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UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS

NOMBRE: Katherine Avilés

RESUMEN LECTURA 3

Aspectos generales del aislamiento y purificación del ADN.

El método que se tome en cuenta debe ser eficiente y por tanto se requiere que la mayor
parte de DNA celular sea aislado y por tanto deberá tener poca rotura en la hebra , el
método que se elija debe ser rápido y simple y entre ellos se encuentra la rotura celular,
eliminación de proteínas y ARNA ,concentración de ADN y determinación de la pureza y
cantidad de ADN, además en el camino se pueden presentar obstáculos tales como la
degradación de DNA por DNASAS y por ello es necesario contener inhibidores de la ADNasa .
(Surzycki, 2000).

El material de aislamiento debe ser suspendido en un tampón ,por tanto un búfer puede
mantener la estructura del DNA durante las etapas de ruptura y purificación y puede también
facilitar el aislamiento e inhibir las enzimas degradadoras de DNA, el tampón debe
mantenerse entre un pH 7.6 y pH 9.0 ,la concentración del tampón depende del tipo de
celulas utilizadas . (Surzycki, 2000).

En celulas vegetales se requiere un tampón mayor y el buffer debe estar de1000 a 200Mm a
un pH superior a 8, la concentración mínima de NaCl es menos 0.12M.Si se usa fenol no se
recomienda el tampón de ruptura Se utilizan tipos de inhibidores de la ADNasa, ácido
etilendiaminotetraacético(EDTA), y detergentes(Surzycki,2000).

En el método de lisis alcalina, las células se lisan y el ADN se desnaturaliza mediante SDS y
NaOH. La neutralización de la solución da como resultado un rápido reenganche de ADN de
plásmido (Surzycki,2000).

El último paso para el aislamiento del DNA es encontrar la concentración de DNA que se lo
puede realizar por espectrofotometría ultravioleta, evaluar la pureza y determinar el
rendimiento para posteriormente llevar a PCR. La reacción de PCR requiere solo una cantidad
muy pequeña de ADN (50 a 500 ng)

(Surzycki, 2000).

Las muestras posteriormente se deben almacenar en condiciones que limitan su degradación,


el pH del tampón debe estar por encima de 8.5 para minimizar la desamidación, y contener al
menos 0,15 M NaCl y 10 mM EDTA. El tampón de almacenamiento de ADN debe contener 10
mM o más de EDTA, un quelante de metal. Si está presente EDTA, el ADN se puede almacenar
como un precipitado en 70% de etanol La mejor temperatura para el almacenamiento a corto
plazo de alto peso molecular. La presencia de bromuro de etidio provoca la fotooxidación del
ADN con luz visible en presencia de oxígeno molecular (Surzycki,2000).

Los kits utilizan resinas de intercambio aniónico en una columna giratoria, también ocupan una
matriz de unión al DNA para la separación de proteínas dichos kits de aislamiento de DNA se
usan para eliminar proteínas Estos kits utilizan columnas de centrifugado de membrana de
sílice para unir el ADN de extractos celulares (Surzycki, 2000).

Es difícil tratar el aislamiento de DNA no degradado, sin embargo con las precauciones
adecuadas se puede lograr y con el buen manejo de materiales que se usan en dicho proceso
(Surzycki, 2000).

Las celulas vegetales contienen grandes cantidades de enzimas degradantes de ácido nucleico.
Existen métodos de gran escala que se produce de 20-50 µg de ADN, su ventaja es que el DNA
es alto. El procedimiento a pequeña escala utiliza sales de xantógeno que simultáneamente
disuelve la pared de celulosa y elimina las proteínas (Surzycki, 2000).

El proceso de larga escala consta de una incubación en CTAB ,después a una tratamiento con
fenol CIA ,centrifugación y precipitación con etanol, rehidratación de DNA ,tratamiento con
RNasa ,precipitación con etanol, centrifugación y finalmente rehidratación con DNA mientras
que el proceso a pequeña escala consta de una incubación con xantógeno, centrifugación,
precipitación con etanol, rehidratación con DNA y opcionalmente un tratamiento con RNasa,
precipitación con etanol, centrifugación y finalmente una rehidratación con DNA
(Surzycki,2000).

Existen dos tipos de procedimientos para el aislamiento de cromosomas para bacterias Gram
positivas y Gram negativas, se debe lograr que las células se resuspendan en buffer y se trate
con lisozima, se debe mantener el pH necesario para la máxima actividad del lisozima, dicho
buffer está constituido por 0,9% de glucosa para prevenir la lisis y EDTA de sodio 10 mM para
inhibir las ADNasa. La mayoría de proteínas eliminan tratamiento por proteinasa k y el
restante se elimina por fenol (Surzycki, 2000).
Para un efectivo aislamiento del ADN puro de una pequeña cantidad de bacterias es útil aplicar
el método que utiliza sal de xantogenato, el cual se puede llevarse a cabo en una hora, este
método es ideal para el aislamiento de ADN de múltiples muestras pequeñas o de una sola
colonia bacteriana. (Surzycki,2000).

BIBLIOGRAFÍA

Surzycki. (2000). Basic Techniques in Molecular Biology (1st ed.) New York. USA: Springer-Verla
Berlin Heidelberg: Chapter 1: General Aspects of DNA Isolation and Purification, pp. 1-32; &
Chapter 2: Preparation of Genomic DN from Animal Cells, pp. 33-34; & Chapter 3: Preparation
of Genomic DNA from Plant Cells, pp. 57-58; & Chapter 4: Preparation of Genomic DNA from
Bacteria, pp. 79-81; & Chapter 5: Isolation of Plasmid DNA, pp. 101-102.

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