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TRABAJOS Revista FABICIB, Ano 2002, Volumen 6, pags. 9-17 Algunos aspectos de la regulacion de la sintesis de Mevalonato en células Hep G2 en cultivo* Polo, Monica P *?; Alaniz, Maria J. T. de '*; Bravo, Margarita G. de * 1-Insttuto de investigaciongs Bioquimicas de La Plata (INBIOLP), UNLPCONICET 2-Area Cs. Bioldgicas del Dto. de Introfuccién a la Medicina 4% Catedra de Bioquimies, Facultad de Ciencias Mecicas, Calle 60 y 120. (1900) La Plata, Argentina RESUMEN: Se estudiaron aspectos cinéticos y regulatores de | hidroximeti-qlutar-coenzima A reductasa, princioal enzima ‘egulatoria cla sintesis de colestefol, en células derivadas de un hepatoblastoma humano en cutivo. La presencia de suero fetal en el medio de cultivo inhibi la actividad ce fa reductasa sin moditicar Ios valores de Km y_'a adicidn de mevalonato a un mecio Coon suero fetal inhibio ain mas ala actividad reductasa. Los resultados nos permiten sugerr que, 2 iqual que en diversas células, ormales en cultivo, en Hep G2 opera un complejo mecanismo de regulacion de la HMG-CoA reductasa en el cual se hallan Involucrados esteroles y no-esteroles derivados dol mevalonato. Palabras claves: Hep G2 - Mevalonato- HMGCoA-reductasa - Regulacion, ‘SUMIMARY: Some aspects in the regulation of mevalonate synthesis in Hep G2 cells, a human hepatoblastome in culture. Polo, Monica P. 2; Alaniz, Maria J. 7. de '3; Bravo, Margarita G. de '*” Kinetics and regulatory aspects of the hydraxymottyt-glutary Coenzyme A reductase activity were studied. This enzyme catalyzes ths rate-limiting step in the cholesterol biosynthetic pathway. Feial serum inhibited reductase activity, but it did not mocity its Km valve. The addition of mevalonate to a culture medium with fetal serum increased the inhibition of the reductase. Our results indicate that the regulatory mechanisms in which storols and non sterol mevalonate derivatives are involved, as in many normal cells in cuure, are stil present in the Hep G2 cells. Key words: Hep G2 - HMG CoA reductase ~ mevalonate - regulation. Introduccion El colesterol es un componente principal de la membrana de las células animales. Si se bloqueala colesterogénesis en células de mamifero en cultivo el crecimiento celular (1) y la sintesis de ADN (2) disminuyen y las células mueren si no se las suple- menta con colesterol y/o alguno de sus precursores como el mevalonato. El acido meval6nico es el precursor clave de una via matabdlica cuyos productos finales son el colesterol y una variedad de derivados esteroles y no esteroles. La sintesis de mevalonato a partir de 3-hidroxi-3-metil- glutaril Coenzima A (HMG-CoA) es catalizada por la Corespondensa a * Dre, Margarita Garcia d2 Bravo, INBIOLE Facultad de Gs. Médicas, Calles 60 y 120, (1900) La Plata Te: 0221-4236967 FAX: 0221-4258988. e-mail mgascia @atias med.unip.edu.2t Recibida: 22-5-02 Aceptado: 6-8-02 HMG-CoA reductasa [EC-1.1.1.34] y constituye el prin- cipal paso regulatorio de esta via (3,4) Actualmente existen amplias evidencias de que tanto el crecimiento celular como la sintesis de ADN estén estrechamente ligados ala via del mevalonato Esto se debe fundamentalmente a que este desem- pefia dos funciones principales en el ciclo celular 8s precursor del colesterol requerido para la proliferacion de membranas que acompana al creci- miento celular (fundamentalmente durante la fase G)y. ""”'- acta, através de un mecanismo desconaci- do, en la iniciacién de la replicacién del ADN (4-11). Entre los productos de 1a via del mevalonato Que pueden ser importantes en la proliferacion celu- lar figuran algunas especies de ARNt isoprenilados y proteinas modificadas prostraduccionalmente por restos isoprenilo derivados del mevalonato (12-14), La HMG-CoA reductasa es una de las enzimas conocidas mas reguladas. Su actividad esta contro- lada a diversos niveles y por varios mecanismos de regulacién feed-back.(4). El higado, que secreta colesterol al torrente sanguineo, y las células y teji- dos que proliferan rapidamente tienen normaimente unaimportante actividad de HMG-CoA reductasa (10). En muchas células tumorales, el mecanismo feed-back negativo ejercido por el colesterol exégeno sobre la HMG-CoA reductasa esta ausente o profun- damente deteriorado (15-18). Se ha demostrado que en algunos casos el defecto en esta regulacion feed- back “precede” a la transformacion maligna (16). Muchas células neoplasicas, pese a que tienen una elevada actividad HMG-CoA reductasa, obtienen la mayor parte del colesterol que necesitan de las LOL. plasmaticas (19) y la presencia de tumores ocasio- fia frecuentemente una alteracion de la composicion lipidica del higado huésped. (20-21). Por eso es sumamente itil contar con un buen modelo de células en cultivos para estudiar la via del mevalonato y el metabolismo del colesterol. La linea tumoral Hep G2, que deriva de un hepatoblastoma humano, expresa muchas de las funciones atribui- das a un hepatocito humano normal. Estas células secretan varias proteinas plasméticas (22) incluyen- do lipoproteinas (23-25), expresan diversos receplo- res, entre ellos los de LDL (26-27) y sintetizan y secretan acidos biliares (28). En resumen es una linea celular, altamente diferenciada, muy til como modelo de estudio de las funciones y metabolismo del hepatocito humano normal. Nuestro objetivo fue estudiar aspectos cinéticas y regulatorios de la HMG-CoA reductasa en esta Ii- nea celular a fin de evaluar su utilidad como modelo para encarar estudios sobre el efecto de distintos Componentes sintéticos y naturales sobre el creci- miento celulary el metabolismo lipidico, en especial la via del mevalonato. Materiales y Métodos Reactivos. [3-'C]HMG-CoA (56.98 mCi/mM) y PH] mevalonolactona (33.00 Ci/mmol) fueron ad- quiridos ala firma DuPont NEN (Boston, MA, USA). Glucosa-6-fosfato, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y HMG-CoA se obtuvieron de Ia firma Sigma (St. Louis, MO, USA). Para cromatogratia en capa fina (TLC) se utilizaron placas de silicagel G marca Merck FABICIB / Volumen 6 pags. 9-17 (Alemania). Todos los reactivos inorganicos y los solventes utilizados fueron de calidad pro andlisis. E! ‘suero fetal estéril fue obtenido de Gen SA (Bs. As., Argentina). Cultivo de células en monocapa Las células Hep G2 (American Type Culture Collection Collection, Rockville, MD, USA) utilizadas para estos experimentos se mantuvieron a 37° en Medio Minimo Esencial de Eagle (MEM) con suero fetal bovino inactivado (SFB) al 10 % (29) subcultivandolas semanalmente utilizando una dilu- cion 5:1. Los experimentos se iniciaron sembrando 2,5 x 10° células en botellas cerradas de vidrio blando de 95 cmé de superficie de pegado (tipo Khole) con 15 ML de medio MEM + 10% de (SFB). En los experi- Mentos en los que fue necesario el uso de medio sin ‘suero, Se utiliz6 el medio libre de suero MEM opcién Zn (MEM Zo), (30) Los procedimientos seguidos para la preparacion de células Hep G2 permitieron la ob- tencién de poblaciones homogéneas con elevada viabilidad y reproductibilidad de comportamiento metabdlico. La estimaci6n de la viabilidad celular se efectud por medio del test de exclusién de azul tripan (31). Este test rutinariamente indicé que mas del 90% de las células se encontraban en condiciones ade- cuadas de viabilidad. Homogeneizacién de suspensiones de célu- Jas cultivadas en monocapa Para obtener una suspensi6n de las células que fueron cultivadas en monocapa se elimind el medio Ge cultivo y las células, todavia adheridas a las bote- las de cultivo, fueron lavadas tres veces con 10 ml de soluci6n fisiolégica helada. Posteriormente las Células fueron removidas con una espatula de goma adicionando para ello un volumen conocido de solu- cin fisiol6gica. La suspension celular se recogié en tubos, se centriftugo a baja velocidad (1.500 xg, 5 min). Se descart6 el sobrenadante y el pellet celular se congelé en nitrogeno liquido, Inmediatamente antes de ser utilizado, el pellet de células se resuspendid adicionando 0,4 mi de buffer de resuspensién por miligramo de proteina celular. E| dosaje de la proteina celular total (PCT) en ‘suspensiones de células Hep G2 se llevé a cabo utilizando una técnica semejante a la descripta por Patterson (32) aplicando luego la microtécnica de. Lowry (33). Pola, Monica P. col. - Algunos aspectos de la regulacidn La composicidn del buffer de resuspensidn usa- do fue: buffer fosfato (pH: 7,4) 50 mM; EDTA | mMy DTT mM (34). Utilizando un equipo Heat-Systems Ultrasonic, modelo W-220F (Plainview, New York) equipado con un microtip de |a misma marca modelo C2, se sonicd ala suspension celular 3 veces, durante 10 segun- dos cada vez, ala mitad de la potencia de salida. Esta operacian se llevo a cabo manteniendo el mate- rial permanentemente en lecho de hielo. Ensayo de actividad HMG-CoA reductasa La determinaci6n de la actividad enzimaticase realizo utilizando una modificacion ce la técnica de Shapiro y col. (35) descripta por Brown y col. (36). Para medi: la actividad reductasa total, se tomé una alicuota de células homogeneizadas (100 mg de pro- teina), se levd a un volumen de 90 mi con el buffer de resuspension y se preincubd 30 min a 37°C para permit |a activacion de la enzima que pudiese estar inactivada por fostorilacion (35). Posteriormente se adicionaron 100 ml de una solucién de cofactores conteniendo: buffer fostato (pH: 7,4) 0,2 M; glucosa- 6-P 40 mM; NADP* SmM; EDTA sédico 20 mM; DTT 10mM y glucosa-6-P deshidrogenasa 0,7 UI. El en- sayo se inicié con la adicion de DL-[3-'*C]-HMG- CoA (13.000 cpmynmol y 3,52 nmol/mil) a.una con- centracion final de 176 mM (para ensayos estandar). El volumen final de la mezcla de incubacidn fue de 200m. Luego de incubar 30 min a 37°C se detuvo la feaccién agregando 25m de HC! 6M. Se adiciond [H|mevalonolactona (50 nCi) como estandar inter- no, se lactonizé el acide mevalénico obtenido en la reaccion incubando 30 min a 37°C en el medio acido y se centrifugd 5 min a 8.000 rpm. La mevalonolactona se separé por TLC sem- brando 100 mi de! sobrenadante libre ce proteinas en placas de vidrio de 20 x 20 cm. con una capa de sillcagel G de 0,25 mm. de espesor, activadas du- rane 45 mina 120°C. La cromatogratia se desarrallé utilizando benceno:acetona (1:1, v/v) como fase movil. Finalizada la cromatografia las placas se seca- tonal aire y \a regiGn correspondiente a mevalono- lactona (aprox. R, 0,5-0,9) fue removida de la placa por raspado de la silica y se recogié en viales de vidrio conteniendo 10 ml de solucién de centelleo dioxano-fluor (6 g de difeniloxazole (PPO) + 100 g de naftaleno/litro de tolueno), La radiactividad fue cuan- tificada en un contador de centelleo liquido RackBeta " 1214 utilizando un programa de deteccion dual para 3H- '*C, El estandar interno de (°H]mevalonolactona es utilizado para corregir, por recuperacién incom- pleta, el dato hallado en “C. La actividad de HMG- CoA reductasa fue expresada en pmoles de mevalonolactona/mg de proteina celular/ min Tratamiento estadistico de fos resultados. Los resultados experimentales se encuentran expresados como el promedio de al menos 3 deter- minaciones + 1 desviacién estandar (SD) Las hipotesis estadisticas se ensayaron me- diante el test “t’ de Student. Se utilizo un nivel de significacién para errores de tipo | de 0,05 a 0,01 (95 4 99 % de confianza). Para aquellas diferencias de medias en las cuales el estadistico t quedé com- prendido en el intervalo de confianza impuesto por un valor de « = 0,01 (0 menor), la decisién se |a considero altamente significativa, Para. = 0.05 se la considerd signiticativa y para valores dec. > 0,05 no significativa Las rectas de calibracion de técnicas de uso tutinario se ajustaron mediante el método de cuadra- dos minimos, Cada recta se estudio por regresion determinandose coeficientes de carrelacién lineal. Resultados Caracterizacion de la HMG-CoA seductasa de células Hep G2. Utilizando una suspension celular sonicada de pool de células como fuente de enzima se determina la sintesis de mevalonato en |as condiciones stan dard descriptas en Metodos pero adicionando canti- dades variables de sustrato 0 de proteina celular al media de incubacion, La velocidad de sintesis de mevalonato deter- minada utilizando distintas concentraciones de sus- trato en él medio de incubacion se muestra en la Tabla 1 Cuando la concentracion de sustrato ensayada fue 1/4x; 1/2x; x y 2x de la standard (176 mM), se ‘observaron pequefios incrementos en la velocidad de sintesis de mevalonato que acompanian al au- ‘mento Ge la cantidad de HMG-CoA presente sin que exista una relacion lineal entre ellos.