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GUÍA PRÁCTICA DE LABORATORIO

EXTRACCIÓN DE ADN Y ELECTROFORESIS

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Estructura y función de los Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN),


son polímeros de unidades básicas denominadas nucleótidos. El ADN tiene como
principal función la transmisión de la información genética, responsable de todas las
características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de una célula. Gracias al
proceso de replicación del ADN, estas características heredables son transferidas a las
células de las nuevas generaciones y permiten la formación de un nuevo organismo.
Esta información debe ser interpretada y expresada mediante los procesos de
transcripción del ADN y traducción a proteínas, respectivamente. La expresión de todas
las características que determinan la especificidad estructural, de la cual se deriva la
especificidad funcional de una célula, se interpreta como la producción de una serie de
proteínas con diferentes funciones. El patrón de proteínas celulares es determinado
estricta y exactamente mediante un proceso complejo denominado regulación de la
expresión génica, que es influenciado por factores del ambiente interno y del externo.

Figura 1. Niveles de organización del ADN en células eucariotas. Tomado de La


química del genoma en Locos por la biología. Julio 20, 2011. Disponible en la web:
http://locosporlabiologia.wordpress.com/2011/07/20/la-quimica-del-genoma/

El vertiginoso avance en el conocimiento de la estructura y propiedades de los ácidos


nucleicos ha permitido el desarrollo de una serie de técnicas y tecnologías que se
conocen como Ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante. Este campo de
la biología molecular, se basa en la utilización de una serie de técnicas asistidas por
diversos equipos con fundamentos físicos, químicos e informáticos para el análisis de
una gran cantidad de genes simultáneamente.

Genoma, cromosoma y gen

El genoma se refiere a toda la información genética de un ser vivo, y su estudio a nivel


estructural y funcional es propio de la genómica. En las células eucariotas, a la que
pertenecen las animales, el genoma aparece fragmentado, conformando unidades de
estructura lineal, definidas cromosomas. Para la conformación del cromosoma,
fragmentos de la doble hélice de ADN son empaquetados en un núcleo proteico que
consiste en un octámero de proteínas con carga positiva llamadas Histonas, con las
cuales logra un rearreglo tridimensional; el Nucleosoma, que al superenrrollarse alcanza
un grado de complejidad de más de 60 nm de diámetro. La protección del genoma por
la doble membrana que conforma el núcleo, es otra característica de la célula eucariota.
El superenrrollamiento de los nucleosomas constituye la sustancia que conforma el
cromosoma, a la que se le denomina cromatina. Cuando la célula eucariota realiza el
proceso de división celular, la cromatina alcanza su máximo grado de enrrollamiento y
esto permite hacer visibles a los cromosomas bajo el microscopio óptico o de luz.

La unidad funcional de la información genética, es una fracción denominada gen,


conformada por largas secuencias de ADN organizadas como una doble hélice, es la
responsable de transmitir todas las características estructurales y funcionales de la
célula. Los genes a su vez son parte estructural de los cromosomas. El genoma no
solamente comprende aquellas secuencias de ADN que pueden ser transcritas hasta
moléculas de ARN sino que incluye las secuencias que participan en los complicados
procesos de regulación de la expresión de la información, a través del control estricto de
la transcripción y la traducción. Un porcentaje elevado de estas secuencias es repetido y
ha sido clasificado por secuencias similares en familias. Es claro que un pequeño
porcentaje del genoma es objeto del proceso de transcripción que permita la
interpretación a través de la traducción a una secuencia de proteína. La genómica
permite el estudio no solo de unos cuantos genes sino que favorece el conocimiento las
interrelaciones y la regulación de la expresión de miles de genes. En las células
eucariotas el ADN

Tecnología del ADN recombinante y genómica

En la actualidad un gran número de los procesos moleculares que realiza la célula se


han dilucidado y es posible reproducirlos con algunas limitaciones en ambientes in
vitro, cuando se reproducen las condiciones ambientales similares a las celulares. El
principal objetivo de estas metodologías es la modificación del ADN, a nivel de uno o
varios genes, para su análisis, obtención de proteínas nuevas que pueden a su vez
modificar las características estructurales y fisiológicas de la célula, producción de
sistemas de síntesis de proteínas, capaces de permitir la obtención a gran escala de la
misma o la generación de sistemas de diagnóstico con base en detección de genes o
fragmentos de ellos.
http://scioly.org/wiki/images/thumb/d/da/P http://www.accessexcellence.org/RC/VL/G
CR.jpg/500px-PCR.jpg G/images/tranfer_and.gif

Figura 2. Estrategias que muestras las técnicas de Amplificación enzimática del ADN
por Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y clonación de un gen.

El desarrollo de tecnologías como amplificación enzimática de ADN o Reacción en


Cadena de la Polimerasa (PCR), clonación, hibridación y secuenciación, son algunas de
las metodologías que han facilitado el vertiginoso avance de los conocimientos en
muchos organismos y profundización en el genoma humano (ver figura 2). En el campo
de la salud, las aplicaciones de estas tecnologías han hecho posible la comprensión de
procesos asociados a mecanismos de enfermedades genéticas e infecciosas, respuesta
inmune, desarrollo de células cancerosas y resistencia a antibióticos, entre otros
procesos celulares. Los conocimientos obtenidos en esta área han sido empleados en
diferentes campos de la salud como el diagnóstico, tratamiento y prevención de
enfermedades. El análisis de la secuencia de los ácidos nucleicos así como el desarrollo
tecnológico de sus procesos, han sido la base para el diseño de vacunas, producción de
fármacos, mejoramiento de la calidad nutricional de especies vegetales y animales,
resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades parasitarias, terapia y regulación
génica

En la nueva era de la ingeniería genética, los estudios se realizan en el conjunto de


genes de los individuos, lo que hizo necesario el empleo del término genómica. En el
campo de la salud, la manipulación del genoma ha permitido el estudio de enfermedades
de carácter multigénico facilitado la visión del genoma como un sistema complejo,
permitiendo la comprensión de las interacciones que ocurren entre los genes como con
el ambiente externo e interno. Una mejor comprensión del genoma ha favorecido el
conocimiento de la etiología de muchas enfermedades de origen genético, infeccioso y
ambiental. Para citar una aplicación a los estudios de la genómica debemos el
conocimiento de la complejidad del desarrollo de cáncer. Como principales aplicaciones
de estos conocimientos podemos mencionar el desarrollo de tecnologías para el
diagnóstico, diseño de vacunas, fármacos empleados en el tratamiento de diferentes
enfermedades humanas.
Extracción de ADN genómico

Generalmente el primer paso que deben seguir los científicos para poder estudiar el
genoma, es la extracción del ADN de las células, proceso que puede ser realizado de
manera manual en el laboratorio o automatizada, utilizando sistemas robóticos. Una vez
el ADN es obtenido puede ser utilizado para múltiples propósitos, como el diagnóstico
clínico o mejoramiento vegetal, de microorganismos o producción de fármacos o
vacunas recombinantes.

Para el estudio y la manipulación de los ácidos nucleicos, estos deben ser aislados de la
célula en condiciones adecuadas, para que conserven su integridad y propiedades
inherentes (tamaño, secuencia, etc.). El aislamiento de los ácidos nucleicos se realiza
mediante la ruptura de las membranas celular y nuclear, liberándolos en el lisado
celular, para su posterior limpieza y precipitación. La lisis celular se consigue mediante
choque osmótico (ej; NaCl 3M), homogenización mecánica, digestión enzimática (ej;
proteinasa K) o tratamiento con detergentes (ej; SDS) o ácidos (ej; HCl). Después de
centrifugar para descartar las células intactas, organelas y restos de membranas, el
sobrenadante que contiene los ácidos nucleicos solubles, es tratado con agentes como
fenol, mezclas de cloroformo-alcohol isoamílico o una solución concentrada de sales
(ej: cloruro de sodio 5M o acetato de amonio 8M) que permiten separar las proteínas al
desnaturalizarlas. El ADN soluble en la fase acuosa se precipita después de la adición de
un alcohol y a través de centrifugación es recogido y concentrado formando un pequeño
botón. La preparación de ADN puede ser de mayor concentración y pureza al adicionar
etanol frío que es capaz de retirar el exceso de sales. Después de ser secado y disuelto
en un buffer apropiado, el ADN puede ser visualizado en un gel de agarosa, como un
compuesto que emite fluorescencia bajo luz ultravioleta, en asociación con el
compuesto Bromuro de etídio (EB). La intensidad de la fluorescencia de color naranja
del EB, es proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra. Aunque este
método de tinción ha sido la mejor opción de escogencia para la cualificación de ácidos
nucleicos, por su bajo costo y alta especificidad, su alto poder mutagénico ha generado
polémicas y la necesidad de desarrollar nuevos compuestos que permitan una
visualización. Recientemente las casas comerciales que producen compuestos para
biotecnología, han desarrollado varios compuestos con capacidad de colorear el ADN,
que presentan propiedades menos tóxicas que el EB.

OBJETIVOS GENERALES

Después de realizada la práctica se espera que el estudiante estará en capacidad de:

Explicar los fundamentos de las técnicas de extracción.


Describir las bases bioquímicas y moleculares de la técnica de separación de ácidos
nucleicos por electroforesis en gel de agarosa y su tinción para la visualización.
Reconocer y valorar la utilidad de las técnicas de análisis y estudio del genoma y su
importancia en el diagnóstico de enfermedades de origen genético e infeccioso.

CONSULTAS PREVIAS:
DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Qué tipo de enfermedades tienen origen genético?


Como se pueden diagnosticar las enfermedades de origen genético?
Que herramientas de biología molecular se emplean en el diagnóstico molecular de las
enfermedades?
Qué se entiende por patología molecular?

PRÁCTICAS VIRTUALES:

Extracción de ADN

De qué tipo de células es posible extraer ADN


¿Qué fundamento tiene la utilización de un detergente en la preparación de la solución
de extracción o lisis?
¿Qué función específica tiene la utilización de proteinasa K en el proceso de extracción
del ADN?
¿Qué fundamento tiene la utilización de una sal en el proceso de extracción del ADN?

Electroforesis en gel

Cuáles son los fundamentos de la electroforesis para su utilización en la separación de


los ácidos nucleicos?

De acuerdo al diagrama suministrado, explique cómo se relaciona la concentración de


agarosa de un gel con el tamaño del ADN a separar y la tasa de migración.

Del siguiente esquema identifique el papel de los elementos empleados de una


electroforesis horizontal de agarosa.
PRIMERA PARTE: LABORATORIOS VIRTUALES

Realice en casa las prácticas virtuales accediendo a los siguientes links:

Extracción de ADN:
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Visualización de ADN por Electroforesis en gel


http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

SEGUNDA PARTE: PRÁCTICA - EXTRACCIÓN DE ADN DE MUCOSA BUCAL

Reactivos para Extracción de Cantidad Reactivos para Cantidad por


ADN (por grupo Electroforesis en gel de práctica
de trabajo) agarosa
Solución de extracción (o 5 ml Gel de Agarosa 1 por
lisis): NaCl al 1,5%, reciclada al 0.8% práctica
bicarbonato sódico al 5% en
agua destilada
Detergente líquido lavaloza 1 ml Buffer de muestra (que 20 l
5% contiene el colorante
EZ-Vision)
Etanol al 96% frío 10 ml Buffer de corrida 500 ml por
reciclado (TBE o TAE) práctica
Etanol al 70% 1ml Marcador de Peso 20 l
molecular (DNA
Ladder 1Kb o similar)
Buffer TE (Tris HCl 10mM 1 ml
pH 8,0, EDTA 1 mM, pH
8,0)

Materiales para Extracción de Cantidad Electroforesis en gel de Cantidad


ADN por grupo agarosa (por práctica)
de trabajo
Beaker de 100 ml 1 Equipo para montaje de 1
gel (cámara, bandeja,
fuente de poder)
Pipeta de 5 ml y propipeta 1 Micropipeta de 10µl 1
Pipeta Pasteur plástica 1 Micropipeta de 100µl 1
Vortex 1 Puntas para micropipeta 20
de 10µl (0,1 a 10µl )
Tubo de ensayo de 5ml 1 Puntas para micropipeta 20
de 100µl (20 a 100µl)
Tubo de Microcentrífuga de 2 Equipo fotodetector 1
1,5 ml (transiluminador)
Microcentrífuga 1 Peines (10 pozos) 2

PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN:

NOTA IMPORTANTE: La extracción se realizará con células del epitelio bucal de un


estudiante de cada grupo que haya cepillado sus dientes, recientemente. Es conveniente
enjuagarse la boca varias veces antes de hacer la extracción de la muestra, para eliminar
los posibles restos de comida que puedan interferir en el resultado.

Para colectar las células de la mucosa oral enjuague la boca, por uno o dos minutos, con
la solución de extracción o lisis que se encuentra en el tubo de ensayo marcado para tal
fin. Para optimizar la recolección de células, frote la lengua en las paredes de la boca
varias veces durante el enjuague.

Vierta la solución en el Beaker y añada una gota de detergente líquido. Mezcle con la
varilla de vidrio para homogenizar el detergente, se debe mezclar suavemente con el fin
de evitar formación de espuma. En este paso los varios cientos de células del tejido
epitelial de la mucosa bucal existentes se romperán y se liberará el ADN del núcleo.

Con la pipeta Pasteur transfiera 2 ml de la solución del lisado celular, al tubo de ensayo
que contenía la solución de extracción. Cierre muy bien la tapa y agite con ayuda del
Vortex por 30 segundos. Deje reposar la solución por 5 minutos sobre la mesa a
temperatura ambiente, para permitir que complete la lisis nuclear.

Con el tubo del lisado celular inclinado en un ángulo 45º y utilizando una pipeta
graduada y una propipeta, vierta lentamente y por las paredes del tubo 4 ml de Etanol
96% frío. (El metanol o isopropanol al 96%, también serviría).

El Etanol se debe de verter de forma que vaya resbalando por las paredes del tubo.
Observe cuidadosamente como se forman dos fases o capas. Determine el punto en que
se juntan las dos capas. Quizás vea cómo se forman hilos de ADN, como filamentos
nubosos que se estiran hacia la capa superior (etanol). El ADN no es soluble en etanol,
por lo que cuando el etanol se encuentra con la solución de ADN empieza a precipitar (a
formar una sal de ADN). Se observa que aparece una hilera de burbujas más pequeñas
que las de champán, unidas por un hilillo casi imperceptible, esponjoso, blanquecino.
¡Ahí está el ADN!

Introduzca la punta de la pipeta Pasteur de vidrio hasta justo debajo de la separación


entre el alcohol y la solución de extracción. Mueva la pipeta en forma circular (hacia
delante y hacia atrás) y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de ADN de mayor
tamaño. El ADN precipitado parecerá una pequeña bola de hilo blanco.

Visualización de ADN por electroforesis en gel de agarosa

Sumerja el ADN extraído (que tiene apariencia viscosa y color blanquecino) en un tubo
eppendorf con 500 l de etanol al 70% para retirar el exceso de sales.

Centrifugue por 30 segundos a 12000 rpm en microcentrífuga. Elimine el sobrenadante


y deje secar por 20 minutos a temperatura ambiente, ubicando el tubo invertido en una
toalla de papel.

Adicione 100 l de solución de Tris-HCl/EDTA (TE) al ADN seco y resuspenda


suavemente con la Micropipeta o dando golpes suaves en las paredes del tubo con sus
dedo índice.

Observe una pequeña fracción de la solución de ADN (10 L) con 2- 3 L de colorante
fluorescente (SYBR, Green o Red u otro equivalente) en un gel de agarosa al 0.8%.

Mezcle 10 L de ADN obtenido con 2 l de buffer de muestra (que contiene el


colorante fluorescente). Cargue la muestra en los pocillos del gel utilizando una
Micropipeta de 10 o 20 l

Conecte la cámara de electroforesis a la fuente de poder y deje correr el gel por 30


minutos a 100 voltios, (aproximadamente 80 mAmp de corriente).

7. Retire el gel de la cámara y observe en el transiluminador. Tome fotografía para


registro de los resultados. Describa las características de la banda de ADN observada.
Tome nota de la cantidad, posición en el gel e integridad del ADN (presencia de rastros
de ADN de varios tamaños)*

k
HOJA DE RESPUESTAS:

(SE ENTREGA UNA HOJA DE RESPUESTAS POR GRUPO)

Grupo: __________ Fecha: ______________________

Nombres: _________________________________ Códigos: ____________

1. Realice un esquema o diagrama de flujo del proceso de extracción del ADN,


indicando el objetivo de cada paso.

2. De acuerdo a los conceptos adquiridos en la guía y a sus consultas previas responda:


Como debe ser el tamaño del ADN obtenido mediante este proceso? Por qué?
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Qué papel cumple el etanol al 96% o el Isopropanol en el proceso de extracción?


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3. Con relación a la separación del ADN por electroforesis: Responda las siguientes
preguntas:

Después de observar la posición en el gel de agarosa del ADN extraído de la célula,


responda: Cuál es la relación entre el tamaño de los fragmentos de ADN y la
concentración de agarosa del gel. Justifique su respuesta:
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En qué posición se esperaría que migrara el ADN genómico que acaba de extraer en un
gel de agarosa al 2%? Por qué?
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Cuál es la característica de los ácidos nucleicos que permite la dirección de
desplazamiento hacia en ánodo en la electroforesis?
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Bibliografía:

SAMBROOK J, FRITSCH E, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,


2nd Edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold S, Spring Harbor Laboratory.1989

Genética Molecular – Recursos en Línea

National Human Genome Research Institute – Online Education


(http://www.genome.gov/10000002)

Nature (http://www.nature.com/nature/dna50

Cold Spring Harbor Laboratory. (http://dnalc.org/resources/animations/)

platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn3/ppal.htm

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