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I.- Definición
Para detectar hibridación hay que usar sondas marcadas o modificadas y para ello
se marcan los nucleótidos sin que se vea disminuida la capacidad de apareamiento
entre bases complementarias. La 2-amino-adenina se incorpora en sondas
pequeñas y forma 3 puentes de H con su complementaria, la timina. La caseina
sustituye a la guanina en el ARN rico en GC y solo forma 2 puentes de H con la
citosina. Si se añaden isótopos radiactivos las propiedades del marcaje no se ven
modificadas.
Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda:
el marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografía, o por haptenos (no
radioactivo) el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocitoquímica.
Isotópicos radioactividad
Sistemas directos
No isotópicos no radioactivos
Indirectos
Los sistemas isotópicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio,
así como alta resolución. Por otro lado el empleo de radioisótopos requieren
licencia especial. El método de detección (autorradiografía) requiere un
tiempo de exposición de semanas.
Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un método cuantitativo.
Marcaje radiactivo
c) 32P – da una resolución menor que el 35S y además proporciona una baja
eficiencia en la autorradiografía, ofrece una pequeña ventaja en cuanto a la
velocidad de obtención de resultados. Posee una vida media de 14 días.
d) 33P – da una resolución similar a 35S, pero éste tiene una vida media más
corta (25 días) y el costo es mayor.
Marcaje no radioactivo
Las sondas se marcan utilizando nucleótidos que llevan unida una molécula
(digoxigenina), a la solución se le añaden anticuerpos específicos que se unen
a esa molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto
luminiscente o fluorescente (como fluoróforos o fluorocromos: fluoresceína,
rodamina) que deja impronta fotográfica.
Las ventajas de estas técnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que esté en cultivo
puro.
Hoy en día se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento
crecimiento o difícil y de identificación compleja. Es posible utilizarlo en cualquier
tiempo de muestra biológica y permite la identificación de genes no expresados
fenotípicamente. Son técnicas muy válidas, pues el ADN es muy estable.
Sondas Génicas
Se obtienen y basan su elaboración a partir de la gran cantidad de secuencias de
ADN repetitivo (intergénico: disperso o yuxtapuesto “en tándem”) encontradas en y
alrededor del centrómero de cromosomas específicos. En la actualidad son usadas
para el diagnóstico rápido.
Sondas centroméricas:
Identifican los centrómeros, los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos
para todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que
permite que la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser
distinguidos a excepción de los centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y
de los centrómeros de los cromosomas 14 y 22.
Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones de tipo
numéricos, especialmente monosomías, trisomías y otras aneuploidías en
metafases y también en núcleos interfásicos. Se conocer como sondas CEP
(chromosome enumeration probe)
Sondas subteloméricas:
Son sondas de ADN que identifican regiones cromosómicas próximas a los
telómeros, que contienen secuencias únicas que son específicas para cada
cromosoma. Poseen una alta resolución que varía según la medida de la
sonda utilizada (30-100 Kb). Han demostrado ser una herramienta muy útil
para la detección de muchas anomalías cromosómicas que implican las
regiones teloméricas. Dicha identificación es importante dado que estas
regiones subteloméricas contienen gran cantidad de genes.
Pintar cromosomas:
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en
particular. Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridación, el cromosoma
entero fluorece, por lo que decimos que está “pintado”. Pintar cromosomas es muy
útil para caracterizar reordenamientos complejos, tales como translocaciones
sutiles, y para identificar el origen de material adicional de un cromosoma, como
pequeños marcadores de supernumerarios o anillos.
Pintar a la inversa:
En este procedimiento una porción de material cromosómico no identificado,
pequeños marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por hibridación
una metafase normal. El cromosoma no identificado se obtiene por separación de
células activadas por fluorescencia, el cual es amplificado utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para preparar dicha pintura. El origen del segmento
no identificado se obtiene mediante la identificación del cromosoma sobre el cual se
hibrida.
Sondas PML/RARA
BIBLIOGRAFÍA