LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

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Grupo:
Docente: Fecha de Realización:
Fecha de Entrega:
Vo. Bo.
Calificación:
Especialidad: Producción industrial de Alimentos.

PRACTICA: 5
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

OBJETIVO:
Al término de la práctica el aluminio identificara la carga proteica en un huevo,
cumpliendo con la identificación cualitativa de los aminoácidos contenidos de dicho
material.

FUNDAMENTO:
Las proteínas son compuestos orgánicos constituidos básicamente por: C H O y N además
de S, P, T. Se clasifican de acuerdo a la estructura y a su solubilidad. Por su estructura son
fibrosas y globulares.
Las proteínas fibrosas son insolubles en agua y actúan como elementos estructurales de los
tejidos animales y en algunos casos desempeñan funciones de protección. Como ejemplo
de este tipo se tienen queratina que se encuentra en la piel, cabello, uñas, cuernos, plumas,
pezuñas. Las proteínas globulares son solubles en sistemas acuosos, como por ejemplo: la
albumina, hemoglobina, la insulina y la tiro globulina.
Las proteínas también se clasifican de acuerdo a su función biológica en: enzimas,
proteínas de reserva, de transporte, contráctiles, de defensa de la sangre, toxina, hormonas
y estructurales.
La desnaturalización que experimenta las proteínas bajo la acción de diversos agentes
como el calor, los detergentes, la radiación UV, los ácidos y bases fuertes, el etanol etc.
Básicamente consiste en la pérdida de su configuración tridimensional debido a la ruptura
que experimentan los enlaces de hidrogeno.
En esta práctica se identifican la albumina del huevo mediante algunos procedimientos
básicos para la identificación de proteínas

MATERIALES Y EQUIPO:

2 vasos de precipitado de 250 ml. 1 baño maría

1 pipeta graduada de 10 ml 1 probeta graduada de 100 ml
1 gradilla con 12 tubos de ensaye 1 termómetro
1 tripie 1 anillo metálico
1 embudo de filtración 3 tapones para tubo
1 agitador 1 mechero bunsen
1 pinza para tubo de ensaye 1 parrilla eléctrica
REACTIVOS
Huevo Alcohol etílico
Hidróxido de sodio al 10% Sulfato cúprico al 0.1%
Ácido nítrico concentrado Papel indicador
Solución saturado de NaCl Solución de acetato de plomo al 10%

TÉCNICA:
A) SOLUBILIDAD:

1. Realice un orificio pequeño a un huevo y deposite lo clara en un vaso de precipitado

2. Enumerar los 3 tubos de ensaye y a c/u agregue 1 ml de clara de huevo.

3. A cada tubo añada, 5 ml de agua fría, agua caliente y solución de hidróxido de

sodio al 10% respectivamente. Tápalos con tapones, agítalos y anota tus observaciones
sobre la solubilidad dela albumina de huevo.

4. En un vaso de pp. coloque 20 ml. de clara de huevo y añade 60 ml. de agua

destilada, agita y filtra, colocando en el embudo un pedazo de gasa doble. El filtrado se
denominara solución: “A” se usara para realizar los experimentos siguientes.
B) PRUEBAS COLORIDAS:

1. REACCIÓN DE BIURET: En un tubo de ensaye coloque 1 ml. de solución “A” y 1 ml. de

solución de NaOH al 10% posteriormente añada unas cuantas gotas de solución de
sulfato cúprico al 0.1% hasta observar algún cambio de su coloración.

2. PRUEBA XANTOPROTEICA: Agregue 2 ml. de solución “A” en un tubo de ensaye y

agréguele 5 gotas de HNO2 concentrado caliente hasta ebullición y deje enfriar.
Observe los cambios de coloración.

3. A la solución anterior añádele unas cuantas gotas de NaOH al 10% hasta que la
solución sea básica, después de agitar, use papel indicador de Ph o tornasol.

4. PRUEBA DEL ANILLO DE KELLER: Agregue 3 ml de HNO concentrado en un tubo de

ensaye, incline el tubo y añada unas gotas de solución “A” de tal forma que resbale
por las paredes y se forme un anillo. Anote sus observaciones.

5. PRUEBA CON SALES MINERALES (DE METALES)

a) Coloque 4 tubos y enumérelos, a cada uno de ellos agrégale 2 ml de solución “A”
b) A los tubos 1 y 3 añádeles 2 gotas de ácido acético al 10% hasta que el medio
sea ligeramente acido, agite y use el papel indicador
c) A los tubos 2 y 4 no añada nada, ya que la albumina fresca y en su estado líquido
es ligeramente básica
d) A los tubos 1 y 2 añade 1 ml de solución saturada de NaCl, a los tubos 2 y 4, 2
gotas de solución acetato de plomo al 10%
6. EFECTO CALOR
 a) A un vaso de pp que contenga 50 ml de agua, agregue 3 ml de solución “A”
b) Coloca un termómetro en el baño de agua y caliente ligeramente el vaso
c) Observe y registre a que temperatura empezó a coagularse la proteína
7. EFECTO ALCOHOL ETÍLICO
A un tubo de ensaye que contenga 3 ml de solución “A” agrega 5ml de alcohol
etílico comercial, anote sus observaciones

OBSERVACIONES

 A) SOLUBILIDAD:
La solubilidad se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y débiles estén
presentes. Si se aumenta la temperatura y el pH, se pierde la solubilidad.

MUESTRA AGUA FRÍA AGUA CALIENTE NaOH

INSOLUBLE, MUY
CLARA DE HUEVO SOLUBLE INSOLUBLE
VISCOSA

 B) PRUEBAS COLORIDAS:

1) REACCIÓN DE BIURET:

Observamos que cuando una proteína se pone en contacto con un álcali

concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha
reacción fue que percibimos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas
solución de proteína precipito una coloración violeta. Quedando en el fondo del
tubo una tonalidad azul cielo dando una reacción positiva. En caso de que la
reacción sea negativa se precipitara una coloración amarilla al no haber presencia
de proteínas.

La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción la
presencia de proteínas. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa
alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de una compuesto
de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre iones
Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forman parte de los
enlaces
peptídicos
presentando un
máximo de
absorción a
540nm.
 Esta es una ampliación del
resultado de la reacción
de Biuret

La prueba de biuret funciona para cualquier compuesto que

contenga dos o más de los siguientes grupos:

2) REACCION XANTOPROTEICA:

En el tubo de ensaye dela reacción Xantoproteica podemos percibir un color

amarillento, por lo que nos muestra que existen proteínas en la muestra, el color
amarillo es representativo de los restos aromáticos como la Tirosina y la Fenilalanina.

Esta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los

complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la
tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza
en el laboratorio. La reacción xantoproteica a su vez se puede considerar como una
sustitución electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el
ácido nítrico que reacciona.

¿Cómo se lleva a cabo la reacción xantoproteica ?

En este caso, el ensayo de Biuret dio positivo por la coloración violeta por lo cual
fueron localizadas proteínas a partir de esta reacción.
Pero en el caso del Xantoproteico, se dio una coloración casi incolora por lo que no
tiene restos aromáticos.

3) PRUEBA DEL ANILLO DE KELLER:

La formación de un precipitado blanco es la unión de ambos líquidos
Al cabo de tres minutos indica la presencia de proteína. Pude intentarse
Cuantificar la densidad del anillo formado.
 4) PRUEBA CON SALES MINERALES (DE METALES):
A cada uno de los tubos, se le agregó 2ml. de Solucion “A”. y le añadimos 2 gotas
de ácido acético y no hubo cambios de coloración. Después se le agrego NaCl,
(1 ml Solución saturada) y tampoco hubo cambios de coloración. Se le agregaron
gotas de solución de acetato de plomo a 10% y observamos que torno a un color
blanco.

5) EFECTO CALOR:
Cuando se puso a calentar la mezcla y empezó a coagularse la proteína con un
temperatura de 65°C.

6) EFECTO ALCOHOL ETÍLICO

Se observó que queda una solución blanca. El alcohol va desnaturalizando las
proteínas del huevo, que se encuentran principalmente en la clara. Cuando las
proteínas se desnaturalizan pierden parte de su estructura molecular y por eso su
aspecto cambia. Casi inmediatamente observamos que la clara se va volviendo
blanca y sólida igual que ocurre cuando cocinamos un huevo. Y es que el calor
también desnaturaliza las proteínas.
OBSERVACIONES DESDE EL PUNTO TEÓRICO

 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

Las proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas,
que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos de glúcidos a la cadena
de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovoalbúmina, que es una
fosfoglicoproteína. La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la
que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).
La ovoalbúmina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un
peso. Molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en
bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como
transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor
a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada
de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.
La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a
la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los
aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado,
se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reacción fue
que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre más solución de
proteína precipitó una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una
tonalidad azul cielo reacción positiva. Precipitando a una coloración amarilla la
reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas.
 PRUEBAS COLORIDAS
Estos esquemas revelan los cambios de coloración en el proceso

 REACCIÓN DE BIURET:

 PRUEBA XANTOPROTEICA:

 PRUEBA DEL ANILLO DE KELLER:

 PRUEBA DE SALES DE MINERALES

B)

D)

 PRUEBA DE ALCOHOL
 RESULTADOS:

A: solución albumina 25%

NOMBRE DE LA RX. REACCIÓN RESULTADO

Pp de albúmina 5ml A + 1.5g (NH4)2SO4  agitar Coágulos blanco lechoso

Coagulación de 5ml A + 5ml(NH4)2SO4  filtar, agregar

Pequeños coágulos blancos
albúmina agua

Coagulación de
5ml A+ H2O  calentar No se dio la coagulación
albúmina

Pp iones pesados 5ml A+Pb(C2H3O2)4+NaOH calentar Precipitado color negro (SPb)

2ml A+4 ml a. tricloroacético (10%) Coágulos blanco lechoso

2ml A+4 ml a. tánico (5%) Precipitado color maíz

Pp por ácidos
2ml A+1 ml HCl (cc) Precipitado

2ml A+4 ml a. sulfosalicílico (5%) Precipitado translúcido

Presencia de dos fases

3ml A+ClK+ 3 ml OH
Precipitado transparente
Pp por alcohol
Formación de un anillo en el
3ml A + 3 ml OH
centro del tubo
 CUESTIONARIO

1) ¿Cuál es la unidad básica de las proteínas?

La unidad fundamental de una proteína son los aminoácidos, estos se unen entre sí
por una unión peptídica y forman así una cadena poli peptídica. Si la masa de
esta cadena es mayor a los 6000 dantons entonces se la considera una proteína, si
es por debajo de ese valor se lo considera un péptido
 2) Investigue los métodos de identificación de proteínas

3) Mediante un cuadro sinóptico clasique a las proteínas

CLASIFICACIÓN SEGÚN SU COMPOSICIÓN

HOLOPROTEÍNAS HETEROPROTEÍNAS

FIBROSAS GLOBULARES GLUCOPROTEINAS FOSFOPROTEINAS LIPOPROTEINAS CROMOPROTEINAS

Colágeno
Queratina -Mucinas -Caseína de -Hemoglobina
-HDL
Elastina -Proteína la leche -Hemocianina
Histonas -LDL
Fibroina anticogelante -Citocromos
-Vitelina
Enzimas Globulinas: -Glucoproteina
a-globulina AYB
Albuminas: b-globulina
ovoalbúmina g-globulina
seroalbúmina
lactoalbúmina
a
 4) ¿Qué es la desnaturalización de proteínas?

R=Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el

disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura inferior). Se llama
desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior
(secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a
un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente

disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la
agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser
consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces que la
proteína se encuentra desnaturalizada (Figura superior).

En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo tienen

en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los
demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura
desnaturalizada.
La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

 cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y

disminuye el coeficiente de difusión
 una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior
aparecen en la superficie
 pérdida de las propiedades biológicas

Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este
motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible ya que es la estructura
primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles
superiores de estructuración. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada
recupera su estructura nativa se llama renaturalización.
Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación
de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un
cambio en el medio donde se encuentra disuelta.
 En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad,
con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente
hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes

desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes,
disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la
desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva
mediante cambios en:

 la polaridad del disolvente

 la fuerza iónica
 el pH
 la temperatura
CONCLUSIÓN:
En la elaboración de esta practica observamos y aprendimos las reacciones de las
pruebas realizadas en la proteína denominada como albumina del huevo, en cada
prueba tiene diferentes características físicas (color, viscosidad etc) además
reconocimos la solubilidad en las proteínas.

Aprendimos que la solubilidad se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y

débiles estén presentes. Si se aumenta la temperatura y el pH , se pierde la
solubilidad.

Todas estas pruebas son para determinar la presencia de proteínas solubles en una
solución, el cambio de coloración determina si el resultado es positivo o negativo, un
claro ejemplo es la reacción de biuret, ante un resultado positivo hubo un cambio de
coloración a violeta indicando la presencia de enlaces péptidos.
Si el pH del medio es menor que el punto isoeléctrico, las proteínas se comportan
como cationes y, si el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones. La
carga de la proteína se hace más negativa a medida que el pH del amortiguador se
hace más básico. A pH 8,6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen
carga global negativa). La albúmina, con pI de 4,7 tendrá una mayor carga negativa
que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que
la albúmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se sitúen
en un campo eléctrico.

BIBLIOGRAFÍA
https://es.slideshare.net/jomachi/practica-de-laboratorio-5-identificacin-de-protenas
http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/tema10.htm
http://blogs.unlp.edu.ar/quimicaorganica/category/proteinas/
ESQUEMAS