la
YTX con m/z 1061, 45-OH-YTX con m/z 1077, 45-OH-carboxi-YTX con m/z
1109 y carboxi-YTX con m/z 1095. Las tres últimas corresponden a productos
del metabolismo de la YTX por los moluscos (Miles et al. 2005, 2006, Paz et al.
2007).
• El espectro del estándar de YTX, cuyo ión detectado es el [M-2Na-SO3]- con
m/z de 1061, incluye además un isómero desconocido con m/z 1077 [M-2Na-
SO3]-. (Fig 3, superior).
• Los iones detectados en un ejemplo de espectro positivo corresponden de
mayor a menor porcentaje de intensidad relativa a 45-OH-carboxi-YTX con m/z
1109 (42%), seguido por el 45-OH-YTX con m/z 1077 (29%) y Carboxi-YTX
con m/z 1077 (22%), siendo el ión precursor YTX con m/z 1061 el ión
minoritario (Fig. 3, inferior).
8
7 1.400
Imágenes SEM de Dinophysis
acuminata durante la floración de 2011.
Figura 3. Espectros de masas del estándar de YTX (superior) y extracto metanólico
de una muestra de chorito (Nº 29) (inferior).
Discusión
• El perfil descrito en este estudio coincide en general con el reportado por
Yasumoto & Takizawa (1997) en relación a la presencia de YTX y el análogo
45-OHYTX
• Ambos fueron detectados previamente en el archipiélago de Chonos, Aysén en
1991, utilizando cromatografía líquida con detector de fluorescencia en
choritos.
• La disponibilidad de hoy día de tecnologías como el LC-MS hace posible
confirmar la presencia de éstos y otros análogos derivados producto de la
transformación por los moluscos como ocurrió en este estudio; sin embargo, la
existencia de una diferenciación geográfica en los perfiles tampoco es posible
descartarla sin tener otros registros con los cuales comparar.
• No obstante se registró una importante abundancia de Dinophysis acuminata,
no apareció reflejada en los perfiles la toxina que ha sido asociada a este taxon
en el país, correspondiente a PTX2 (Blanco et al., 2007, Fux et al. 2011), esto
es, no es una especie productora de okadatos.
• Los resultados confirman una alta probabilidad de obtener falsos positivos en la
detección de VDM por el bioensayo de ratón en la región de Los Lagos debido
a la presencia de YTXs en los moluscos en ausencia de okadatos, y que
pueden ser asociados a la ocurrencia de floraciones de Protoceratium
reticulatum previas en el área.
• El desfase que se observa entre el máximo de abundancia de Protoceratium
reticulatum en el plancton en muestras cuali y cuantitativas y la detección de
estas toxinas en los moluscos, permitiría contar con un rango de anticipación
frente a estos eventos, para efectos de descartar posibles cierres de áreas
1.600 afectadas por ellos.

6 1.200
um, análisis con microscopio epifluorescencia con método de abundancias
5 1.000
relativas (Guzmán et al. 2010)
Densidad (cél/L)

Fitoplancton cuantitativo: Integración de manguera superficie-10m, análisis 4 800 Bibliografía

con método de Utermöhl en cámaras de sedimentación de 10 mL. 3 600
Quistes en sedimentos: mediante buceo autónomo muestra de 3 cm de Álvarez, G. etal 2011. Bloom of the Yessotoxin producing ... J. Sea Res. 65: 427–434.
2 400 Aune, T. et al., 2002. Comparison of oral and intraperitoneal... Toxicon 40, 77–82.
profundidad, análisis usando metodología de Matsuoka y Fukuyo (2000).
1 200 Blanco, J. et al., 2007. Identification of pectenetoxins... Toxicon 49, 710 - 716.
Mariscos: mediante buceo autónomo, análisis inicial con bioensayo de ratón Fux, E. et al., 2011. Toxin profiles of five geographical isolates... Toxicon 57, 275 - 287.
modificado por Yasumoto et al. (1984), y selección de réplicas para obtención 0
17 ene - 24 feb - 21 mar - 15 abr - 17 may - 16 jul -
0
Guzmán, L. et al., 2010. The relative abundance as a tool... 15th Int. Conf. on Harmful
de perfiles de toxinas. 8 feb 11 8 mar 11 9 abr 11 5 may 11 3 jun 11 6 ago 11
Algae 2010, 1-5 Nov, Creta, Grecia. Abstract book, p. 293.
VDM falsos positivos Abrel D. acuminata Abrel P. reticulatum Matsuoka, K. & Y. Fukuyo. 2000. Technical Guide... WESTPAC-HAB/WESTPAC/IOC. Diseño: Mario Recabal M. / Ediciones y Producción / IFOP

Extracción de toxinas: Dens. D. acuminata Dens. P. reticulatum 77 p.

Técnica: Espectrometría de masas MALDI-TOF (matrix-assisted laser Miles, C.O. et al., 2004. Isolation of a 1,3-enone isomer... Toxicon 44, 325–336.
desorption/ionization time-of-flight) Figura 2. Valores promedio abundancias relativas, densidades de las especies Miles, C.O. et al., 2005. Evidence for numerous analogs... Harmful Algae 4, 1075–
Extracción de YTXs: Metanol 100%, relación 1:1 (peso de carne: 2-5 g), Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum de estaciones monitoreadas en el 1091.
área y nº de muestras con mortalidades anómalas (falsos positivos) de bioensayo de Miles, C.O. et al., 2006. Identification of 45-hydroxy-46,47-dinoryessotoxin,...Toxicon
maceración, mezcla, centrifugado a 6000 rpm por 20 min. Sobrenadante
ratón durante el período enero-agosto de 2011. 47: 229–240.
trasvasijado a vial ámbar de 5 mL y secado con nitrógeno gas a 40 ºC y
resuspensión en 200 µL. Limpieza de 5 µL del extracto metanólico de la Ogino, H. et al., 1997. Toxicologic evaluation of yessotoxin. Nat.Toxins 5: 255-259.
Tabla 1. Paz, B. et al., 2007. Yessotoxins profile... Toxicon 50: 1–17.
muestra resuspendidos en 10 µL de acetato amónico 50 mM eluyendo 10x por
Formas iónicas, m/z e intensidad relativa del estándar de YTX (superior) y de Paz B. et al., 2008. Yessotoxins, a group of... Marine Drugs 6, 73-102.
Zip-Tip (Tip size P10, Millipore) previamente acondicionadas 3x con 10 µL de Paz B. et al., 2011. Preliminary study for rapid determination of phycotoxins... Rapid
extractos de choritos (inferior).
MeOH y 10 µL de acetato amónico 50 mM. Lavado con 10 µL de MeOH 20% Commun. Mass Spectrom. 25: 3627–3639.
por 3x para finalmente eluir con 5 µL de MeOH 70%. YTX Isómero ?
Terao, K. etal 1990. Histopathological studies... Toxicon 28: 1095-1104.
[M-2Na-SO3]- [M-2Na-SO3]-
Análisis: Alícuotas de 2 µL de metanólico limpio depositados junto con 2 µL Estándar YTX
m/z 1061 1077
Yasumoto, T. et al., 1984. Diarrhetic shellfish poisoning. Pp. 207-214, in: E. P. Ragelis
de matriz DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico) en la placa MALDI AnchorChip. Int. Rel. (%) 94 6 (ed.). SeaFood Toxins, ACS Symp. Series 262, Am. Chem. Soc., Washington, D.C.
Estándar de YTX : NRC (National Research Council Canadá). 45-OH- carboxi- Yasumoto, T., Takizawa, A. 1997. Fluorometric measurements... Biosci. Biotech.
YTX 45-OH-YTX
Registro de espectros: rango de m/z entre 600 y 2000, en modo reflector carboxi-YTX YTX Biochem. 61:1775-1777.
[M-2Na-SO3]- [M-2Na-SO3]- [M-2Na-SO3]- [M-2Na-SO3]-
negativo.
(Nota: c.e. : cuerpo entero; h.: hepatopáncreas)

m/z
Iones detectados: [M-Na]- y [M-2Na-SO3]-. Nº est. Fecha Localidad Transvector
Int- rel %
1061 1077 1109 1095

L03 4-abr-2011 La Arena C2 chorito h. muestra 27 6 60 17 16

L02 6-abr-2011 Yates C2 chorito h. muestra 28 30 26 25 19
L02N2 6-abr-2011 Cochamó C2 chorito h. muestra 29 7 29 42 22
L03 29-abr-2011 La Arena C3 chorito c.e. muestra 22 - 100 - - Financiamiento
L02N2 1-jun-2011 Cochamó C4 chorito c.e. muestra 23 8 37 5 50 Manejo y monitoreo de las mareas rojas en las regiones de Los Lagos, Aysén y Magallanes (V Etapa)
L02 1-jun-2011 Yates C4 chorito c.e. muestra 24 8 28 46 18 2011/12 – SUBPESCA;
L03 2-jun-2011 La Arena C4 chorito c.e. muestra 25 85 11 - - Monitoreo complementario (73 estaciones) de las mareas rojas en las regiones de Los Lagos, Aysén y
L01 3-jun-2011 Metri C4 cholga c.e. muestra 26 56 44 - - Magallanes 2011/12 - Subsecretaria de Salud Pública;
H 31-ago-2011 Huelmo chorito c e. muestra 30 - - - - Monitoreo de Alexandrium catenella en zona no declarada y colindante al norte de la actual área FAN
Q 31-ago-2011 Quillaipe chorito c.e. muestra Q - - - - de A. catenella, Región de los Lagos – SUBPESCA-ASIPA.