Biochimie

Chapitre 2 :
Enzymologie

I. Enzymes
1) Définitions

Les enzymes sont des catalyseurs de réactions chimiques : elles les accélèrent.

Caractéristiques principales :

Les enzymes sont des protéines (sauf ribozymes = ARN

Augmentent vitesses de réaction sans modifier l'état d'équilibre (n'agit que sur la
vitesse de réaction sans modifier l'état final)

Spécificité d'action : une enzyme catalyse une réaction : un substrat donné ⟶ produit
sous l'action d'une enzyme spécifique à cette réaction, à un substrat donné.)

Agissent à très faible concentration

Leur activité est régulée

Structure intacte après la réaction (se retrouvent sous leur forme de départ)

2) Structure

Constituent la Structure
Protéines de Masse molaire
majorité des complexe
forme globulaire élevée
protéines globulaires en 3D

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Structure (primaire / secondaire / tertiaire / quaternaire) des enzymes :

•Enchaînement des AA dans un ordre déterminé

Primaire

•Structuration de la protéine en hélice alpha et feuillet plissé bêta

•Structures stabilisées par liaisons hydrogènes entre les CO et NH des
Secondaire liaisons peptidiques *

- Repliement de la protéine pour former un globule

- Liaisons faibles (Van der Waals, liaisons hydrogènes, liaisons ioniques,
Tertiaire liaisons hydrophobes) ou ponts disulfures

- Association de plusieurs protéines, identiques ou différentes

Quaternaire
- Mêmes liaisons que pour la structure tertiaire

*Acides aminés : acide/amine (CONH : Liaisons peptidiques permettant de stabiliser l'ensemble).

Structure secondaire :

Structure tertiaire :

Acides gras synthase

Structure quaternaire :

2
Acide gras des protéines
Biochimie
(S) = substrat dans le site de fixation
3) Site actif

Comporte 2 sites voisins :

- Un site de fixation du substrat (=site de reco-ce)
+/- important si affinité
- Un site catalytique, responsable de la réalisation de
la réaction chimique

La forme et l'environnement chimique du site actif

permettent à la réaction chimique de se réaliser

A.N : site catalytique à proximité du site de fixation. Si le site actif de l'enzyme est
endommagé la catalyse ne peut se faire. Si dégradation de l'enzyme, elle ne va pas garder
sa structure en 3D ≫ peut s'ouvrirr et retrouver sa structure primaire ≫ site de fixation et
site catalytique vont être éloignés ≫ l'activité catalytique ne peut se faire (perte)
D'où l'importance de la forme et de l'environnement ≫ fixation substrat...

- Le substrat de l'enzyme se fixe sur le site actif (après reconnaissance, puis subit la catalyse)
- Liaison à l'enzyme par des liaisons faibles non covalentes (permettant la libération du produit)
- Relation structure – activité
- Spécificité de la liaison, déterminée par le site actif (permise par ce site actif qui reconnait une partie
complémentaire au niveau du substrat)

 S ⇄ P (sous l'action d'une enzyme, qui catalyse la réaction dans les deux sens)
= réaction réversible = réaction catalytique

Substrat : molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l'action catalytique d'une enzyme.

4) Cofacteurs

• Molécules non protéiques associées aux enzymes

• Sont liés à l'enzyme
• Indispensable à l'activité enzymatique :
o Pour transporter ou compléter un substrat (aide ou complète la structure du substrat pour se fixer à l'enzyme)
o Pour accepter un produit
o Comme participant à la structure de l'enzyme (pour qu'elle puisse ê active)
• Souvent des ions métalliques (= cofacteurs)
• Si molécules organiques, sont appelés coenzymes
o Liés par liaison faible (coenzyme libre) (se lie de façon faible)
o Liés par liaison forte (coenzyme lié - groupe prosthétique)
o Souvent régénéré à la fin de l'action enzymatique

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Rôle des cofacteurs

5) Conformation du site actif

a) Modèle clé-serrure

• Complémentarité structurale entre E et S : comme une clé dans une serrure

• Explique la spécificité de l'enzyme, et la perte d'activité si enzyme dénaturée
• Formation d'une structure temporaire appelée complexe enzyme / substrat
• Les produits formés ont une forme différente du substrat
• Une fois formés, ils sont libérés du site actif

C'est l'organisation dans l'espace (structure) de l'enzyme qui détermine la zone où va se fixer le substrat. Cette organisation
est indispensable pour avoir/présenter le site actif, comme dit précédemment, si dénaturation de l'enzyme (perte de son
organisation) il y a, s'ensuit une perte d'activité de l'enzyme ⟹ longue chaîne d'acides aminés mais pas les groupements
nécessaires à la fixation du substrat (groupements que le substrat doit reconnaitre).

- Le substrat est transformé en produit (complexe enzyme-

substrat ⇒ enzyme – produit).

- Le produit peut être constitué de plusieurs éléments /

molécules.

- Après libération du produit, l'enzyme reprend son

activité.

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b) Théorie de l’ajustement induit

• Les protéines peuvent changer de conformation (forme) = arrangement dans l'espace de façon à s'adapter au substrat :
• Quand un substrat se combine à l'enzyme, il induit un changement de conformation de l'enzyme :
• Permet l'orientation optimale des groupes catalytiques
• Le site actif est alors ajusté au substrat au moment du besoin les groupements du site catalytique vont pouvoir
• Crée un environnement chimique favorable à la réaction venir complétement s'adapter au substrat, ce qui
• Cette théorie explique qu'une enzyme puisse réagir avec une gamme de crée un environnement chimique favorisant la
substrats similaires réaction = s'adapte une fois le substrat fixé

Théorie de l'ajustement induit :

= Une même enzyme a une spécificité d'action avec une gamme de substrats / substances similaires (groupements chimiques communs)
⇒ substrats peuvent donc être modifiés par cette même enzyme.
Spécificité d'action sur des substrats similaires, mais pas identiques ⟸ enzyme qui peut s'adapter au substrat par changement de
conformation

6) Catégories d’enzymes (le nom d'une enzyme se termine toujours par -ase)

• assure une oxydoréduction (toutes réactions oxydo-rédoc : dès qu'il y a

Oxydoréductase
transferts de protons (oxydase, réductase, déshydrogénase…)

Transférase
• assure un simple transfert (ex : transaminase : transfert de groupement
chimiques, amine ici)
Hydrolase
• assure une hydrolyse (ex: dans la digestion, hydrolyse enzymatique du
métabolisme des glucides)
Lyase • assure une addition sur une double liaison → rupture
• assure une isomérisation (réarrangement) (entre deux formes
Isomérase
différentes)

Ligase
• lie les molécules (groupes d'enzymes qui va catalyser l'ajout de
groupements pour synthétiser de nouvelles molécules)
Protéase • coupe des molécules

Synthase • Synthèse de molécules

Nucléase • Synthèse d’ADN et d’ARN

Oxydoréductase : Transférase : Hydrolase : Lyase : Isomérase : Ligase : Protéase : Synthase : Nucléase :

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II. La réaction enzymatique

1. Aspect énergétique

• Vitesse de réaction dépend de l'énergie d'activation (notée Ea)

• Plus cette énergie est élevée, plus la réaction est lente
• Enzymes diminuent l'énergie d'activation (et en ce sens, accélèrent la vitesse)

→ Energie d’activation (Ea) est invariable et caractéristique d'une

réaction donnée alors que ∆G dépend de la T° et de la concentration des
réactifs
→ Enzymes ne changent pas le ∆G (état énergétique final)
→ Réaction thermodynamiquement possible :
− si ∆G < 0 la réaction est dite exergonique
− si ∆G > 0, réaction est endergonique (ne se fait pas spontanément =
nécessité plus d'énergie)

L'enzyme catalyse (accélère) la réaction d'un point de vue énergétique. Il faut fournir une certaine qté d'énergie à la molécule
(qu'elle doit absorber) de façon à ce que les liaisons soient plus fragiles pour être rompues = nécessite énergie (apport
énergétique) => mettre la substance dans un état favorable à une transformation = énergie d'activation

Fournir énergie d'activation => état transitoire instable. Le produit se trouve dans un niveau énergétique plus bas que le substrat
au départ (car stable).

L'enzyme accélère la réaction (elle ↘ l'énergie d'activation ⇒ ↘ vitesse ) mais ne change pas l'état (énergétique) final.
Ce qui fait que le substrat peut modifier ses liaisons, donc son arrangement et créer un produit.

2. Activité enzymatique
• Capacité d'activité catalytique de l'enzyme dans des conditions expérimentales données
• Détermine la vitesse de réaction (détermination de l'activité catalytique)
• Phases de la réaction :

> Equilibre entre le complexe ES et EP

> E + P (dissociation du produit)

> Simplifié schématiquement par : S ⇆ P (avec E au-dessus, omission des

étapes intermédiaires )

Pour déterminer l'activité enzymatique:

- on détermine les concentrations de P au cours du temps
- on mesure la vitesse initiale = activité enzymatique
- Conditions définies de pH, T°, concentration en enzyme… (influence sur l'activité de l'enzyme)

Activité de l'enzyme ⇒ vitesse à laquelle elle va transformer le substrat en produit (jusqu'à l'état d'équilibre)

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Vitesse initiale (Vi) : avant l'état d'équilibre = le

plateau de la courbe

𝑑[𝑃]
𝑣=
𝑑𝑡
[P] concentration de P = variation de la conc. du
produit au cours du temps
Vi = phase stationnaire car linéaire (vitesse
linéaire)

Plateau final car accumulation du produit dans le

milieu : équilibre ES/EP

Expression de l'activité enzymatique

Unité internationale d'activité (UI)

• la quantité d'enzyme transformant une micromole de substrat par minute 1UI = exprime la quantité
dans les conditions optimales de dosage. d'enzyme transformant une
micromole … utile pour le
NanoKatal (nano kat)
dosage
• une nanomole de substrat transformé par seconde. (1UI = 16,6 nanokatal).
AS = réellement due à
Activité spécifique (AS) l'enzyme en calculant une
activité spécifique dans le
• nombre d'unités d'activité par unité de masse (UI/mg de protéine). milieu réactionnel (sans
parasite). Paramètre utilisé
Activité spécifique moléculaire (ASM)
pour qualifier l'enzyme
• nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme et par seconde.

Concentration d'activité catalytique ou enzymatique (CAC ou CAE)

• UI/ unité de volume ou kat/unité de volume.

3. Purification : enrichissement et rendement

La purification consiste à éliminer les protéines contaminantes d'où l'augmentation de l'activité spécifique

•E = AS2/AS1
Enrichissement (E) ou
degré de purification • Rapport de l'activité spécifique après purification AS2 à
l'activité spécifique avant purification AS1

•R = AT2.100 / AT1 = (AT2/AT1) / 100

Rendement (R) ou
% de récupération • Rapport de l'activité totale après purification AT2
à l'activité totale avant purification AT1

Une fois le milieu purifié, pour n'avoir que le produit qui ns intéresse, intervient l'enrichissement. Le rendement permet au final,
de calculer (déduire) la perte (%) : le rendement doit être au plus proche de 100%
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III. Etude de la cinétique enzymatique

1. Equation de Michaelis – Menten

Modèle simplifié :

Conditions
1- Concentration d'enzymes très faibles [E]<<<[S]
2- La forme libre de l'enzyme et celle liée au substrat sont en équilibre (pré-équilibre rapide)
3- Pas de réaction de retour

Conditions (phase stationnaire).

1. On travaille à de très faibles concentrations de substrat [S]>>[P]
2. Il y a beaucoup plus de substrat que d'enzyme : [S]>>[E]
3. la forme libre de l'enzyme et celle liée au substrat sont en équilibre (rapide).

= constante de dissociation du complexe

Avec ces conditions, on peut simplifier la réaction :

Comme, il y a peu de produit le retour K-2 est négligeable

K2 chiffre activité catalytique moléculaire de l’enzyme

Km = Constante de Michaelis = [E] . [S] / [ES] = Constante dissociation

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Cette équation fondamentale est appelée

équation de Michaelis-Menten

Avec Km = constante de Michaelis

Km = ( k-1 + k2) / k1

Courbe de Michaelis :
Représentation de la vitesse de réaction en fonction de la concentration en substrat

Vmax et Km sont les

paramètres cinétiques de
l'enzyme

= importants pour
caractériser une enzyme

Vmax
Km = concentration en substrat (pour laquelle la vitesse est égale à )
2
Si [S] ≫ Km ⇔ V = Vmax
(au moins 10 fois le Km) Vmax
Si [S] = Km ⇔ V =
2

Concentration en substrat très gde = concentration en substrat maximale (vitesse maximale)

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Vmax
- Vitesse initiale maximale

- Valeur théorique maximale que peut atteindre la vi lorsque la concentration en substrat est
saturante (Concentration > 10 . Km)
- Représente le nombre de moles de produit qu'une mole d'enzyme peut faire apparaître par unité de
temps

Km : constante de Michaelis
- Concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale d'une réaction enzymatique atteint la
moitié de sa vitesse maximale
- 1/Km ≈ affinité (plus le Km est petit, plus l'affinité sera grande)
ce qui est normal parce que si le Km (conc en substrat) est petit , la conc en substrat pour atteindre la moitié de la vitesse
maximale est rapide

2. La représentation de Lineweaver-Burk
• Utilisation d'une expression inverse de la vitesse pour exprimer Vmax et Km :

V en fonc de la [S] ⇒ inverses

Retenir simplement courbe (façon de représenter) et paramètres que l'on en extrait mais pas le calcul
→ Courbe à prolonger (pour obtenir l'intersection) ⇒ permet de définir Vmax et le Km

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IV. Facteurs influençant la cinétique

1. La température ↗

- Facilite le franchissement de l'énergie d'activation (Ea) : Vitesse ↗ quand T° ↗

- Facteur Q10 : une ↗ de 10°C augmente la vitesse de la réaction d'un facteur 2
- Mais au-delà d'une certaine T° (proche de 45°C), inactivation par dénaturation des chaînes
protéiques de l'enzyme
• Dénaturation irréversible
- Température optimale (environ 37°C)

T° optimale de fonctionnement
= compromis entre Q10 et T° dénaturation.

Le substrat va être rapidement dans son état

transitoire ⇔ la vitesse augmente (quand la
T° augmente)
Pas de T° trop élevées (chaque enzyme a
une T° optimale de fonctionnement mais elles
sont toutes globalement proche de 37° ==
température corporelle) :
A chaque fois qu'on augmente de 10° on x2 la vitesse
(jusqu'à dénaturation à 45° env)

2. pH

- Enzymes très sensibles aux variations de pH

- Chaque enzyme possède un pH optimum de fonctionnement
- Influence de pH sur :
→ L'ionisation des chaînes latérales des AA de l'enzyme
→ Modification de l'affinité de l'enzyme (E) pour le substrat (S) (Km modifié)
→ Modification de la vitesse de catalyse (Vmax modifié)
→ L'ionisation des groupements du substrat et donc modification de l'interaction avec site catalytique
→ Degré d'ionisation de certains AA influe sur conformation
→ influe stabilité

• pH optimum souvent proche de neutralité (7 – 7,4)

➢ Exceptions :
- pepsine (pH=2),
- enzymes lysosomes (4-5),
- arginase (8))

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3. Effecteur chimique

Effecteur
= substance chimique qui par sa liaison à l'enzyme modifie la vitesse de réaction

Soit en l'accélérant : Soit en la ralentissant :

Activateur Inhibiteur

Activateurs Inhibiteurs

Inhibiteurs irréversibles
Cofacteurs et coenzymes - Liaison covalente forte ,
- Perte activité par modification de
conformation ou par blocage du site actif

Ex : métaux lourds, agents alkylants .... *

OU

Inhibiteurs réversibles (compétitifs ou non)

Peuvent se dissocier rapidement du complexe ES

→ Les activateurs de la RE sont bénéfiques ⇒ état plus approprié à transformer substrat

→ Les inhibiteurs de la réaction enzymatique vont ralentir la réaction voire l'annuler

*Ex: métaux lourds (polluants) ⇒ intoxication dans l'organisme, responsable de paralysie, asphyxie… Ils bloquent (par
inhibition) des réactions au niv respiratoire et cérébral) entrainant des pathologies graves. Idem les pesticides
bloquent les enzymes des insectes, à forte inhalation ⇒ blocage respiratoire voire neurologique.

Inhibiteurs réversibles : se dissocient facilement, il faut augmenter la concentration en substrat pour y remédier,

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Biochimie

a) Inhibiteurs réversibles compétitifs

• Compétition entre le substrat et l'inhibiteur pour le site

actif de l'enzyme
• Inhibiteur a analogie structurelle avec S
• Inhibition levée par un excès de S*
• Diminution du nombre de ES (complexe)
• Km modifié (augmente)
• Vmax de l'enzyme inchangée (car si beaucoup de
substrat = quantité saturante)
• Dès qu'on ajoute de l'inhibiteur la courbe se décale
vers la gauche

*Augmenter le substrat : car plus il y en aura,

plus il y aura de probabilité que ce soit le
substrat qui s'y fixe à la place de l'inhibiteur
mais tout de même diminution de complexes
enzymes-substrat sauf si augmentation
importante du substrat pour qu'il y ait tout
de même fixation

L'inhibiteur qui a une structure assez voisine

de celle du substrat peut se fixer à sa place
sur le site actif de l'enzyme : si l'inhibiteur se
fixe sur le site actif à la place du substrat la
réaction ne peut se faire.

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Biochimie

b) Inhibiteurs réversibles non compétitifs

• Fixation sur un autre site que site actif
• Inhibiteur se fixe à l'E et au complexe ES
• Non levée par excès de S
• Km inchangée
• Vmax diminue

Rappel : Km traduit l'affinité : si le substrat se

fixe plus ou moins fortement au niv de
l'enzyme

La fixation de ce type d'inhibiteur, bien que

sur un autre site actif, ralentit la production
du produit car modifie la configuration de
l'enzyme. Même si c'est sur un site différent :
modifie la conformation de la protéine.

Passent toutes par -1/Km : présence d'un inhibiteur non compétitif

Au contraire si passent toutes par 1/Vmax : inhibiteur compétitif

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c) Inhibiteur réversible incompétitif

- Ne se fixe que sur l'enzyme complexée au substrat

- Inhibition de la formation du produit
- Diminution parallèle de Km et Vmax

Bien faire la distinction entre ces trois types

d'inhibiteurs et les manières de les reconnaitre
(courbes…)

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Biochimie

Sommaire

Chapitre 2 : Enzymologie ......................................................................................................... 1

I. Enzymes ............................................................................................................................. 1
1) Définitions .............................................................................................................................................. 1
2) Structures ............................................................................................................................................... 1
3) Site actif................................................................................................................................................. 3
4) Cofacteurs ............................................................................................................................................ 3
5) Conformation du site actif .............................................................................................................. 4
a) Modèle clé-serrure......................................................................................................................... 4
b) Théorie de l’ajustement induit .................................................................................................... 5
6) Catégories d’enzymes (le nom d'une enzyme se termine toujours par -ase).............. 5

II. La réaction enzymatique............................................................................................ 6

1. Aspect énergétique........................................................................................................................... 6
2. Activité enzymatique ........................................................................................................................ 6
3. Purification : enrichissement et rendement ............................................................................... 7

III. Etude de la cinétique enzymatique ....................................................................... 8

1. Equation de Michaelis – Menten .................................................................................................. 8
2. La représentation de Lineweaver-Burk ................................................................................... 10

IV. Facteurs influençant la cinétique ........................................................................ 11

1. La température ↗ ............................................................................................................................. 11
2. pH .......................................................................................................................................................... 11
3. Effecteur chimique ........................................................................................................................... 12
a) Inhibiteurs réversibles compétitifs ......................................................................................... 13
b) Inhibiteurs réversibles non compétitifs ................................................................................ 14
c) Inhibiteur réversible incompétitif ........................................................................................... 15

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