Вы находитесь на странице: 1из 9

SONDAS GÉNICAS

I.- Definición

La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unirá


exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama
especificidad de la sonda.

Es decir, Sonda es una secuencia (fragmento) de ADN monocatenario marcada


con algún isotopo radiactivo o mediante métodos no radiactivos (como
fluorescencia); que se usa para detectar fragmentos de ADN o ARN con homología
secuencial en la paridad de bases nitrogenadas específicas (Guanina con Citosina
y Adenina con Timina).

Las sondas de cDNA se obtienen a partir de la copia de un mRNA y, por tanto,


corresponden a secuencias codificantes de un gen. Las sondas RNA son copias del
RNA y se obtienen in vitro, mediante la síntesis de una cadena complementaria
utilizando una RNA-polimerasa.
El uso y aplicación de las sondas génicas está basado en la aplicación de la técnica
citogenética de Hibridación in situ por fluorescencia (cuyas siglas en inglés la
denominan FISH).

Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La


detección solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable.
Dependiendo del número de estos grupos incorporados y de la señal que emitan la
sonda puede tener diferente sensibilidad.

II.- TIPOS DE SONDAS

A) Según el tamaño: Se escogen en función de la secuencia diana (ADN o ARN)


y se tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana así como el medio
de marcaje y detección.
1. Sondas grandes: secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 1-4 kb.
Pueden ser genómicas, secuencias con intrones y exones, o de ADNc, sin
intrones, obtenidas a partir de la transcripción inversa del ARNm.
2. Sondas pequeñas: son secuencias monocatenarias de 15-50 nucleótidos.
Reciben el nombre de oligonucleótidos sintéticos. Son de ADN.
3. Sondas intermedias: son de ARN.
B) Tipo de sonda y método de síntesis: Distintos tipos de sondas de ácidos
nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridación in situ:

1. Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando


técnicas como “nick translation, random priming o PCR”, en las cuales
el nucleótido marcado es incorporado. PCR y random priming
proporcionan una buena actividad específica. Estas sondas pueden
ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una
cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la
concentración de la sonda marcada es reducida

2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas


utilizando “primer extensión” en templados de cadena simple o por PCR
con un nucleótido marcado. Éste último es el más usado porque es más
fácil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad
de material. El PCR permite una gran flexibilidad en la elección de las
secuencias marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido
ampliamente usadas.

3. Oligonucleótidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando


oligonucleótidos modificados durante la síntesis química o adicionando
una cola marcada. Una de las desventajas es que algunos
oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad
disminuye.

4. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso


de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia
de la sonda es clonada en un vector que flanqueará dos sitios
distintos de iniciación.

La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en dirección


opuesta al gen endógeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con
enzimas que dejen el extremo 5’ cohesivo, porque se ha reportado, que
el extremo 3’ romo promueve la síntesis de transcritos anormales.

III.- MARCAJE DE SONDAS.

Sitios de marcaje o modificación:

Para detectar hibridación hay que usar sondas marcadas o modificadas y para ello
se marcan los nucleótidos sin que se vea disminuida la capacidad de apareamiento
entre bases complementarias. La 2-amino-adenina se incorpora en sondas
pequeñas y forma 3 puentes de H con su complementaria, la timina. La caseina
sustituye a la guanina en el ARN rico en GC y solo forma 2 puentes de H con la
citosina. Si se añaden isótopos radiactivos las propiedades del marcaje no se ven
modificadas.

Posibles sitios de marcaje de las bases:

Adenina: Citosina: Uracilo: Guanina: Timina:

Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda:
el marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografía, o por haptenos (no
radioactivo) el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocitoquímica.

Isotópicos radioactividad
Sistemas directos
No isotópicos no radioactivos
Indirectos

Los sistemas isotópicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio,
así como alta resolución. Por otro lado el empleo de radioisótopos requieren
licencia especial. El método de detección (autorradiografía) requiere un
tiempo de exposición de semanas.
Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un método cuantitativo.

El marcaje de la sonda se puede dar de 2 formas:

Marcaje radiactivo

Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucleótidos que tengan alguno


de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P, pero también es
frecuente el uso de tritio. Este tipo de marcaje es apreciable mediante
autorradiografía. El uso de este tipo de marcaje va a asociado con los peligros que
trae el uso de elementos radiactivos, así como también por ser un agente
mutagénico este podría llegar a modificar la ultra estructura del ADN de muestra,
razón por la que se desarrolla otro método que es el marcaje inmunológico.

Algunos isótopos han sido usados para marcajes radiocativos en la hibridación in


situ, que difieren en cuanto a la resolución de la señal, la velocidad en
obtención de resultados y la estabilidad de la sonda.

a) 3H - proporciona una señal a nivel subcelular pero requiere largas


exposiciones autorradiográficas.

b) 35S – proporciona resolución de un diámetro celular, con tiempos de


exposición de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT)
pueden ser incluidos en la solución que contenga 35S para proteger al azufre
de la oxidación. La vida media de este isótopo es de 87 días y la marca debe
ser usada en un mes aproximadamente.

c) 32P – da una resolución menor que el 35S y además proporciona una baja
eficiencia en la autorradiografía, ofrece una pequeña ventaja en cuanto a la
velocidad de obtención de resultados. Posee una vida media de 14 días.

d) 33P – da una resolución similar a 35S, pero éste tiene una vida media más
corta (25 días) y el costo es mayor.

Marcaje no radioactivo

Las sondas se marcan utilizando nucleótidos que llevan unida una molécula
(digoxigenina), a la solución se le añaden anticuerpos específicos que se unen
a esa molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto
luminiscente o fluorescente (como fluoróforos o fluorocromos: fluoresceína,
rodamina) que deja impronta fotográfica.

Existen dos tipos de sistemas no isotópicos para la prueba de hibridación:


directo e indirecto.
 El método directo, la molécula detectable (reportera) es enlazada
directamente al ácido nucleico y este híbrido puede ser visualizado
en el microscopio inmediatamente después de la reacción de
hibridación. El paso limitante en éste método es que el híbrido subsista
a las condiciones de lavado. Lo más importante, además, es que la
molécula reportera no interfiera con la hibridación.
 Los métodos indirectos, requieren una marca que contenga la
molécula reportera, introducida química o enzimáticamente, que pueda
ser detectada por afinidad citoquímica. En este método al igual que el
anterior, el marcaje no debe interferir con la hibridación, ya que la
molécula reportera debe estar accesible a los anticuerpos que la
detecten.
IV.- VENTAJAS DE LAS SONDAS GENÉTICAS

Las ventajas de estas técnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que esté en cultivo
puro.
Hoy en día se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento
crecimiento o difícil y de identificación compleja. Es posible utilizarlo en cualquier
tiempo de muestra biológica y permite la identificación de genes no expresados
fenotípicamente. Son técnicas muy válidas, pues el ADN es muy estable.

Los inconvenientes más importantes son que se necesitan un número mínimo de


copias del fragmento de ácido nucleico problema que se quiere detectar, por eso en
las muestras con escasos número de unidades infecciosas se obtiene una baja
sensibilidad. En ocasiones este problema se resuelve detectando ARN en vez de
ADN, pues el primero suele estar en mayor cantidad.

Otra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el


número de copias mediante técnicas de amplificación.

Actualmente disponemos de sondas (Gen-Probe®, Syngene®) para identificación


de M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. Entre las
principales ventajas de las sondas genéticas hay que destacar la sencillez de su
manipulación, que permite su adaptación a cualquier laboratorio. El principal
inconveniente es su coste. Es una tecnología muy utilizada en la actualidad en
laboratorios nivel II.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

Sondas Génicas
Se obtienen y basan su elaboración a partir de la gran cantidad de secuencias de
ADN repetitivo (intergénico: disperso o yuxtapuesto “en tándem”) encontradas en y
alrededor del centrómero de cromosomas específicos. En la actualidad son usadas
para el diagnóstico rápido.

Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional:

En la actualidad hay un gran número de sondas comerciales disponibles,


ofreciendo todas ellas un resultado rápido y fiable en la caracterización de
determinadas anomalías cromosómicas.
Se distinguen 4 tipos de sondas, en función de las estructuras que son capaces de
detectar en el núcleo celular o en metafase.

 Sondas locus específico:


Estas sondas hibridan con una secuencia única de ADN, son específicas
para un locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific
identifier). EN función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 kb (plámidos) o
son vectores más largos 80kb - 1Mb (Bacterial artificial chromosomes –
BACs, Yeast artificial chromosomes-YACs)
Las sondas de secuencia única permiten detectar reordenamientos
estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar
delecciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Mb: No obstante,
su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.

 Sondas centroméricas:
Identifican los centrómeros, los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos
para todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que
permite que la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser
distinguidos a excepción de los centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y
de los centrómeros de los cromosomas 14 y 22.
Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones de tipo
numéricos, especialmente monosomías, trisomías y otras aneuploidías en
metafases y también en núcleos interfásicos. Se conocer como sondas CEP
(chromosome enumeration probe)
 Sondas subteloméricas:
Son sondas de ADN que identifican regiones cromosómicas próximas a los
telómeros, que contienen secuencias únicas que son específicas para cada
cromosoma. Poseen una alta resolución que varía según la medida de la
sonda utilizada (30-100 Kb). Han demostrado ser una herramienta muy útil
para la detección de muchas anomalías cromosómicas que implican las
regiones teloméricas. Dicha identificación es importante dado que estas
regiones subteloméricas contienen gran cantidad de genes.

 Sondas de pintado cromosómico:


Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un
determinado cromosoma se consigue pintar sólo los cromosomas homólogos
correspondientes, permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones
numéricas y estructurales intercromosómicas que afectan a ese cromosoma
específico.
Son sondas complejas de ADN, generadas a partir de cromosomas
microdiseccionados que se amplifican por DOP-PCR (Degenerate
Oligonucleotide Primer-Polimerase Chain Reaction), se marcan e hibridan
con múltiples secuencias del cromosoma, con excepción de las regiones
centroméricas y teloméricas. Así, tras la hibridación aparece pintado
uniformemente todo el cromosoma. Estas sondas, también conocidas como
sondas WCP (whole chromosome painting) sirven fundamentalmente para
detectar traslocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética
convenciones, así como para identificar el origen de material adicional
presente en un cromosoma derivativo o en pequeños marcadores
supernumerarios. Si bien se pueden utilizar en interfase, se aconseja su uso
sobre metafase.
Los principales inconvenientes de la utilización de estas sondas son la no
detección de inversiones paracentroméricas y su baja resolución, que impide
detectar pequeñas delecciones, duplicaciones y traslocaciones (˂ 2-3 Mb)
Con el pintado cromosómico múltiple se consigue pintar de forma simultánea
todos los cromosomas pero en metafases independientes. Esta variante de
FISH se realiza utilizando el Kit comercial Chromoprobe-M Multiprobe
System, (CytoCell Ltd, UK).
OTRAS SONDAS

Pintar cromosomas:
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en
particular. Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridación, el cromosoma
entero fluorece, por lo que decimos que está “pintado”. Pintar cromosomas es muy
útil para caracterizar reordenamientos complejos, tales como translocaciones
sutiles, y para identificar el origen de material adicional de un cromosoma, como
pequeños marcadores de supernumerarios o anillos.

Pintar a la inversa:
En este procedimiento una porción de material cromosómico no identificado,
pequeños marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por hibridación
una metafase normal. El cromosoma no identificado se obtiene por separación de
células activadas por fluorescencia, el cual es amplificado utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para preparar dicha pintura. El origen del segmento
no identificado se obtiene mediante la identificación del cromosoma sobre el cual se
hibrida.

Cariotipo de espectro multicolor:


El último logro de la tecnología FISH es utilizar todas las sondas cromosómicas para
obtener un cariotipo humano multicolor, en el cual cada par de homólogos
cromosómicos puede ser identificado en base a su color. Para un cromosoma
completo cada sonda se prepara de tal forma que, cuando se une a un marcador
fluorescente, da una señal espectral diferente, que se analiza con un programa de
ordenador. Este abordaje es extremadamente útil para detectar sutiles
reordenamientos cromosómicos o constitucionales en pacientes con anomalías
adquiridas, como el cáncer, o del desarrollo.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA (CGH)

La CGH (del inglés comparative genomic hybridization) es una ventajosa


modificación del método de pintar a la inversa, de gran utilidad en genética del
cáncer para detectar regiones de pérdidas alélicas y amplificación génica. El ADN
experimental o tumoral se pinta de color verde y rojo el ADN control. Las dos
muestras se mezclan e hibridan sobre metafase normal. Si la muestra experimental
contiene más ADN de una región cromosómica en particular que la muestra control,
la región se identificará por el incremento de fluorescencia verde sobre la roja. De
forma análoga, una delección en la muestra experimental mostrará una reducción
en la proporción verde sobre rojo.

Sondas PML/RARA

Las sondas satélites consisten en secuencias específicas generadas de satélites


DNA altamente repetitivo, localizados en regiones centroméricas, pericentroméricas
o heterocromáticas de cada cromosoma.
Estas sondas permiten una rápida identificación y enumeración de cada uno de los
cromosomas, tanto en interfase como en metafase.
También se ofrecen sondas satélite doblemente marcadas para X e Y, cada una de
ellas marcada con rojo o verde respectivamente.

BIBLIOGRAFÍA

1. Jorde L, Carey J, Bamshad M. Genética Medica. 4ta ed. Edit Elsevier


España. Barcelona-España; 2011.

2. Hernando C, Caracterización de anomalías cromosómicas en diagnóstico


prenatal y postnatal mediante técnicas de citogenética molecular. Tesis
doctoral; 2005

3. Blanca Ramos Cerrillo. “Hibridación in situ”Universidad Nacional Autónoma


de México. [Acceso 12 de Abril del 2014]. Disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/hibridacion_in_situ.pdf

4. Pedro Fernández Ruiz. “Hibridación de los ácidos nucleicos”. Hospital


Clínico/ IDIBAPS/Universidad de Barcelona. [Acceso 12 de Abril del 2014].
Disponible en:
http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-
bcfb-d75fd6b2ee9f&groupId=10157

Вам также может понравиться