TUGAS

KAPITA SELEKATA
“TEKNIK FORMULASI EKSOSOM DARI TURUNAN MAKROPHAG UNTUK
PENGIRIMAN OBAT PACLITAXEL YANG DITARGETKAN KE METASTASIS
PARU: EVALUASI IN VITRO DAN IN VIVO”

OLEH
KELOMPOK 5
NURLIATI (17.01.461)
MUH.ANUGRAWAN
TRANSFER D 2017

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI

MAKASSAR
 2018

TEKNIK FORMULASI EKSOSOM DARI TURUNAN MAKROPHAG UNTUK

PENGIRIMAN OBAT PACLITAXEL YANG DITARGETKAN KE METASTASIS
PARU: EVALUASI IN VITRO DAN IN VIVO

Mengapa formulasi (AA-PEG-exo-PTX) ini dilakukan untuk mengatasi Kanker

Metatasis pada paru paru ?
Karena ?
1. Metatasis Paru
Metastasis adalah penyebaran kanker dari suatu organ ke organ tubuh lainnya
seperti keotak, tulang, paru-paru dan hati. Dimana sel kanker dapat melepaskan
diri dari tumor utama, masuk ke aliran darah, ikut bersirkulasi dalam aliran darah
dan tumbuh dijaringan normal yang jauh dari tumor asalnya. Dan untuk bertahan
hidup hanya kurang lebih 5 tahun setelah seseorang mengalami metastasis.
Sehingga perlu kendaraan atau vesikel untuk terapi, seperti nanoformulasi namun
nanoformulasi biasanya mengalami klirens yang singkat di darah sehingga
efeknya kurang maksimal dan dengan mudah di makan oleh fagosit mononuclear
sebagai system pertahanan tubuh karena setiap komponen yang dianggap asing
akan memicu respon imun. Sehingga diperlukan vesikel lain seperti eksosom
2. Eksosom merupakan vesikel yang berasal dari membran dengan ukuran 40-200
nm yang terdapat dalam cairan tubuh ekstraseluler . eksosom didalam tubuh
membawa RNA dan protein antar sel. studi terbaru mengungkapkan bahwa
eksosom dapat membawa protein terapeutik dan obat yang molekulnya kecil.
Eksosom juga memiliki sifat membranotropik, imunogenisitas yang rendah serta
biokompatibilitas yang tinggi
3. AA-PEG( Aminoethylanisamide Polyethylene-glicol)
Aminoethylanisamide merupakan ligan dengan afinitas yang tinggi artinya
Aminoethylanisamide memiliki kemampuan yang kuat untuk berikatan dengan
reseptor sigma dimana reseptor ini merupakan target dari pengobatan kanker
metastasis paru, sehingga obat PTX yang diformulasikan dengan bahan tersebut
bias memberikan efek yang besar juga. Polyethylene-glicol Seperti zat asing
lainnya nanoformulasi ini juga akan bersifat imunogenisitas, sehingga system
 imun akan terpicu sehingga dapat menimbulkan respon imun dengan adanya
penambahan PEG maka akan menurunkan imunogenisitas, serta dapat
memperlambat waktu klirens oleh mononuclear fogosit (MPS) dari sediaan
sehingga memperpanjang waktu edar disirkulasi dan memperbaiki profil
farmakokinetiknya
4. PTX
Merupakan obat terapi kanker metastasis paru yang memiliki molekul kecil
sehingga cocok untuk vesikel eksosom
METODE KERJA
1. Persiapan vector eksosom untuk target reseptor sigma
a. Diambil darah pada sumsung tulang belakang pada 6 hewan coba C57BL
(tikus ini digunakan karena jenis tikus ini baiasa digunakan pada penelitian
imunologi karena memiliki sequen protein atau materi genetic yang mirip
dengan manusia)
b. Disonifikasi untuk memisahkan eksosom yang berasal dari sel raw 264,7
makrophag yang diambil disumsum tulang belakang dari materi materi lain
yang tidak dibutuhkan seperti trombosit dan protein lain yang terdapat pada
darah
c. Setelah itu diambil supernatanya
2. Pemuatan dan optimasi (AA-PEG-exo-PTX)
Pemuatan dan optimasi ini dibuat dengan 2 formula yaitu:
a. AA-PEG-exo
Untuk penambahn AA-PEG-exo ditambahkan dengan jumlah yang berbeda
yaitu 0,05-0,25 mg/ml
b. PEG-exo
Yang membedakan hanya pada penambahan DSPE-PEG
1. Diambil 1 ml hasil supernatant yang berisi ( 1011 eksosom)
2. Dimasukkan kedalam PBS kemudian ditambahkan PTX (10 mg/10 ml
larutan etanol kemudian ditambahkan DSPE-PEG-AA dengan jumlah yang
berbeda
3. Disonifikasi larutan yang telah diperoleh menggunakan sonikator
4. Dilakukan inkubasi selama 60 menit pada suhu 37oC
5. Di lakukan pemisahan molekul yang lebih besar baik itu molekul PTX
maupun DSPE-PEG-AA dengan menggunakan kromatografi eksklusi
 6. Diukur kadar PTX menggunakan HPLC
3. Biodistribusi eksosom pada daerah metastasis paru yang diberikan secara
intra vena
1. Disuntikan sel kanker 3LL-M27 ( 5x106 sel kanker/100 µl saline) tikus pada
masing masing tikus
2. Eksosom diwarnai dengan pewarna DIL merah, agar dapat dilihat pada saat
pada hasil Photoshop. Dengan cara: eksosom dihidrasi dalam larutan PBS
ditambah 1 mM larutan warna DIL yang dilarutkan dalam DMSO µl. dan
diinkubasi selama 20 menit. Setelah itu dihidrasi kembali dengan PBS
3. Setelah 12 hari disuntikan sel kanker maka akan terbentuk metastasis paru,
dan siap untuk disuntikan AA-PEG-exo yang telah diwarnai
4. Empat jam kemudian tikus dikorbankan kemudian diambil paru-paru
kemudian dipotong dengan ketebalan 20 µm dan diwarnai dengan DAPI (300
mM, 5 menit)
5. Kemudian dilihat menggunakan system mikroskopik confocal fluoresensi
dengan laser ion yang sesuai. Kemudian gambar akan diperoleh dari kamera
CCD dan perangkat lunak photoshot
4. Efek terapi AA-PEG-exo- PTX terhadap metastasis Paru
1. Tikus disuntikkan sel kanker untuk membuat tikus mengalami metastasis
paru
2. Setalah 48 jam disuntikkan diobati dengan memberikan
a. PEG-Exo-PTX
b. Exo-PTX
c. Exo (Kosong) formula tanpa obat
d. PBSaline sebagai control negatife
3. Diberikan 3 kali pada hari 1, 4 dan 7
4. Untuk melihat metastasis kanker tikus dikorbankan dari masing kelompok
perlakuan
5. Diambil ambil paru dan hati kemudian mikroskopi confocal untuk melihat
gambaran dari paru-paru dan hati
HASIL
1. Pembuatan dan karakterisasi AA-PEG-exo-PTX
 Dari gambar tersebut memperlihatkan hasil AA-PEG-DSPE dengan jumlah AA-
PEG-DSPE sebesar 0,25 mg/ml ditunjukan tanda panah menghasilkan hasil yang terbaik
karena dengan jumlah tersebut PTX yang dimuat dalam eksosom lebih banyak hal ini
ditunjukkan pada HPLC gambar (a), dan dengan jumlah tersebut dapat mempertahankan
materi pada gambar (b) dan hasil gambar (c) memiliki hasil yang terbaik dengan angka
yang lebih besar
2. Efek penggabungan AA-PEG-DSPE pada Fluiditas membran dalam eksosome

Dari gambar diatas dapat dilihat penggabungan antara AA-PEG-DSPE kedalam

eksosom mempengaruhi kemampuan obat untuk menembus membrane. AA-PEG
merupakan bahan hidrofobik sedangkan membrane terdiri dari molekul air dan phosfat
dapat dilihat dengan penambahn PEG –AA yang semakin hidrophobik sehingga akan sulit
juga untuk menembus membrane sedangkan exo maupun exo PTX dianggap sulit untuk
menebus membrane karena kurang sifat hidrophobik yang terlalu kecil dapat dilihat
yang paling baik adalah AA-PEG-exo-PTX 0,25 µg/ml.
3. Akumulasi AA-PEG-exo-PTX pada target sel kanker secara in vitro

Pada gambar diatas dapat dilihat bahwa AA-PEG-exo memiliki nilai akumulasi eksosom
yang paling besar ini disebakan adanya AA (aminoetilsinamid) yang mampu berikatan
kuat dengan target reseptor sigma.

Pada gambar diatas juga dapat dilihat nilai akumulasi tertinggi terdapat pada AA-
PEG_exo
4. Ko-lokalisasi exosomes yang diberikan secara sistemik dengan metastasis paru
pada tikus
Lokalisasi eksosom diamati dengan mikroskopik confocal
 Gambar 5. Co-lokalisasi AA-exosomes yang diberikan secara sistemik dengan
metastasis paru. Exosomes diisolasi dari makrofag media yang dikondisikan dan diberi
label dengan pewarna DiL (merah, A dan D). C57BL / 6 tikus yang disuntikkan dengan
sel 3LL-M27 (hijau, B dan E). 7 hari kemudian, tikus yang diberi tumor disuntik iv
dengan exosom diel-labeled non-vectorized (merah, A), atau AA-exosomes (merah, D).
Empat jam kemudian, tikus di-eutanasia, diperfusi, paru-paru dipotong, dan diwarnai
dengan DAPI (biru). Gambar confocal mengungkapkan ko-lokalisasi signifikan dari AA-
exosomes dengan metastasis (94,4 + 0,8%, F) yang lebih besar daripada non-vectorized
exosomes (21,8 + 0,2%, C). Tidak ada exosomes yang ditemukan di paru-paru hewan
sehat tanpa metastasis (GJ).
5. Efek terapi AA-PEG-exo-PTX terhadap metastasis paru
Dari gambar diatas dapat dilihat AA-PEG-exoPTX memiliki kemampuan untuk
menghilangkan sebagian besar sel kanker pada metastasi paru dimana metastasis paru
diberi tanda merah. Pada gambar saline, taxol,exoPTX, dan Eksosom saja tidak dapat
menghilangkan sel kanker dan pada skema gambar B dan C menunjukan bahwa AA-exo-
PTX memiliki kemampuan untuk bertahan di sirkulasi lebih lama dibandingkan formula
yang lain.
Kesimpulan :
AA-PEG-exoPTX memiliki kemampuan untuk mengatasi kanker metastasis paru dilihat
dari evaluasi in vitro dan in Vivo dimana formula tersebut memiliki kemampuan:
1. Mampu terakumulasi pada sel target
2. Memiliki kemampuan untuk berikatan dengan reseptor sigma dimana reseptor
sigma merupakan resetor yang terdapat pada sel kanker metastasis
3. Memiliki imunogenisitas yang rendah
4. Waktu klirens yang lebih lama sehingga obat dapat bertahan lebih lama di
sirkulasi darah