PRÁCTICA IV

MEDIOS DE CULTIVO

1. Introducción
Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicación de los
microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio
de cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrógeno, debe presentar un
equilibrio ácido – base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes
(esterilizado en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo según su naturaleza

1.1.1 Naturales
a. Origen animal: Leche, huevos.

b. Origen vegetal: Papas.

1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composición química conocida y
constante ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo según su utilidad

1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos. Entre ellos están el caldo común, agar común, caldo nutritivo
y agar nutritivo.

Caldo común (g/L)

Peptona 10,0

NaCl 5,0
Agua destilada csp 1000
mL
pH 7,0

Agar común (g/L)

10,0
Peptona
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000
mL
pH 7.0
1
Caldo nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5 ,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000
mL pH 7,0

Agar nutritivo (g/L)

Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000
mL pH 7,0

2
 1.2.2 Medios especiales
a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega
fluidos orgánicos como sangre, yema de huevo, suero, etc.
Agar sangre
Agar común fluidificado y enfriado a 45 °C 95
mL Sangre citratada 5
mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un

determinado grupo de microorganismos e inhiben a otros acompañantes. Ejemplo: agar
Chapman, agar azida de sodio.
Agar Chapman (g/L)

Peptona 10,0
Extracto de carne 1,0
NaCl 75,0
Manitol 10,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4
rojo)
pH 7,4
c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un
sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo
de microorganismos y a la vez los diferencian según la utilización del sustrato.
Ejemplo: Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)

Peptona 17,0
Peptona proteosa 3,0
Lactosa 10,0
Sales biliares 1,5
Cristal violeta 0,001
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)
pH 7,1

3
 d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad
bioquímica de los microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH.
Ejemplo: Agar TSI, Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)

Peptona 5,0
Extracto de Levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Cítrato amónico férrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0, 04
Púrpura de bromocresol 0, 02
Agar 15 g
Agua 1 000
mL
pH 6,7
1.3 Clases de medios según su consistencia

1.3.1 Líquidos
1.3.2 Sólidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un
polisacárido extraído de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de
licuarse a 80 – 100 °C y de solidificarse a 40 °C. Así mismo, el agar no es
degradado por las bacterias.
1.3.3 Semisólidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos
2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiología.

2.2 Adquirir destreza en la preparación y esterilización de medios de cultivo.

3. Procedimiento

3.1 Preparación y esterilización de medios de cultivo

a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un
matraz y adicionar la cantidad de agua destilada requerida.
b. Disolver en Baño María.

c. Enfriar y ajustar el pH según convenga.

4
 d. Colocar un tapón de algodón en el extremo superior del matraz, cubrirlo con
papel y asegurar con pabilo.
e. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión durante 15 minutos.

3.2 Metodología para servir medios de cultivo

a. Fluidificar los medios sólidos al calor, enfriar a 50 °C y frente a la llama del mechero
servir en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar
solidificar. En el caso de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.

b. Servir los medios líquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

5
 3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos
a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 °C.

b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algún

microorganismo (contaminante).

6
Figura 4.1 Metodología para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo sólidos y
líquidos.
7
4. Referencias bibliográficas
Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª ed.)
Madrid,España: Parson Educación, S.A.

8
 PRÁCTICA V
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
1. Introducción
Sembrar es la acción de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o
sustrato que permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser
para aislamiento y para trasplante.
La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo
común ésta presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los
microorganismos. Generalmente se utiliza la técnica de agotamiento en superficie sólida
o aislamiento en estría simple. Cuando se desea contar el número de bacterias se utiliza
la técnica de placa vertida. La siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo
de estudio contiene una sola especie microbiana (cepa). También se denomina
“repique”. El objetivo es el mantenimiento del microorganismo conocido cambiándolo a
un nuevo medio de cultivo.
La siembra por trasplante puede ser:
 De un medio sólido a otro medio sólido
 De un medio sólido a un medio líquido
 De un medio líquido a otro medio líquido
 De un medio líquido a un medio sólido

2. Objetivos
- Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple.

- Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida

- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento

3.1 Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple

Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biológica.
 Tomar una alícuota de la muestra (inóculo) y depositarla en uno de los extremos
superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente
servido y controlado.
 Realizar movimientos en zig – zag (estrías) muy juntos en el primer tercio de la
placa para agotar el inóculo. Posteriormente realizar estrías muy separadas de un
extremo a otro lado de la placa no tomando nuevo inóculo ni levantando el asa hasta
concluida la siembra en toda la placa.
 Incubar a 37 ºC (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

9
 Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusión en placa o placa vertida

Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biológica.
 Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una
placa de Petri estéril y vacía.
 Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 – 50 °C.
 Homogenizar por movimientos de rotación de la placa de Petri para la
dispersión de microorganismos en forma más o menos homogénea, hasta la
solidificación.
 Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
 Realizar el recuento de colonias.

3.3 Obtención de un cultivo puro de bacterias

10
 a. Tratamiento de la muestra
Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de
laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de
muestras biológicas que pueden ser de varios tipos:
a.1 Muestras que contienen abundante número y tipo de microorganismos en las
que previamente se deben realizar diluciones en solución salina fisiológica estéril.
Ejemplo suelo.
a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se
desea investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el
número del microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo
leche.
a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el
microorganismo investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningún pre-
tratamiento. Ejemplos sangre,

b. Aislamiento primario
Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento
primario a través de la siembra en placa de Petri mediante la técnica de estría en la
superficie de medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o
medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Después de un periodo de
incubación de 24 horas (puede variar en función del microorganismo), se observarán las
colonias de bacterias (masas constituidas por millones de bacterias que se aprecian a
simple vista y que han sido originadas a partir de una célula). Se observará el tamaño y
el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada género y especie
bacteriana, por lo que se les utiliza como característica diferencial. A continuación se
realizará una tinción de Gram para determinar la morfología y reacción tintorial de las
bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente

aisladas sobre el medio de cultivo.
11
 c. Aislamiento secundario
En caso que la morfología y reacción a la tinción de Gram de las células
bacterianas coincidan con el microorganismo que se desea investigar se realiza el
aislamiento secundario a través de una siembra para trasplante o transferencia de una
pequeña porción de la colonia hacia un tubo con medio de cultivo inclinado que
permitirá el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (población de bacterias que
procede de una célula) y que a su vez puede ser mantenido e identificado merced a sus
propiedades culturales y fisiológicas.

12
 PRÁCTICA VI
IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introducción
Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificación
del género y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificación
comienzan con el estudio morfológico de la colonia, estudio morfológico de las células,
motilidad, prueba de catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidación fermentación,
metabolismo de carbohidratos, metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas
otras pruebas según la bacteria que va a ser identificada.

2. Objetivos
2.1 Caracterizar morfológicamente las colonias bacterianas.

2.2 Caracterizar morfológicamente las células bacterianas.

2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.

2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidación-fermentación

2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los

carbohidratos y compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1.1 Estudio morfológico de las colonias bacterianas

Determinar el tamaño, forma, borde, elevación, consistencia, aspecto y color de la
colonia bacteriana.
a) Tamaño: Pequeño, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo,
invadiendo toda la superficie del medio.
b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.

c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.

d) Elevación: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.

e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.

f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

13
 Forma Elevación

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevación de colonias bacterianas.

14
3.2 Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno
en agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos excluyendo a los estreptococos.
Técnica del porta objetos: En una lámina portaobjetos depositar una colonia
bacteriana procedente de un cultivo joven y añadir dos gotas de agua oxigenada de 30
volúmenes.
Interpretación: La prueba se considera positiva cuando se produce una
efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el
peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno molecular.
2 H202 = 2 H20 + 02

Figura 6.2 Reacción positiva en la prueba de la catalasa.

15
Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas
Reacció
Morfologí
n
a
Catalasa Gra
m
Staphylacocc + +
us
+ +
Cocos Micrococcus
Streptococcus - +
Enterococcus - +
Bacilos Bacillus + +
esporulado Clostridium - +
s
Listeria + +
Bacilos
Corynebacteriu
no + +
m
esporulado - +
Erysipelotrix
s

4. Referencias bibliográficas
Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos.
Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental
Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos
(10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.
Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiología de los alimentos. Fundamentos y
Fronteras. España: Editorial Acribia, S.A.

16
 PRÁCTICA XIII
ACTINOMICETOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS

1. Introducción

Los actinomicetos, también llamados actinobacterias, son bacterias filamentosas

Gram+, organismos procariotas con un aspecto muy parecido a los hongos (en cuya
clasificación los situaban anteriormente), cuyo crecimiento es en forma de micelios
filamentosos que se desarrollan radialmente y forman esporas.
Los metabolitos secundarios como los antibióticos son moléculas sintetizadas por
determinados microorganismos normalmente en una fase tardía del ciclo de crecimiento.
Son compuestos que no son necesarios para la biosíntesis celular, no tienen por lo tanto
un papel directo en el metabolismo energético y, en consecuencia no se conoce con
claridad la razón de su existencia. La biosíntesis de los metabolitos secundarios está
estrechamente relacionada con el metabolismo primario de las células que los producen,
ya que usualmente sus precursores son metabolitos primarios normales o modificados
como ácidos orgánicos, unidades de isopropano, aminoácidos alifáticos y aromáticos,
bases purinas o pirimídicas.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación los más

importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios entre los que se
incluyen, además de los antibióticos, ciertas toxinas de hongos, alcaloides, insecticidas,
factores de crecimiento vegetal (giberelinas), pigmentos y tensioactivos.

Los actinomicetos comprenden bacterias en su mayoría aerobias y algunas

anaerobias encontradas en animales y el hombre. Generalmente son Gram positivos,
presentan una diversidad morfológica considerable desde formas bacilares hasta formas
filamentosas ramificadas a modo de esporulación compleja con un pocentaje de G + C
en su ADN superior al 55 %. Su crecimiento es lento y las colonias desarrollan sobre la
superficie de los medios sólidos con una consistencia firme y adheridas firmemente al
sustrato solidificado. Están constituidas por micelio vegetativo (inmerso en el medio de
cultivo sólido) y micelio aéreo en cuyos extremos se encuentran las conidias (esporas
asexuadas) que brindan a la colonia su pigmentación y su apariecia polvorienta; sin
embargo algunos actinomicetos sólo producen micelio vegetativo.

Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos y aunque las primeras cepas
fueron aisladas de fuentes humanas y animales, el suelo constituye su reservorio más
rico y a partir del cual estos microorganismos pueden invadir numerosos biotopos.

17
2. Objetivos

2.1 Caracterizar la colonia de un cultivo puro de actinomicetos

2.2 Aislar actinomicetos de suelo agrícola.

3. Procedimiento

3.1 Aislamiento de actinomicetos de suelo

a. Muestra
100 g de suelo agrícola
b. Tratamiento de la muestra

Si la muestra de suelo se encuentra húmeda, dejarla secar bajo sombra.A
continuación, triturarla con rodillo y posteriormente tamizarla (malla de
1,6 mm )
 Realizar diluciones de la muestra en solución salina hasta 10-2. Para la
primera dilución tomar una submuestra de 25 g del tamizado y
depositarlos en un matraz conteniendo 225 mL de solución salina estéril
(10-1). Agitar vigorosamente durante 20 minutos. Para la dilución 10-2
tomar 1 mL de la dilución anterior y trasvasar a un tubo con 9 mL de
solución salina estéril.
c. Aislamiento
 Tomar una alícuota de la dilución 10-2 y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar Jensen al que se le ha incorporado
Nistatina más Ciclohexamida (50 µg/ mL.) para inhibir el desarrollo de
mohos y y Polimixina B (5µg/ mL) y Penicilina (1µg/ mL) para limitar el
crecimiento de otras bacterias.
 Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (30 °C) hasta por 5 días.

 Seleccionar las colonias características de actinomicetos: pequeñas,

adheridas fuertemente al sustrato, compactas, secas, pulverulentas,
mayormente pigmentadas, con olor a tierra húmeda.
 Realizar tinción de Gram de cada una de las colonias. Observar la
morfología celular, disposición de conidias, esporas y presencia o
ausencia de fragmentación en el micelio.
 Cultivar en viales conteniendo agar Jensen inclinado.

18
Figura 12.1 Aislamiento de actinomicetos de suelos agrícolas.
19
 3.2 Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis)
 Sembrar cada uno de los actinomicetos, agotando completamente sobre la
tercera parte de una placa de Petri con agar Waksman e incubar en
aerobiosis, a 30 °C durante 4 días.
 Sembrar por estría y en forma perpendicular al actinomiceto (a 2 mm) cada
una de las cinco bacterias prueba: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus y B. subtilis.
Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Observar y medir la zona de inhibición del crecimiento de las bacterias prueba.

3.3 Identificación morfológica de actinomicetos productores de antibióticos

Tomar en cuenta las características macroscópicas de las colonias y
microscópicas de las células. En cuanto a las colonias la forma es circular, tamaño
pequeño, mayormente pigmentadas, de textura coriácea, fuertemente adheridas al
sustrato, compactas, de aspecto polvoriento y con olor a tierra húmeda.
Para determinar las caracteristicas microscópicas de las células realizar el
microcultivo de cada una de los actinomicetos e investigar la presencia de conidias y
disposición (aisladas, en pares, cadenas cortas, cadenas largas, espirales, rectas) o la
presencia de esporangios (con esporas móviles o no móviles). Realizar una tinción de
Gram y observar células Gram positivas y formación de filamentos ramificados con o
sin fragmentación y presencia de conidias con diferente disposición.

Microcultivo (Método de Riddell)

Utilizar una cámara húmeda que consiste en una placa de Petri con un triángulo
de vidrio como soporte de una lámina portaobjetos y un algodón ligeramente
humedecido. Colocar en la parte central de la lámina portaobjetos un pequeño bloque
cuadrado de agar Jensen y sembrar cada actinomiceto en la periferia del agar.
Posteriormente cubrir el bloque de agar con una laminilla cubre objetos estéril e incubar
durante 3 días a temperatura ambiente.

3.4 Mantenimiento de actinomicetos productores de antibióticos

 Sembrar cada uno de los actinomicetos productores de antibióticos
en caldo glicerinado 20 %.
 Incubar a 30 °C durante 3 días.
 Mantener en refrigeración.

20
Figura 12. 2 Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis).

21
4. Anexo

4.1 Agar Jensen (g/L)

Sacarosa 2,0
Caseína hidrolizada 0,25
Sulfato de magnesio 0,20
Cloruro férrico 0,10
Agar agar 20,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0

4.2 Medio Waksman para la producción de antibióticos (g/L)

Extracto de carne 5,0
Peptona 5,0
Cloruro de sodio 5,0
Glucosa 10,0
Agar agar 15,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0

4.3 Caldo glicerinado

Cloruro de sodio 0,5
Peptona 1,0
Glicerina 20 mL
Agua destilada 80 mL
pH 7,0

22
5. Referencias bibliográficas
Hernández, A. & Mondragón, A. (2002). Actinomicetos aislados de suelos agrícolas
para el control de Epinotia aporema “barrenador de brotes” en Medicago sativa
“alfalfa” Ferreñafe, Lambayeque, Marzo – diciembre.2001. Tesis de
Licenciatura .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Huaman, S. & Lupuche, J. (2002). Evaluación de la actividad insecticida de los
actinomicetos aislados de suelos agrícolas del distrito San José, frente a
Spodoptera frugiperda “cogollero del maíz”. Lambayeque, Febrero-Octubre,
2001. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro
Ruiz Gallo.
Sandoval, M. & Vásquez, J. (2001). Actinomicetos mesofílicos aerobios con actividad
antimicrobiana, aislados de suelos degradados en la provincia de Lambayeque,
Febrero- setiembre, 2000. Tesis Licenciatura .Lambayeque, Perú, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Sialer, C. & Horna, D. (2002). Efecto de sustancias secretadas por Streptomyces spp.
aislados de “hormigas” (tribu Attini) sobre dermatofitos. Tesis de Licenciatura.
Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

23