Abstrait

Les miARN introniques, résidant dans les régions introniques des gènes de l'hôte, sont censés
être co-transcrits à partir de leurs gènes de l'hôte et présentent des profils d'expression
cohérents avec les gènes de l'hôte. Des études récentes ont rapporté quelques miARN introniques
à expression discordante avec leurs gènes hôtes. Nous avons donc cherché à comprendre le
schéma d’expression des miARN introniques et de leurs gènes hôtes dans le carcinome
hépatocellulaire (HCC) et à révéler les mécanismes moléculaires associés possibles. Notre
analyse d'intégration à l'échelle du génome des transcriptomes de miARN et d'ARNm, dans trois
ensembles de données provenant de 550 patients atteints de CHC, a révélé qu'une grande
quantité de paires de gènes miARN-hôte était exprimée de manière discordante. Des résultats
cohérents ont également été révélés chez 775 patientes atteintes d'un cancer du sein. Plus
loin, On prévoyait que la plupart des miARN introniques liés au HCC auraient des régulateurs
en amont distincts et des signaux de promoteur proximal indépendants issus des gènes de
l'hôte. L'expression discordante de paires représentatives, miR-26s / CTDSP, a été validée
expérimentalement. Nous avons également identifié le site d'initiation de la transcription
indépendant, le signal du promoteur et le facteur de transcription de miR-26b à partir de son
gène hôte. Collectivement, l'expression discordante des miARN introniques et de leurs gènes
hôtes était relativement omniprésente et la «transcription indépendante» du miARN intronique
peut contribuer partiellement à un tel phénotype.
Mots-clés: microARN, miARN intronique, transcriptome, analyse d'intégration, carcinome
introduction
Les microARN (miARN), ~ 22nt ARN monocaténaire non codants, sont importants du point de vue
fonctionnel dans divers processus biologiques 1 , 2 . Dans le génome humain, environ la moitié des
gènes de miARN se situent entre des unités de transcription indépendantes, tandis que les miARN
intragéniques (gènes internes) sont noyés dans des régions principalement introniques et orientés sur le
même brin d'ADN de gènes hôtes. Les miARN intergéniques sont transcrits à partir de leurs propres
unités de transcription, similaires aux autres gènes codant pour les protéines, par l'ARN polymérase II
et sont rapidement clivés et ensuite traités pour générer des miARN mûrs 2 - 4. Néanmoins, on pense
que les miARN introniques sont traités à partir des introns de leurs unités de transcription hôtes et
partagent donc des mécanismes de régulation et des modèles d'expression communs avec le gène
hôte 5 - 7 . Cependant, il a été observé chez Drosophila que les miARN introniques et leurs gènes hôtes,
miR-7 / BANCAL et miR-281 / ODA, avaient des profils d'expression différents 8 , 9 . Chez l' homme,
plusieurs programmes de calcul ont prédit que ~ 1/3 des miRNAs introniques peut contenir
des promoteurs possibles proximales indépendants de leurs gènes hôtes 10 - 13 . Il a été rapporté que le
groupe miR-106b-93 possède une unité de transcription primaire indépendante de son gène
hôte. 14. Ces résultats indiquent la complexité de la régulation transcriptionnelle intronique du miARN.
Des études sur l'altération de l'expression des miARN et de leurs gènes hôtes au cours de processus
biologiques tels que la cancérogenèse pourraient permettre de comprendre si le miARN intronique et
leurs gènes hôtes sont co-traités. Semblable aux ARNm, l'expression altérée de miARN a été observée
dans divers cancers humains et les miARN servent d'oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs
dans les carcinogenèses 4 , 15 , 16.. La dysrégulation des miARN et des ARNm dans la tumeur se produit
à la fois au niveau de l'ADN, comme la variation du nombre de copies du locus du gène et de la
méthylation anormale, et au niveau de l'ARN, comme l'activation ou la suppression de la
transcription. Ces mécanismes de régulation induisent ou réduisent probablement les niveaux de
miARN introniques et de leurs gènes hôtes dans la même direction si les paires de gènes introniques
mi-ARN intronique partagent les mêmes transcrits. Ainsi, examiner le modèle d'expression des paires
de gènes introniques miARN-hôte introniques dans les tumeurs, les tumeurs non tumorales et les
tumeurs non tumorales serait probablement un moyen pratique de révéler si les miARN introniques
sont transcrits de manière dépendante ou indépendante à partir de leurs gènes hôtes.
Nous avons précédemment profilé 219 miARN et 13101 gènes dans la tumeur et 176 échantillons
appariés non tumorales de patients atteints d' un carcinome hépatocellulaire (HCC) et a constaté que
jusqu'à un tiers d'entre eux sont sensiblement modifiées dans HCC 7 , dix-sept - 22 . Il existe également un
ensemble de données de transcriptome d'ARNm et d'ARNm de TCGA disponible publiquement dans
les cancers humains tels que le CHC et le cancer du sein. Tous ces éléments nous ont permis
d'effectuer l'analyse d'intégration transcriptive à l'échelle du génome pour les paires de gènes
introniques miARN-hôte dans une large gamme d'échantillons humains à un niveau systématique.
Dans cette optique, nous avons globalement examiné le schéma d’expression des miARN introniques
et de leurs gènes hôtes correspondants dans deux jeux de données du transcriptome HCC. Nous avons
trouvé une grande quantité de miARN introniques exprimés de manière discordante avec leurs gènes
hôtes. Nous avons également exploré les mécanismes de régulation possibles via l'analyse
bioinformatique et les essais expérimentaux et avons révélé que la «transcription indépendante» du
miARN intronique contribuait à un tel phénomène.
Matériaux et méthodes

Jeux de données transcriptome

Un total de quatre ensemble de données correspondant miARN et ARNm transcriptome a été utilisé
(Tableau (Table11 ).

Tableau 1
Quatre jeux de données avec les profils de transcriptome miARN et ARNm disponibles

Ensembles de Tumeur Non- Jumelé Les autres informations

données (n) tumeur (n) (n)

LCS_HCC 176 176 176 GSE6857 ; GSE14520

TCGA_LIHA 374 50 49 Base de données TCGA

TCGA_BRCA 775 87 85 Base de données TCGA

Cells_ARTA / / / GSE18693 ; n = 8 (2 lignées cellulaires, 2

traitements, en double)
Le premier était un ensemble de données de transcriptome HCC précédemment décrit de notre groupe,
qui comprenait les données de puces à miARN et les données de puces à ARNm dans 176 échantillons
de tumeurs et de tumeurs non-tumorales couplées au HCC, appelés ensemble de données 17 , 23
de
LCS_HCC . Pour ces cas, les profils miARN ont été réalisés dans la plate-forme de microréseaux
miARN à canal unique (V 2.0; contenant 219 miARN non redondants) (numéro d’accès
GEO: GSE6857 ) 17 . Le profilage de microréseaux d'ARNm dans les tumeurs et les autres tumeurs
était basé sur une plate-forme à canal unique (matrices Affymatrix Genechip HG-U133A
2.0, GSE14520 ) 23 , 24 .
Le deuxième ensemble de données était constitué des données de séquençage en profondeur de
miARN et d'ARNm du CHC de l'Atlas du génome du cancer (TCGA), appelées TCGA_LIHA. Les
données de séquençage des ARNm et miARN de TCGA_LIHA comprenaient 374 tissus de CHC et 50
tissus hépatiques normaux. Parmi eux, il y avait 49 cas avec des données de transcriptome dans des
tissus appariés et des tissus normaux.
La troisième était les données de séquençage en profondeur de miARN et d'ARNm du cancer du sein
téléchargées à partir de TCGA, appelées TCGA_BRCA. Cela incluait les données de transcriptome
miARN et ARNm de 775 échantillons de cancer du sein et de 87 tissus mammaires normaux. Parmi
eux, il y avait 85 cas avec des données de transcriptome dans le cancer du sein apparié et les tissus
normaux.
Le quatrième a été téléchargé avec le numéro d’accès GEO: GSE18693 . Elle comprenait les données
de microréseau de miARN et d’ARNm d’un total de 8 échantillons de deux lignées cellulaires. Il
s’agissait des cellules MCF-7 et des cellules MDA-MB-231 des cellules négatives pour le récepteur
des œstrogènes. Les cellules traitées avec de l'acide rétinoïque tout-trans (ATRA) pendant 6 heures et
48 heures ont été utilisées pour le profilage du transcriptome avec des doubles biologiques par
échantillon 25 . Nous l'avons appelé le jeu de données Cells_ARTA.

classification des miARN

Toutes les coordonnées génomiques miRNA humaines annotées ont été extraites de la version 21 de
miRBase, puis cartographiées avec les coordonnées génomiques des séquences de référence d'ARN
Genes RefSeq (GRCh38 / hg38) à l'aide du script Perl interne. Les coordonnées génomiques RefSeq
ont été téléchargées à partir du navigateur génomique de l'Université de Californie à Santa Cruz
(UCSC). Les miARN dont les coordonnées ont été cartographiées sur des gènes annotés sur le même
brin d'ADN ont été définis comme des miARN intragéniques, autrement dit des miARN
intergéniques. Les miARN intragéniques ont été classés en tant que miARN exoniques lorsque leurs
coordonnées se sont chevauchées avec des régions exon conservées, autrement dit des miARN
introniques 26 .

Analyse du modèle d'expression des paires de gènes introniques miARN-hôte dans la

tumeur, non tumorale et comparaison tumeur / non tumorale
Les données de la micropuce ont été analysées à l'aide du logiciel R / Bioconductor. La corrélation de
Pearson ou corrélation de Spearman a été utilisée pour évaluer le schéma d'expression entre les
miARN introniques et leurs gènes hôtes dans des tissus non tumoraux et tumoraux, respectivement. Si
la valeur p de corrélation était inférieure à 0,05 et que la valeur r était positive, ces paires de gènes
miARN-hôte étaient considérées comme des paires concordantes dans l'expression de paires tumorales
ou non tumorales, sinon discordantes.
Le modèle d'altération des miARN introniques et des gènes de l'hôte dans les tumeurs par rapport aux
non-tumeurs a également été examiné. Le test t de Student apparié a été utilisé entre tumeur et non-
tumeur, et les valeurs p ont été ajustées pour de multiples tests en utilisant la méthode de Benjamini
afin de contrôler le taux de fausses découvertes (FDR). Une valeur limite du FDR q de 0,05 a été
définie pour reconnaître les gènes avec une expression différentielle significative à partir de la
comparaison tumeur / non tumorale. Si les miARN introniques et leurs gènes hôtes dans les paires
étaient tous deux significativement régulés à la hausse ou à la baisse, ou n’avaient aucune expression
différentielle significative de la comparaison tumeur / non tumorale, ces paires de gènes miARN-hôte
étaient des paires concordantes dans la expression de la tumeur par rapport aux paires non tumorales,
sinon discordantes.
Les miARN introniques liés aux tumeurs ont été filtrés en vue d'une analyse bioinformatique
supplémentaire uniquement s'ils présentaient une valeur FDR q <0,05 et un facteur de variation
d'intensité ≥ 1,5 sur la tumeur, qu'elle soit non tumorale ou non.

Analyse bioinformatique sur la recherche de régulateurs en amont et de fonctions

biologiques associées pour les miARN introniques liés à la tumeur
Des gènes substituts de miARN introniques liés à la tumeur et leurs gènes hôtes correspondants ont été
étudiés pour identifier leurs régulateurs en amont possibles. En détail, la corrélation de rang de
Spearman a été réalisée pour les miARN introniques liés à la tumeur et leurs gènes hôtes
correspondants avec les données de transcriptome d'ARNm complet en utilisant les valeurs log (2) de
la tumeur par rapport aux non-tumorales. Les gènes de substitution pour certains miARN ou ARNm
ont été définis comme des gènes présentant les 5% supérieurs de valeurs de corrélation significatives
(Figure 1 supplémentaire ), puis utilisés pour une analyse plus poussée.
L'analyse d'enrichissement des régulateurs en amont des miARN introniques liés aux tumeurs et de
leurs gènes hôtes respectifs a été réalisée via une analyse de la voie d'ingéniosité (IPA). Le test
hypergéométrique ≤ 0,05 a été considéré comme un enrichissement significatif. Pour évaluer
davantage la cohérence des régulateurs en amont de chaque miARN intronique lié à la tumeur et de
son gène hôte respectif, des listes d'enrichissement complètes ont été classées en 6 groupes,
comprenant top10, top10-20, top20-50, top50-100,> 100 et non enrichi. Un test d'accord
interpersonnel pondéré quadratique (kappa) a ensuite été effectué à l'aide du logiciel Medcalc (v13.3.3,
Ostende, Belgique).
Les données de séquençage sur puce de la base de données Encyclopedia of DNA Elements
(ENCODE) ont été utilisées pour annoter l’activité de promoteur en amont des miARN introniques
dans la région située en amont des miARN précurseurs et 0,5 kb en aval des sites de départ de la
transcription (TSS) des gènes hôtes. .
Pour explorer les processus biologiques potentiels liés à chaque miARN intronique lié à la tumeur et à
son gène hôte respectif, une analyse d'enrichissement Gene Ontology (GO) a été réalisée sur la base
des substituts de gènes susmentionnés, corrélés positivement et négativement, pour chaque miARN ou
ARNm via un progiciel R, clusterProfiler
( https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html ) 27 - 29 .
Echantillons cliniques HCC, culture cellulaire, interférence ARN et plasmides
Parmi les ARN tumoraux et non tumoraux archivés de 176 cas de CHC, 18 ARNs de CHC et non-
HCC appariés ont été choisis au hasard pour la validation RT-PCR quantitative des miARN
introniques et de leurs gènes hôtes.
Les lignées cellulaires HCC humaines (HuH7, HuH4, HuH1, Hep3B, HepG2, MHCC97, SK-Hep1 et
SMMC7721) et un hépatocyte immortalisé (HHT4) ont été cultivés comme décrit
précédemment 30 . Les cellules P493-6 B humaines portant un gène Myc conditionnel réprimé par la
tétracycline ont été aimablement fournies par le Dr Joshua Mendel et cultivées en routine de la
manière décrite 31 . Pour la répression de Myc, les cellules ont été traitées avec 0,1 µg / ml de
tétracycline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) pendant 48 heures. HL-7702, une lignée de cellules
hépatocytaires immortalisées, provenait de l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai et de
l'Académie chinoise des sciences et était cultivée avec du RPMI-1640 et 10% de FBS conformément
au protocole standard.
Myc (SI00300902) et un siARN contrôle négatif ont été achetés à Qiagen (Valencia, CA). Le siRNA
de Drosha (siDrosha-2) a été acheté chez Dharmacon (Lafayette, CO). Les plasmides Myc-PT3EF1a et
le contrôle PT3EF1a ont été aimablement fournis par le Dr Xin Chen. La transfection a été réalisée
avec de la lipofectamine 2000 (Invitrogen), conformément aux instructions du fabricant. L'ARN total a
été extrait 72 heures après la transfection des siARN et 48 heures après la transfection des plasmides.

Isolement de l'ARN, amplification génomique en chaîne par polymérase avec transcription

inverse (qRT-PCR), extraction de protéines et Western blot
Les ARN totaux ont été extraits en utilisant les méthodes standard TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad,
CA). La transcription inverse a été réalisée à l'aide du kit de transcription inverse TaqMan®
MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, Californie) pour les miARN et du kit de transcription
inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Foster City, CA) pour les gènes. L’expression de
gènes miARN et de gènes matures a été mesurée à l’aide des tests Taqman MicroRNA spécifiques de
miR-26a et miR-26b, et des tests génétiques Taqman spécifiques de CTDSP1 (Hs00221852_m1),
CTDSP2 Hs00428461_m1), CTDSPL (Hs0014146_m1). Hs00203008_m1) après transcription inverse
(Applied Biosystems, Foster City, CA). L’expression relative des gènes des introns de CTDSP1 a
également été évaluée à l’aide des spécificités du groupe de sondes TaqMan pour l’exon1-2
(Hs00221852_m1), l’exon2-3 (Hs01105500_g1) et l’exon 4-5 (Hs01105502_m1). Le test Taqman
MicroARN pour RUN6B a été utilisé pour normaliser l’abondance relative des miARN. Le test du
gène Taqman pour le 18S a été utilisé pour normaliser l'abondance relative de l'ARNm. L'expression
de mir-26b primaire et de précurseur, mir-26b, a été mesurée à l'aide de tests SYBR Green (Applied
Biosystems, Foster City, CA) et l'ARN U6 a été utilisé pour normaliser leur expression. L'expression
de CTDSP1 primaire a été mesurée à l'aide de tests SYBR Green et 18S a été utilisée pour normaliser
leur expression. Les amorces utilisées ont été répertoriées dans le tableau. L'expression de CTDSP1
primaire a été mesurée à l'aide de tests SYBR Green et 18S a été utilisée pour normaliser leur
expression. Les amorces utilisées ont été répertoriées dans le tableau. L'expression de CTDSP1
primaire a été mesurée à l'aide de tests SYBR Green et 18S a été utilisée pour normaliser leur
expression. Les amorces utilisées ont été répertoriées dans le tableau.S1 . Les expériences ont été
effectuées en triple.
Après 72 heures de transfection d'ARNsi ou 48 heures de traitement à la tétracycline, l'extraction de
protéines totales et le test de Western blot ont été effectués comme décrit précédemment 19 en utilisant
des anticorps anti-Myc (1: 2000, Epitomics, Burlingame, CA) et anti-β-actine (1: 5000, Sigma-
Aldrich) anticorps.
5'-Amplification rapide des extrémités d'ADNc (5'-RACE)
5'-RACE a été utilisé pour identifier l'extrémité 5 'des transcrits primaires de miARN afin de localiser
les TSS de primaire mir-26b. Le kit GeneRacer avec les kits de clonage SuperScript III RT et TOPO
TA (Invitrogen) a été utilisé avec 5 µg d’ARN total provenant de cellules HuH7 conformément aux
instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée avec des hexamères aléatoires fournis
dans le kit. Les amorces inverses spécifiques de gène de miR-26b ont été répertoriées dans le
tableau S1 . Pour enrichir le transcrit primaire mir-26b, les cellules HuH7 ont été transfectées avec les
siRNA Myc et Drosha 2 jours avant l'isolement de l'ARN (Figure 2 supplémentaire ).

Immuoprécipitation à la chromatine (Puce)

L'analyse de la puce a été réalisée dans des cellules HuH7 par le kit de dosage d'immunoprécipitation à
la chromatine (Millipore, Billerica, MA) conformément aux instructions du fabricant. Pour doser la
méthylation d'histone lysine, des anticorps spécifiques anti-H3K4me3 (Abcam, Cambridge UK), anti-
H3K36Me3 (Abcam) et anti-β-actine ont été utilisés. Quatre amplicons de PCR en temps réel
encadrant le TSS du transcrit miR-26b ont été conçus dans des fenêtres de 220 pb comme suit: 50 pb
en amont du TSS identifié (amplicon 1); immédiatement en aval du TSS identifié (amplicon 2); 280 pb
en aval du TSS (amplicon 3); et 1200 pb en aval de TSS (amplicon 4). Le test SYBR Green (Applied
Biosystems, Foster City, Californie) a été utilisé pour amplifier ces régions, et les amorces directe et
inverse de chaque amplicon ont été répertoriées dans le tableau S1 .

Autres statistiques
Un test t de Student (bilatéral) a été utilisé pour l'analyse statistique de données expérimentales
comparatives entre différents groupes à l'aide de GraphPrism V6.0 (San Diego, CA). La signification
statistique a été définie comme une valeur p inférieure à 0,05.
Aller à:

Résultats

L'expression discordante des miARN introniques et de leurs gènes hôtes correspondants est
une caractéristique commune à 3 jeux de données de transcriptome indépendants
Nous avons d’abord identifié les paires de gènes introniques miARN / hôte à partir du jeu de données
LCS_HCC. De l'annotation miRNA dans miRBase (sortie 21) et l' annotation de l' ARNm dans
le navigateur de génome UCSC (de hg38), le gène de coordonnées de cartographie a révélé 778
miARN introniques (Fig (Fig1A).1 A). Ces 778 miARN introniques et leurs gènes hôtes ont ensuite
été intégrés à l'ensemble de données de puces ARNm (y compris 219 miARN) et aux données de
puces ARNm (y compris 13101 gènes) dans 176 cas de CHC. Comme le montre le tableau S2 , 59
paires de gènes introniques miRNA / hôte avec les données disponibles sur l'expression de miARN et
d'ARNm ont été identifiées.
Figure 1
Le modèle d'expression des paires de gènes introniques miARN-hôte introniques avec les
données de profilage disponibles. (A) Le chiffre en tarte pour le pourcentage de miARN introniques
dans miRBase. (B) Base de données LCS_HCC. Les paires concordantes (gris clair) et discordantes
introniques de gènes miARN-hôte (gris foncé) ont été présentées sur la base de leurs lectures
tumorales et non tumorales et du rapport tumeur / non tumorale (panneau de gauche). Le modèle
d'expression de 11 mi / miR grappes parmi 59 miRs introniques a été examiné comme contrôle positif
(panneau de droite). (C, D) Dans les bases de données TCGA_LIHA et TCGA_BRCA, les paires
concordantes (gris clair) et discordantes (gris foncé) ont été présentées en fonction de leurs lectures
tumorale et non tumorale ainsi que du rapport tumeur / non tumorale.
Leur profil d'expression a ensuite été évalué en tumeur, non tumorale et la comparaison tumeur / non
tumorale. Tout d'abord, dans les tissus non tumoraux et tumoraux, nous avons calculé le coefficient de
corrélation produit-moment de Pearson du gène miARN intronique et du gène hôte dans chaque paire
afin d'évaluer si ces paires étaient des paires concordantes ou discordantes (détaillées dans la partie
Matériels et Méthodes). Parmi les 59 paires, seul un petit sous-groupe de paires (11 dans les tissus non
tumoraux et 17 dans les tissus tumoraux, 18,6% et 28,8% respectivement) étaient des paires
concordantes présentant une corrélation significativement positive (p <0,05) entre le miARN
intronique et le gène de l'hôte. (Fig (Fig1B,1 B, tableau S2). Ensuite, nous avons évalué leur profil
d'expression en fonction de la lecture de la tumeur par rapport à une non-tumeur. De manière
constante, la majorité des paires (42 sur 59) ont présenté une altération d'expression discordante, c.-à-
d. Que les miARN et leurs gènes hôtes n'étaient pas régulés positivement à la hausse ou à la baisse, ou
n'avaient aucun changement dans la comparaison tumeur / non tumeur. (Fig (Fig1B,1 B, tableau S2 ).
Nous avons également utilisé des paires introniques miARN miRNA miARN en grappes comme
témoin positif pour effectuer l'analyse, car ils ont été co-localisée et éventuellement co-régulé 32 , 33 .
Parmi 59 miARN introniques, il y avait 11 paires de miARN dans sept grappes (Tableau S3). En
accord avec les données publiées, miRNAs dans les amas ont été essentiellement concordante
exprimés dans la tumeur (9 sur 11), non tumorales (9 sur 11), et la comparaison de la tumeur vs non-
tumoral (7 sur 11) (Fig ( Fig1B,1 B, panneau de droite).
Nous avons également exploré le modèle d'expression des paires de gènes introniques miARN-hôte
dans l'ensemble de données de séquençage d'ARN TCGA HCC (Tableau S4 ). Dans le jeu de données
TCGA_LIHA, nous avons identifié 380 paires de gènes introniques miARN / hôte avec les données de
séquençage disponibles de miARN et d’ARNm. L'analyse de l' expression a révélé que 85% (323 sur
380) des paires dans les tissus non tumoraux et 42,4% (161/380) des paires dans les tissus tumoraux
présentés expression discordante entre intronique miARN et le gène de l' hôte (Fig (Fig1C).1 C) De
plus, 55% des paires (209/380) présentaient un schéma d'expression discordant dans les tissus
tumoraux et non tumoraux.
De manière cohérente, l'analyse des données dans l'ensemble de données TCGA_BRCA a révélé des
résultats similaires dans 380 paires de gènes miARN / hôte introniques identifiées. 79,7% paires dans
les tissus non tumoraux, 42,9% dans les tissus tumoraux, et 61,2% dans la tumeur par rapport à
des tissus non tumoraux ont montré l' expression discordante entre miARN introniques et des gènes de
l' hôte (Fig (Fig1D).1 D). Ensemble, ces données ont démontré qu'il était relativement courant pour les
miARN introniques et leurs gènes hôtes présentant l'expression discordante.

Les ARNmi introniques présentent les facteurs de régulation de la transcription et les

signaux de promoteur proximal indépendants issus de leurs gènes hôtes via l'analyse
bioinformatique
Une possibilité conduisant à l'expression discordante du miARN intronique et du gène hôte est que les
mécanismes de régulation de la transcription pour les miARN introniques pourraient être différents de
ceux de leurs gènes hôtes. Dans cette veine, nous avons étudié les miARN introniques associés au
HCC à partir de l'ensemble de données LCS_HCC en raison de leur importante altération régulatrice
des tumeurs par rapport aux non-tumeurs de patients atteints de HCC. Un total de 14 miARN ont été
identifiés comme miARN fortement liés à la tumeur (tumeur par rapport à non-tumoral, ≥1.50 ou
≤0.67; Table tableau 2).2 ) Régulièrement, une proportion majeure de miARN liés à la tumeur était
discordante dans l' expression de leurs gènes de l' hôte (11 sur 14 dans la tumeur et non-tumoral, et 9
sur 14 dans la tumeur par rapport aux non-tumeur) (tableau (Tableau 22 ) .

Tableau 2
14 paires de gènes miARN / hôte introniques associées à la tumeur dans le jeu de données LCS_HCC.

Paires Tumeur vs non tumorale a Tumeur b Non-tumeur b Promoteur

proximal
des
miR_ miR_ Hôte_ hôte_ miARN c
q- fold valeur fois valeurr valeurp valeurr valeurp
value de q

Let-7g / <0,01 0,49 <0,01 1,82 / / / / Oui

WDR82

miR-105- <0,01 0,64 <0,01 1,17 / / / / Oui

2/
GABRA3

miR-10a / <0,01 0,46 <0,01 1,13 / / / / Oui

HOXB3

miR-126 <0,01 0,52 <0,01 1,54 / / / / Oui

/ EGFL7

miR-26a- <0,01 0,56 <0,01 1,34 / / / / Oui

1/
CTDSPL

miR-26a- <0,01 0,56 <0,01 1,43 / / / / Oui

2/
CTDSP2
 Paires Tumeur vs non tumorale a Tumeur b Non-tumeur b Promoteur
proximal
des
miR_ miR_ Hôte_ hôte_ miARN c
q- fold valeur fois valeurr valeurp valeurr valeurp
value de q

miR-188 <0,01 0,67 0,22 1,05 / / / / Oui

/ CLCN5

miR-148b <0,01 0,65 <0,01 2,49 0,15 0,04 / / Oui

/ COPZ1

miR-26b <0,01 0,60 <0,01 1,29 / / 0,16 0,04 Oui

/
CTDSP1

miR-15b <0,01 1,50 <0,01 4.06 0,21 0,03 / / Oui

/ SMC4

miR-224 <0,01 2,37 <0,01 3,76 0,26 0,01 0,29 <0,01 Oui
/ GABRE

miR-128- <0,01 1,50 <0,01 1,13 / / / / Non

2/
ARPP21
 Paires Tumeur vs non tumorale a Tumeur b Non-tumeur b Promoteur
proximal
des
miR_ miR_ Hôte_ hôte_ miARN c
q- fold valeur fois valeurr valeurp valeurr valeurp
value de q

miR-139 <0,01 0,58 <0,01 0,77 / / / / Oui

/ PDE2A

miR-27b <0,01 0,67 0,04 0,91 / / 0,22 <0,01 Non

/ C9orf3

Ouvrir dans une fenêtre séparée

a
Pour l'analyse des paires de gènes miARN / hôte dans une tumeur par rapport à une tumeur non
tumorale, le test t apparié a été effectué. b Pour l'analyse des paires en tumeur et en non tumeur, une
corrélation de Pearson a été réalisée. Seule une corrélation positive significative a été répertoriée. c
Les
signaux ont été annotés par H3K4me3 ChIP-seq de la base de données ENCODE. Les informations
détaillées figurent dans le tableau S6 . Les paires dans l'ombre grise étaient des paires discordantes
alors que les paires sans ombre étaient des paires concordantes basées sur l'analyse des tumeurs par
rapport aux non-tumeurs.

Pour étudier les facteurs de régulation potentiels de ces 14 miARN introniques et de leurs gènes hôtes
respectifs, nous avons identifié leurs substituts géniques via une analyse de corrélation globale de ces
miARN et de ces gènes hôtes avec le transcriptome entier de l'ARNm, comme avant 21 , 24. Nous avons
utilisé les lectures tumeur et non tumorale pour chaque gène dans 176 cas de CHC à des fins d'analyse.
Des méthodes détaillées ont été décrites dans la partie intitulée Matériels et méthodes. Une moyenne
de 656 substituts de gènes ont été identifiés et utilisés pour la prédiction de facteurs de régulation
potentiels de 14 miARN introniques et de leurs gènes hôtes. IPA a révélé que le gène miRNA et le
gène hôte introniques dans les 14 paires présentaient principalement des facteurs de régulation de la
transcription distincts. Le test d’accord inter-évaluateur pondéré quadratique (kappa) a également
montré que les miARN introniques liés à la tumeur présentaient une très faible cohérence / accord des
facteurs de transcription en amont avec leurs gènes hôtes (Tableau S5 ,valeur kappa <0,2). En tant que
contrôle, nous avons également effectué la même analyse pour le cluster miRNA miR106b-93 et le
cluster miR-30c-1-30e, puisque miR-106b et miR-93 ont été co-transcrits 14 alors que miR-30c-1 et
miR-30e avait la corrélation la plus élevée (tableau S3 ). Comme le montre le tableau S5 , les valeurs
de kappa étaient beaucoup plus élevées pour ces deux groupes, ce qui indique la cohérence des
facteurs de transcription en amont des paires de miARN dans ces deux groupes.
De plus, nous avons examiné les éléments régulateurs en amont de ces miARN introniques liés à la
tumeur en recherchant l’existence de signaux de promoteur possibles en amont des miARN
précurseurs et à 0,5 kb en aval du gène TSS du gène hôte. Les données de ENCODE ChIP-seq ont été
utilisées pour annoter l'activité du promoteur H3K4me3 dans cette région. L'annotation a révélé que
l' ensemble des 9 miARN introniques de paires discordantes et 3 de 5 miARN introniques de paires
concordantes avaient des pics de H3K4me3 supplémentaires dans les régions définies
(tableau (Table2,2 , Tableau S6). Dans la région amont de 5kb du précurseur de miARN, des pics
H3K4me3 supplémentaires sont présentés dans 6 miRNA introniques sur 9 provenant de paires
discordantes (66,7%, 4 affichant des pics forts et 2 présentant des pics faibles) et 1 sur 5 miARN
introniques provenant de paires concordantes (20% ). Ceux-ci ont indiqué que de nombreux miARN
introniques avaient des promoteurs proximaux potentiels, qui étaient différents des promoteurs du
gène de l'hôte. Collectivement, ces miARN introniques liés à la tumeur des paires discordantes avaient
probablement la régulation transcriptionnelle séparée par rapport à leurs gènes hôtes correspondants.

Validation expérimentale de l'expression discordante des paires intrroniques miR-26s /

CTDSP
Parmi les neuf miARN introns liés à la tumeur de paires discordantes, tous trois membres de la famille
miR-26 ont été répertoriés, soit, miR-26a-1, miR-26a-2 et miR-26b (tableau (tableau 2).2 ). Fait
intéressant, trois membres de la famille miR-26 situés aussi dans les introns d'une famille de protéines
appelées CTDSPs (Fig (Fig2A).2 A). Nous avons donc sélectionné miR-26 pour la validation
expérimentale de l'expression discordante des paires de gènes introniques miARN-hôte. Il a été
démontré que les miR-26 étaient significativement régulés à la baisse dans le CHC et reconnus comme
des gènes importants du suppresseur de tumeur pour avoir un impact profond sur la carcinogenèse
hépatique 18 , 34 - 37. MiR-26a-1 et miR-26a-2 servent tous deux de précurseurs à miR-26a mature, tandis
que le précurseur mir-26b est le précurseur unique de miR-26b mature.

Ouvrir dans une fenêtre séparée

Figure 2
L'expression discordante des miR-26 et de leurs gènes hôtes dans les tissus et les lignées
cellulaires du CHC. (A) La structure génomique de la co-localisation pour les miR-26 et leurs
CTDSP du gène hôte. (B) Expression relative des familles CTDSP et miR-26 dans un jeu de données
de microréseau chez 176 patients atteints de CHC. (C) Analyse qRT-PCR de CTDSP et de miR-26
matures dans des tissus de tumeur et non tumoraux appariés chez 18 patients atteints de CHC. Le test t
apparié a été utilisé. Analyse (D) qRT-PCR de CTDSP et de miR-26 matures dans des cellules HCC
humaines. Huit lignées cellulaires HCC étaient 1- Hep3B, 2- SK-Hep1, 3- MHCC97, 4- HepG2, 5-
SMMC7721, 6- HuH1, 7-HuH7 et 8-HuH4. (B, C, D) Les expériences ont été effectuées en triple et
les résultats ont été montrés en moyenne ± écart type.

Nous avons remarqué l'expression discordante de CTDSPs et miR-26 dans les données LCS-HCC
(Fig (Fig2B,2 B, Fig complémentaire 3 ). Quantitatives données de RT-PCR dans 18 cas de HCC
, choisis au hasard constamment démontré leur expression discordante, qui était que l'expression de
trois CTDSPs a été significativement plus élevée que les niveaux de miR-26s ont diminué de manière
significative dans les tumeurs (Fig (Fig2C).2 C). en outre, un tel phénomène discordant n'a été trouvée
dans huit lignées cellulaires HCC, une cellule d'hépatocytes immortalisés ligne (HHT4) et
des hépatocytes humains normaux par qRT-PCR. Comme cela est représenté sur la figure Fig2D,2D,
des taux plus élevés de CTDSP et des taux plus faibles de miR-26 ont été observés dans les cellules
HCC par rapport aux hépatocytes humains normaux et aux hépatocytes immortalisés. Pris ensemble,
les miR-26 introniques et leurs gènes correspondants de l'hôte CTDSP étaient exprimés de manière
discordante dans les CHC.

MiR-26b possède une unité de transcription primaire indépendante de son gène hôte
CTDSP1
Nous avons ensuite expérimenté de manière expérimentale si le mir-26b primaire avait été transcrit en
utilisant le promoteur proximal mais pas le promoteur CTDSP1. Un test 5'-RACE a été appliqué pour
déterminer le site d'initiation de la transcription de miR-26b. Les cellules HuH7 ont été utilisées en
raison de leurs niveaux d'expression élevés de CTDSP1 et de faible miR-26b. Nous avons identifié une
~ transcription de 1,4 kb l'amorce spécifique inverse imbriquée gène miR-26b
(figure (Fig3A).3 A). Le séquençage de cette transcription a révélé que le TSS de miR-26 aligné à
l' intron 1 (1032 pb à côté du premier exon) de CTDSP1, et a également été ~ en amont de 1,5 kb de la
séquence d'26b miR mature (Fig (Fig3A,3 A, panneau de droite).
 Ouvrir dans une fenêtre séparée
figure 3
Le site d'initiation de la transcription et la région promotrice de l'intronic miR-26b étaient
indépendants de son gène hôte, CTDSP1. Le test (A) 5'-RACE dans des cellules HuH7 avec
inhibition de Myc et Drosha a identifié le TSS du transcrit primaire mir-26b. Le panneau de gauche
était l'image de gel des produits 5'-RACE de miR-26b. Le panneau de droite était la représentation
schématique de la transcription primaire mir-26b et sa position par rapport à CTDSP1. (B) ENCODE
données de profilage de marqueur d'histone près de la région chromosomique de CTDSP1 et miR-26b
dans des cellules HepG2. (C) Dosage de H3K4me3 et H3K36me3 dans la région proche du TSS mir-
26b primaire dans les cellules HuH7. Quatre amplicons PCR ont été conçus. L'immunoprécipité de β-
actine chromatine a été utilisé comme contrôle négatif.
Fig Fig3B3 B montre des données de profilage marqueur histone ENCODE en amont de TSS miR-26b
et la région promotrice de la transcription CTDSP1. Outre le promoteur CTDSP1, il y avait un fort
signal de promoteur, une forte crête de liaison H3K4me3 et faible pic H3K36me3, dans l' intron 1 de
CTDSP1, à proximité du TSS proposé de miR-26b primaire dans plusieurs lignées cellulaires, y
compris HepG2 (HepG2 sur la figure Fig3B;3 B; toutes les autres cellules de la figure
supplémentaire 4 A). Les données ENCODE ChIP-seq ont identifié d’abondants sites de liaison des
facteurs de transcription et de l’ARN polymérase II dans cette région (Figure 4 supplémentaire) .B) De
manière correspondante, nous avons effectué le test ChIP en utilisant des anticorps anti-H3K4me3 et
anti-H3K36me3 dans des cellules HuH7 pour valider l'activité du promoteur à proximité du TSS de
mir-26b primaire. Quatre amplicons à travers le TSS miR-26b ont été conçues
(figure (Fig3C).3 C). Nous avons trouvé un signal de tri-méthylation de H3K4 considérablement accru
et un signal de tri-méthylation de H3K36 diminué dans la région de 200 pb à côté du TSS miR-26
identifié, indiquant un fort signal promoteur de la région environnante du TSS identifié. Ensemble, nos
résultats démontrent que le transcrit primaire miR-26b possède un TSS distinct, indépendant de son
gène hôte, CTDSP1.
De manière constante, le mir-26b primaire exprimé à un niveau inférieur alors que le CTDSP1
primaire présentait un niveau plus élevé dans 8 lignées cellulaires HCC par rapport à celles dans les
hépatocytes (Figure 5 supplémentaire ), indiquant en outre la transcription indépendante de miR-26b à
partir de CTDSP1.

Myc a spécifiquement supprimé l'expression de miR-26b mais pas son gène hôte CTDSP1
Nous avons également examiné si des facteurs réglementaires pourraient modifier de manière unique
l'expression de miR-26b mais pas de CTDSP1. Il a été rapporté que Myc réprimait l'expression de la
famille miR-26 dans les cellules de lymphome humain P493-6 B, exprimant Myc 31 , une tétracycline
(tet) -repressible . Pendant ce temps, la littérature et coder des données ChIP ont révélé plusieurs sites
de liaison putatifs Myc dans la région de 2kb devant le TSS miR-26b (navigateur génome
UCSC) 31(Fig (Fig4A,4 A, Fig complémentaire 4 B). Nous avons donc raisonné Myc qui pourrait être
un facteur de régulation. Pour tester cela, Myc siRNA a été transfecté dans les cellules Huh7 et
a donné lieu à une expression réduite Myc (Fig (Fig4B).4B) Comme représenté sur
la figure Fig4C,4 C, cellules Huh7 avec un niveau réduit de Myc a remarquablement augmenté
les niveaux de primaire miR-26b, miR-26b précurseur et mature miR-26b. Conformément à notre
hypothèse, le niveau CTDSP1 représenté par plusieurs ensembles amorce / sonde n'a pas été modifié
suite au silence Myc (Fig (Fig4C).4 C). En outre, un tel phénomène a également été étudié dans les
cellules P493-6. Silencing Myc dans P493-6 via l'addition de tetracycline significativement les taux
induits de miR-26b primaire, un précurseur de miR-26b et miR-transcrits matures 26b, mais pas
CTDSP1 (Fig (Fig4D).4RÉ). En tant que contrôle, la désactivation de CTDSP1 via la technologie
siRNA a réduit de manière significative l'expression de CTDSP1, mais pas le niveau de primaire mir-
26b ( données non présentées ). Pendant ce temps, la surexpression de Myc dans les cellules HuH7 et
les cellules HL-7702 a également réduit de manière constante le niveau de miR-26b mais n’a pas
modifié l’expression de CTDSP1 (Figure 6 supplémentaire ). Ensemble, nos résultats indiquent que
Myc inhibe spécifiquement miR-26b mais pas CTDSP1 au niveau de la transcription.
 Ouvrir dans une fenêtre séparée
Figure 4
Myc a inhibé l'expression de miR-26b au niveau de la transcription mais pas l'expression de
CTDSP1.(A) Les sites de liaison Myc présumés, mis en évidence par la littérature et les données de
puce ENCODE dans la région de 2ko, en face du site miR-26b TSS. (B) Myc a été évalué aux niveaux
de protéine (panneau de gauche) et d'ARNm (panneau de droite) dans HuH7 transfecté avec le sic de
Myc. (C) L'expression des transcrits primaire, précurseur et mature de miR-26b a été examinée dans
des cellules HuH7 transfectées avec l'ARNsc de Myc par l'intermédiaire de la qRT-PCR. CTDSP1 a
été examiné à l’aide de trois ensembles différents d’amorces et de sondes couvrant ses Exon 1-2, Exon
2-3 et Exon 4-5. (D) L'expression de Myc, miR-26b et CTDSP1 (Exon 1-2) a été examinée par qRT-
PCR dans des cellules P493-6 avec et sans la présence de tétracycline. Myc a également été examiné
avec Western Blot. (E) Le diagramme schématique des modèles transcriptifs potentiels pour les
miARN introniques. Au niveau génomique, le miARN intronique et le «gène hôte» sont co-
localisés. Dans le modèle de transcription courant, le miARN intronique est co-transcrit avec son gène
hôte et le miARN précurseur est ensuite traité par l'ARNm spliceosome et Drosha. Dans le modèle de
transcription indépendante, les gènes miARN et hôte principaux sont transcrits de manière
indépendante à partir de leurs propres TSS non apparentés. Il est ensuite traité séquentiellement par
Drosha et Dicer pour produire un miARN mature via un miARN précurseur. Le modèle de
transcription indépendante représente un mécanisme de régulation de la transcription plus flexible des
miARN introniques. il est séquentiellement traité par Drosha et Dicer pour produire un miARN mature
via un miARN précurseur. Le modèle de transcription indépendante représente un mécanisme de
régulation de la transcription plus flexible des miARN introniques. il est séquentiellement traité par
Drosha et Dicer pour produire un miARN mature via un miARN précurseur. Le modèle de
transcription indépendante représente un mécanisme de régulation de la transcription plus flexible des
miARN introniques.

En outre, nous avons examiné si d'autres facteurs de régulation pourraient modifier différemment
l'expression des miARN introniques et de leurs gènes hôtes. Nous avons utilisé les données de
transcriptome miARN et ARNm des cellules MCF-7 et MDA-MB-231 avec 6 heures et 48 heures de
traitement par ATAR. Dans cet ensemble de données Cells_ATRA, 142 miARN introniques et leurs
gènes hôtes ont été identifiés. Après les traitements, des taux d’expression de 63% à 80% des miARN
introniques ont montré une altération discordante avec les gènes de leur hôte correspondant entre
différentes cellules et différents moments (Fig. 7 supplémentaire ). Celles-ci ont indiqué que les
facteurs de régulation de la transcription et les éléments de nombreux miARN introniques étaient
probablement distincts de leurs gènes hôtes.
Aller à:

Discussion
Après avoir été découverts en 1993 dans le cadre d'études sur Caenorhabditis elegans 1 , il a été
reconnu que les miARN avaient une voie de biogenèse conservée et présentaient une large
signification fonctionnelle dans les règnes végétal et animal. Il existe actuellement environ 2 000
microARN humains enregistrés dans miRBase. Des travaux récents ont commencé à clarifier notre
compréhension de la régulation transcriptionnelle de l'expression des miARN.
Les miARN sont codés dans le génome dans divers contextes: ils peuvent être exprimés à partir de
transcrits introniques ou intergéniques, qui peuvent coder pour un seul précurseur d'épingle à cheveux
de miARN, ou des grappes de plusieurs précurseurs. Au niveau transcriptionnel, les miARN
introniques canoniques et les mirtrons récemment rapportés (dérivés d'épingles à cheveux introniques
courtes et d'épissage utilisé pour contourner le clivage de Drosha 38 ) étaient supposés partager les
unités de transcription avec les gènes hôtes correspondants et être sous l'influence de gènes partagés.
mécanismes de régulation de la transcription. Par conséquent, les miARN introniques devraient avoir
une expression très cohérente avec leurs gènes hôtes. Ce modèle est appelé « transcription commun »
de introniques miARN (Fig (Fig44 E).
Cependant, la régulation de la transcription des miARN introniques semble être un processus très
complexe et des profils d'expression différentiels entre plusieurs miARN introniques et leurs gènes
hôtes chez Drosophila 8 , 9 . Les méthodes informatiques ont prédit qu'environ un tiers des miARN
introniques humains occupaient des promoteurs indépendants de leurs gènes hôtes 7 , 10 - 13 . Ceux - ci
indiquent l'existence d'un potentiel intronique miARN modèle « transcription indépendant »
(figure (Fig4E).4E). En utilisant les données de transcriptome à haut débit disponibles à la fois pour le
miARN et l'ARNm dans un grand nombre d'échantillons tumoraux et non tumoraux de patients
humains, notre travail a révélé que ces paires étaient largement discordantes dans l'expression de
tumeurs ou non tumorales et présentaient des altérations tumeurs vs non-tumeurs. Celles-ci ont indiqué
que l’expression discordante du miARN intronique et de leurs gènes hôtes constituait peu probable
une exception pour quelques paires mais un phénotype commun. En outre, l'expression discordante de
paires de gènes miRNA / hôte représentatives de miR-26s / CTDSP a été validée à la fois dans des
spécimens de HCC humain et dans des lignées cellulaires. Nous avons également identifié de manière
expérimentale l'unité de transcription distincte de miR-26b avec un TSS distinct de son gène hôte et
avons constaté que Myc réduisait de manière unique le transcrit de miR-26b mais pas de
CTDSP1. Pendant ce temps, la plupart des miARN introniques avec des niveaux d'expression
significativement modifiés dans les tumeurs par rapport aux non-tumeurs semblaient avoir des
régulateurs en amont distincts et des signaux de promoteur proximal supplémentaires. Ainsi, nos
données appuient fortement l’existence du modal de «transcription indépendante» du miARN
intronique.
Bien qu'il soit très probable que le modèle de «transcrit indépendant» du miARN intronique soit un
mécanisme important conduisant à une expression discordante des miARN introniques et de leurs
gènes hôtes, d'autres mécanismes pourraient également contribuer à un tel phénomène. Par exemple,
des études ont montré que l'épissage alternatif contribuait à l'expression non couplée des miARN
introniques et de leurs gènes hôtes 14 , 39.. Des études systématiques sur des données de réseaux d'exons
et de réseaux d'ARNm dans le même ensemble d'échantillons avec et sans certains traitements
pourraient révéler dans quelle mesure les miARN introniques sont transcrits via leur propre
mécanisme de transcription, ou co-exprimés avec les gènes de l'hôte ensemble, puis épissage, ou
transcrits avec uniquement certaines variantes des gènes de l'hôte (c'est-à-dire un mécanisme
d'épissage alternatif). Une telle étude permettra également de mieux comprendre si, dans certaines
conditions, le modèle de transcription commun ou le modèle de transcription indépendant était
dominant, ainsi que sur la relation potentielle de ces deux modèles.
Outre le découplage des niveaux d'expression des miARN introniques et de leurs gènes hôtes
pertinents, nous avons également remarqué leurs rôles biologiques distincts. Dans la cohorte
LCS_HCC, en utilisant les substituts du gène corrélés positivement ou négativement de 14 miARN
introniques liés à la tumeur et leurs gènes hôtes, l'analyse d'enrichissement en GO a été réalisée. Le
processus biologique enrichi du top 15 de l'analyse GO a révélé que la plupart des miARN introniques
participent à des fonctions biologiques distinctes avec leurs gènes hôtes
(Figure 8 supplémentaire ). Pour les paires de miR-26 / CTDSP, miR-26a / b avait été reconnu comme
étant un important gène suppresseur de tumeur dans divers cancers, tels que le cancer du sein, le
cancer du sein et le cancer de la prostate, afin d'inhiber la prolifération cellulaire, l'invasion, les
métastases et l'angiogenèse. induire l'apoptose 18 , 34, 40 - 42 . A l' inverse, CTDSPs semble exprimer plus
élevée dans les tumeurs par rapport aux non-tumeurs de plusieurs cancers, notamment le cancer
pancréatique, le gliome et les sarcomes, ainsi que CHC 43 - 47 (Fig . (Fig2)2). Pendant ce temps, la
modification du niveau CTDSP1 dans les cellules HuH7 n’a pas d’influence sur la prolifération
cellulaire (données non présentées). Ainsi, les gènes des paires discordantes ont probablement joué des
rôles distincts dans la cancérogenèse. De plus, nous avons également remarqué que CTDSP1 et miR-
26b ne modifiaient pas l'expression l'un de l'autre et que le silence de CTPSP1 ou la surexpression de
CTDSP1 dans des cellules HuH7 ne modifiait pas le rôle des miR-26 dans l'inhibition de la formation
de colonies de cellules. (Data pas montré). Néanmoins, pour déterminer si les gènes de paires
discordantes pourraient interagir les unes avec les autres et contribuer ainsi à la cancérogenèse, de
futurs travaux complets seront nécessaires en se concentrant sur des paires discordantes uniques pour
certains types de tumeurs et en explorant le rôle de leurs interactions dans la cancérogenèse.
En conclusion, nos résultats indiquent que l'expression des miARN introniques et de leurs gènes hôtes
respectifs est généralement discordante. Le modèle intronique de «transcrit indépendant» du miRNA
pourrait être principalement responsable d'une expression aussi incohérente et permettre aux miARN
introniques de rester fonctionnels dans des situations où la région régulatrice ou les facteurs
influençant les gènes de l'hôte ont été modifiés, ou inversement. Expérimentalement, nous avons
également identifié avec succès le TSS indépendant, l'activité du promoteur et le facteur de régulation
de la transcription de miR-26b. Nos résultats approfondissent les connaissances existantes en matière
de régulation de la transcription des miARN et nous aident à comprendre le processus complexe et
variable de la biogenèse intronique des miARN.
Aller à:

Matériel complémentaire
Figures et tableaux supplémentaires.
Cliquez ici pour un fichier de données supplémentaire. (1.2M, pdf)

Aller à:

Remerciements
Les auteurs remercient le Dr Joshua T. Mendell de l'UT Southwestern Medical Center aux États-Unis
d'avoir offert les cellules P493-6, le Dr Xin Chen de l'UC de San Francisco pour les plasmides Myc-
PT3EF1a et le contrôle PT3EF1a, et le Dr Hui-Chuan Sun de l'Université de Fudan. en Chine pour sa
lecture critique. Nous avons également sincèrement apprécié le soutien du centre de bioinformatique
du centre de cancérologie de l’Université de Hawaii pour l’utilisation du système d’analyse de la voie
Ingenuity.
Ce travail a été financé par le Plan des mille jeunes talents de Chine, Fondation nationale des sciences
naturelles de Chine [No.81672905], le Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales
[N ° 2016QN81012], Projet clé chinois pour les maladies infectieuses [No. 2016ZX10002020-008], et
le programme de recherche intra-muros du centre de recherche sur le cancer, l'Institut national du
cancer des États-Unis [Z01-BC 010313].
Aller à:

Références
1. Lee RC, Ambros V. Une vaste classe de petits ARN chez Caenorhabditis
elegans. Science. 2001; 294 : 862–4. [ PubMed ]
2. He L, Hannon GJ. MicroARN: petits ARN jouant un rôle important dans la régulation des
gènes. Nature examine la génétique. 2004; 5 : 522–31. [ PubMed ]
3. Lee Y, Kim M., Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH. et al. Les gènes de microARN sont transcrits
par l'ARN polymérase II. Le journal EMBO. 2004; 23 : 4051–60. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
4. Varol N, E Konac, Gurocak OS, S. Sozen. Le domaine des microARN dans les cancers. Rapports de
biologie moléculaire. 2011; 38 : 1079–89. [ PubMed ]
5. Baskerville S, Bartel DP. Le profilage des microARN par microarray révèle une coexpression
fréquente avec les miARN voisins et les gènes hôtes. Rna. 2005; 11 : 241–7. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
6. Rodriguez A, S Griffiths-Jones, Ashurst JL, Bradley A. Identification des gènes hôtes et des unités
de transcription de micro-ARN de mammifère. Recherche sur le génome. 2004; 14 : 1902-10. [ Article
gratuit de PMC ] [ PubMed ]
7. Ji J, T Yamashita, A Budhu, M Forgues, Jia HL, Li C. et al. Identification du microARN-181 par
criblage à l'échelle du génome en tant qu'acteur essentiel dans les cellules souches du cancer hépatique
positives pour EpCAM. Hépatologie. 2009; 50 : 472–80. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
8. Aboobaker AA, P Tomancak, N Patel, GM Rubin, EC Lai. Les microARN de drosophile présentent
divers modèles d'expression spatiale au cours du développement embryonnaire. Actes de l'Académie
nationale des sciences des États-Unis d'Amérique. 2005; 102 : 18017–22. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
9. Xiong H, Qian J, He T, Li F. Transcription indépendante de miR-281 dans l'intron d'ODA chez
Drosophila melanogaster. Communications de recherche biochimiques et biophysiques. 2009; 378 :
883–9. [ PubMed ]
10. Ozsolak F, Poling LL, Wang Z, Liu H, Liu XS et Roeder RG. et al. Les analyses de structure de la
chromatine identifient les promoteurs de miARN. Gènes et développement. 2008; 22 : 3172–
83. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
11. Corcoran DL, Pandit KV, Gordon B, A Bhattacharjee, Kaminski N, Benos PV. Les
caractéristiques des promoteurs de microARN de mammifère émergent des données
d'immunoprécipitation de la chromatine de la polymérase II. PloS un. 2009; 4 : e5279. [ Article gratuit
de PMC ] [ PubMed ]
12. Monteys AM, RM Spengler, Wan J, Tecedor L, KA Lennox, Xing Y. et al. Structure et activité des
promoteurs potentiels de miARN introniques. Rna. 2010; 16 : 495–505. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
13. Marsico A, M. Huska, Lasserre J, Hu H, Vucicevic D, Musahl A. et al. PROmiRNA: une nouvelle
méthode de reconnaissance des promoteurs de miARN dévoile la régulation complexe des miARN
introniques. Biologie du génome. 2013; 14 : R84. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
14. Ramalingam P, Palanichamy JK, Singh A, Das P, M Bhagat, MA Kassab. et al. Biogenèse des
miARN introniques situés en grappes par transcription indépendante et épissage
alternatif. Rna. 2014; 20 : 76–87. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
15. Croce CM. Causes et conséquences de la dysrégulation des microARN dans le cancer. Nature
examine la génétique. 2009; 10 : 704-14. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
16. Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. MicroARN dans le cancer. Bilan annuel de
pathologie. 2014; 9 : 287–314. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
17. Budhu A, Jia HL, Forgues M, Liu CG, Goldstein D, Lam A. et al. Identification des microARN
liés aux métastases dans les carcinomes hépatocellulaires. Hépatologie. 2008; 47 : 897-
907. [ PubMed ]
18. Ji J, Shi J, Budhu A, Yu Z, Forgues M, Roessler S. et al. Expression de microARN, survie et
réponse à l'interféron dans le cancer du foie. Le journal de médecine de la Nouvelle-
Angleterre. 2009; 361 : 1437–47. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
19. Ji J, Zhao L, Budhu A, M Forgues, Jia HL, Qin LX. et al. Let-7g cible le collagène de type I
alpha2 et inhibe la migration cellulaire dans les carcinomes hépatocellulaires. Journal
d'hépatologie. 2010; 52 : 690–7. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
20. Ji J, Yamashita T, Wang XW. La signalisation Wnt / beta-caténine active l'expression du
microARN-181 dans le carcinome hépatocellulaire. Cellule et bioscience. 2011; 1 : 4. [ Article gratuit
de PMC ] [ PubMed ]
21. Budhu A, Roessler S, Zhao X, Yu Z, Forgues M, Ji J. et al. Les profils d'expression métabolique et
génique intégrés identifient les biomarqueurs lipidiques associés à la progression du carcinome
hépatocellulaire et aux résultats pour les patients. Gastroentérologie. 2013; 144 : 1066–75. e1. [ Article
gratuit de PMC ] [ PubMed ]
22. Partie S, Roessler S, Fong Dong, Rao V, Takai A, Ji J. et al. La modulation de l'expression de
miR-29 par l'alpha-fœtoprotéine est liée à l'épigénome du carcinome
hépatocellulaire. Hépatologie. 2014; 60 : 872–83. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
23. Roessler S, Jia HL, Budhu A, M Forgues, Ye QH, Lee JS. et al. Une signature unique du gène de
la métastase permet de prédire la rechute de la tumeur chez les patients atteints d'un carcinome
hépatocellulaire au stade précoce. Recherche contre le cancer. 2010; 70 : 10202-12. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
24. Roessler S, EL Long, Budhu A, Chen Y, Zhao X, Ji J. et al. Identification génomique intégrative
de gènes sur 8p associée à la progression du carcinome hépatocellulaire et à la survie du
patient. Gastroentérologie. 2012; 142 : 957–66. e12. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
25. Terao M, Fratelli M, Kurosaki M, Zanetti A, Guarnaccia V, Paroni G. et al. Induction de miR-21
par l'acide rétinoïque dans des cellules de carcinome du sein positives au récepteur d'œstrogènes:
corrélats biologiques et cibles moléculaires. J Biol Chem. 2011; 286 : 4027–42. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
26. Ying SY, Lin SL. Perspectives actuelles dans les micro-ARN introniques (miARN) Journal of
biomomedical science. 2006; 13 : 5-15. [ PubMed ]
27. Yu G, Wang LG, Han Y, Il QY. clusterProfiler: un package R permettant de comparer des thèmes
biologiques parmi des grappes de gènes. Omics: une revue de biologie intégrative. 2012; 16 : 284–
7. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
28. Heintz C, Doktor TK, Lanjuin A, Escoubas C, Zhang Y, Weir HJ. et al. Le facteur d'épissage 1
module la restriction alimentaire et la longévité de la voie TORC1 chez C. elegans. La
nature. 2017; 541 : 102–6. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
29. BM Javierre, OS Burren, SP Wilder, R. Kreuzhuber, SM Hill, S. Sewitz et al. L'architecture du
génome spécifique à une lignée relie des promoteurs de gènes cibles et des variants de maladie non
codants au promoteur de gènes cible. Cellule. 2016; 167 : 1369–84. e19. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
30. Ye QH, Qin LX, Forgues M, He P, Kim JW, AC Peng. et al. Prédire les carcinomes
hépatocellulaires métastatiques positifs pour le virus de l'hépatite B en utilisant le profil d'expression
génique et l'apprentissage automatique supervisé. Médecine de la nature. 2003; 9 : 416–23. [ PubMed ]
31. Chang TC, Yu D, Lee YS, EA Wentzel, Arking DE et West KM. et al. La répression généralisée
des microARN par Myc contribue à la tumorigenèse. Génétique de la nature. 2008; 40 : 43–
50. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
32. Tang X, Zheng D, Hu P, Zeng Z, Li M, Tucker L. et al. La glycogène synthase kinase 3 bêta
inhibe l'amas de microARN-183-96-182 via la voie bêta-caténine / TCF / LEF-1 dans les cellules
cancéreuses gastriques. Recherche sur les acides nucléiques. 2014; 42 : 2988–98. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
33. Knoll S, K Furst, B Kowtharapu, U Schmitz, S Marquardt, O Wolkenhauer, E2F1 induit
l'expression miR-224/452 pour conduire l'EMT via la régulation descendante TXNIP. Rapports
EMBO; 2014. [ Article libre de PMC ] [ PubMed ]
34. Kota J, RR Chivukula, KA O'Donnell, EA Wentzel, CL Montgomery, Hwang HW. et al. La
délivrance thérapeutique de microARN supprime la tumorigenèse dans un modèle de cancer du foie
murin. Cellule. 2009; 137 : 1005-17. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
35. Zhu Y, Lu Y, Zhang Q, Liu JJ, Li TJ, Yang JR. et al. MicroRNA-26a / b et leurs gènes hôtes
coopèrent pour inhiber la transition G1 / S en activant la protéine pRb. Recherche sur les acides
nucléiques. 2012; 40 : 4615-25. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
36. Yang X, Liang L, Zhang XF, Jia HL, Qin Y, Zhu XC. et al. MicroRNA-26a inhibe la croissance
tumorale et les métastases du carcinome hépatocellulaire humain en ciblant la voie de l'interleukine-6-
Stat3. Hépatologie. 2013; 58 : 158–70. [ PubMed ]
37. Yang X, Zhang XF, Lu X, Jia HL, Liang L, Dong QZ. et al. MicroRNA-26a supprime
l'angiogenèse dans les carcinomes hépatocellulaires humains en ciblant la voie du facteur de
croissance des hépatocytes-cMet. Hépatologie. 2014; 59 : 1874–85. [ PubMed ]
38. Okamura K, JW Hagen, H Duan, DM Tyler, EC Lai. La voie mirtron génère des ARN régulateurs
de la classe des microARN chez Drosophila. Cellule. 2007; 130 : 89–100. [ Article gratuit de
PMC ] [ PubMed ]
39. Melamed Z, Levy A, R Ashwal-Fluss, G Lev-Maor, K Mekahel, Atias N. et al. L'épissage
alternatif régule la biogenèse des miARN situés à travers les jonctions exon-intron. Cellule
moléculaire. 2013; 50 : 869–81. [ PubMed ]
40. Koh CM, Iwata T, Zheng Q, Bethel C, S Yegnasubramanian, De Marzo AM. Myc applique la
surexpression de EZH2 dans les néoplasies prostatiques précoces via des mécanismes transcriptionnels
et post-transcriptionnels. Oncotarget. 2011; 2 : 669–83. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
41. Liu XX, Li XJ, B Zhang, YJ Liang, Zhou CX, Cao DX. et al. MicroARN-26b est sous-exprimé
dans le cancer du sein humain et induit l'apoptose cellulaire en ciblant SLC7A11. FEBS
lettres. 2011; 585 : 1363–7. [ PubMed ]
42. Zhang B, Liu XX, He JR, Zhou CX, Guo M., He M. et al. La réduction pathologique de miR-26a
antagonise l'apoptose et facilite la cancérogenèse en ciblant la MTDH et l'EZH2 dans le cancer du
sein. Cancérogenèse. 2011; 32 : 2–9. [ PubMed ]
43. PM Bracci, Zhou M, Young S, Wiemels J. Autoanticorps anti-antigènes du cancer du pancréas
utilisés comme biomarqueurs du cancer du pancréas dans une étude cas-témoins de la région de la baie
de San Francisco. Cancer. 2012; 118 : 5384–94. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
44. Chen X, Cheung ST, So S, Fan ST, Barry C, Higgins J. et al. Profils d'expression génique dans les
cancers du foie chez l'homme. Biologie moléculaire de la cellule. 2002; 13 : 1929-1939. [ Article
gratuit de PMC ] [ PubMed ]
45. Fischer U, Keller A, Leidinger P, Deutscher S, Heisel S, Urbschat S. et al. Une vue différente sur
les amplifications de l'ADN indique des amplicons fréquents, hautement complexes et stables sur
12q13-21 dans un gliome. Recherche sur le cancer moléculaire: MCR. 2008; 6 : 576–84. [ PubMed ]
46. Mas VR, DG Maluf, KJ Archer, K Yanek, Kong X, Kulik L. et al. Gènes impliqués dans la
carcinogenèse virale et l'initiation de la tumeur dans le carcinome hépatocellulaire induit par le virus
de l'hépatite C. Médecine moléculaire. 2009; 15 : 85–94. [ Article gratuit de PMC ] [ PubMed ]
47. Su YA, MM Lee, CM Hutter, PS Meltzer. Caractérisation d'un gène hautement conservé (OS4)
amplifié avec CDK4 dans des sarcomes humains. Oncogène. 1997; 15 : 1289–94. [ PubMed ]