FLAVONOID

I. PENDAHULUAN
 Senyawa fenol alam
 2% Karbon tumbuhan diubah jadi
flavonoid atau 1 milyar ton pertahun
 Warna bunga dan buah, flavin (kuning,
jingga), antosian (merah, biru, ungu)
 Tumbuhan: pigmen, pertumbuh-an,
pertahanan, tabir surya, berkomunikasi
 Manusia :antioksidan, antiinflamasi,
immunostimulan, antikanker, antivirus
dan antimikroba.
Kerangka dasar
 Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin benzen,
terikat pada rantai propana, susunan C6–C3–C6
susunan yaitu : 1,3–diarilpropana (flavonoid)
1,2–diarilpropana (isoflavonoid) dan 1,1 – diaril
propana (neoflavonoid)
C3
C3 C2
C1
C2
C3 C1

C2
C1

FLAVONOID ISOFLAVONOID NEOFLAVONOID

 1. Flavonoid

contoh OH

HO O O
O O
OH

OCH3
O
O OH O

FLAVON KUERSETIN KRANJIN

2. Isoflavonoid

HO O

O
OH
HO OCH3

FEREIRIN
O O
O
H3CO O

O
O
OCH3
CH2
OH O OCH3
O

PTEROKARPIN ROTENON

3. Neoflavonoid

H3CO O O O O
O
OH

HO H3CO O O

DALBERGIN BRAZILIN KALOFILOID

Cincin benzen dihubungkan satuan tiga
karbon dapat atau tidak dapat membentuk
cincin ketiga. Untuk memudahkan maka
cincin pertama benzen diberi indeks A,
cincin benzen kedua indeks B dan cincin
yang dapat terbentuk cincin C
3' 3
OH
2' 4' 2
4
8 1 B 3' 2' 1 B
9 O 2 5' HO OH 5
7 1'
6' 4' 6
A C A
6 3 5'
10 4
5 O 6' O
 Asal usul Biogenetik

Awal Robinson (1936): kerangka C6 – C3 – C6.

dari kerangka C6 – C3 fenilpropana mempunyai gugus
fungsi oksigen pada para, para dan meta atau dua meta
dan satu para pada cincin aromatik. Senyawa
fenilpropana, seperti asam amino fenilalanin dan tirosin,
bukan menurunkan flavonoid, hanya senyawa yang
bertalian.

Dilanjutkan Birch: tahap pertama biosintesis

flavonoid, dari unit C6 – C3 berkombinasi dengan 3 unit
C2 menghasilkan unit C6 – C3 – (C2+C2+C2), maka
biosintesis dari flavonoid melalui 2 jalur bisosintesis yaitu
poliketida (asam asetat atau mevalonat) membentuk
cincin A dari kondensasi 3 molekul unit asetat, sedang
cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal
dari jalur fenilpropana (shikimat).
What’s a phenolic compound?

A secondary product that contains a phenol group

- a hydroxyl functional group on an aromatic ring.

OH

Phenolics are a chemically diverse group: many

different properties and functions.
 Biosynthesis of phenolics
Shikimic acid pathway is most common in plants. Converts
simple carbohydrates into aromatic amino acids. Not present
in animals.
 Most plant phenolics are derived from cinnamic acid
formed from phenylalanine by phenylalanine ammonia lyase (PAL)
enzyme.

PAL activity is inducible: fungal infection, low nutrient levels, high

light

PAL
HO O
HO OH

O
OH O
OH

FLAVANON KHALKON

Pokok-pokok Biosintesis Flavonoid

Hubungan Biogenetik Berbagai jenis Flavonoid (Grisebach)
OH OH OH
H
HO O HO OH HO O
[O] O

OH O OH O OH O

Flavanon Khalkon

OH OH
Ha
HO O a HO O
b +OH-
+ H OH
OH O OH O
[O]
+ a Flavanonol
-H b H
-H+
OH OH

HO O HO HO O
O
CH OH
OH
O
OH O OH OH O

Flavon Auron Flavonol

H
HO O HO O
O

H
OH O OH O
OH
Isoflavon

Katekin

Antosianidin
Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)
OH OH

HO O HO O
OH OH

OH O
OH O OH OH

Flavanonol
-H2O
OH
H+ OH
O O
OH O O
2[H] OH
O
O
OH
OH

H+
OH OH
H+
HO O
OH O O
OH

OH
+ OH
OH

H+ H+

H+
OH OH O

HO O HO O HO O
OH + OH OH

OH OH OH
OH OH OH

Katekin Antosianidin
Fungsi flavonoid pada tumbuhan
Fungsi penyerbukan:pigmen tumbuhan, warna jingga, merah, biru dan
ungu pada bunga dan buah. faktor penarik lebah, kupu-kupu, burung dan
hewan lainnya, terjadi penyerbukan. Burung suka merah, lebah biru.
Fungsi pengatur tumbuh. tidak langsung sebagai zat pengatur tumbuh
melalui sistem IAA (Indole Acetic Acid) – IAA Oxidase. Secara in vitro,
flavonoid (kuersetin ) dapat menghambat enzim IAA – Oxidae, berarti
kuersetin secara tidak langsung meningkatkan pertumbuhan.
Sebagai ”feeding deterrent” maupun ”feeding stimulant”. Kadar
tanin yang tinggi pada buah muda merupakan ”feeding deterrent” kera
maupun manusia tidak bernafsu untuk memakan sebelum masak.
Senyawa morin dan isokuersetrin dalam daun murbei (Morus alba L),
merupakan ”feeding stimulant” bagi ulat sutera (Bombyx mori).
Zat alelopati. Untuk berinteraksi dengan lingkungan, tumbuhan
menggunakan sinyal berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara
hampir bersamaan, para ahli dari berbagai laboratorium di dunia
melaporkan bahwa simbiosis antara tumbuhan polong-polongan dengan
bakteri marga Rhizobium dipicu oleh sinyal kimia berupa senyawa
flavonoid dari akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi mengetahui
tumbuhan “Spotted knapweeds” (Centaurea maculosa Lam.)
mengeluarkan senyawa alelopati yang menghambat pertumbuhan
tumbuhan lain di sekitarnya, tahun 2001 diketahui adalah (-) – katekin
(golongan flavan), sekarang diteliti untuk herbisida alam.
Tabir surya. Rusaknya ozon di lapisan stratosfir, terutama di daerah
dekat Kutub Selatan, tumbuhan mengalami cekaman sinar ultraviolet B
(UVB). Sejenis semanggi di Selandia Baru mempunyai toleransi yang
tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi ini karena kadar flavonoid meningkat.
II. Ekstraksi dan Isolasi
1.Ekstraksi
Aglikon adalah polifenol maka bersifat fenol, agak asam,
larut dalam basa. Senyawa polar, kepolaran berbeda-beda.
Umumnya larut polar seperti etanol, metanol, butanol,
aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air. Bentuk
glikosida karena ada gula mudah larut dalam air, campuran
pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang baik
untuk glikosida. Sebalik, aglikon kurang polar seperti
isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol termodifikasi,
cenderung larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.

Bahan segar bahan ideal untuk analisis flavonoid, kering

dan lama masih tetap memberi hasil baik. Bila bahan segar,
sisa cuplikan yang dianalisis segara keringkan mencegah
kerja enzim. Ekstraksi baik dua tahap; pertama metanol-air
(9 : 1) dan kedua metanol-air (1 : 1). Ekstrak dicampur dan
diuapkan hingga sepertiga , atau hampir semua metanol
menguap. Ekstrak dapat dibebaskan dari senyawa
kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil,
xantofil dengan ekstraksi (dalam corong pisah)
menggunakan pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi
dilakukan beberapa kali, lapisan air mengandung sebagian
besar flavonoid, dirotapavor.
Lanjutan
Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada
kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada.
Bila pada vakuola sel, bersifat hidrofilik,
penyarian dengan air atau pelarut alkoholik. Jika
dalam kloroplas pelarut nonpolar sebelum
alkoholik.
Ekstraksi flavonoid tidak cocok untuk antosianin
atau flavonoid kepolaran rendah. Antosian, daun
segar atau bunga segera digerus dengan NaOH
yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi
terjadi ditandai adanya perubahan warna larutan,
kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak
segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi
glikosida. Untuk simplisia yang mengandung
flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah
lagi langsung diisolasi dengan heksana atau eter
beberapa menit, ingat ekstrak yang diperoleh
mengandung lemak dan lilin.
2 Isolasi
Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l kromatografi kertas
(KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Metode KKt, kertas
disarankan kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara.
Ekstrak ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari
lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat pada satu titik,
keringkan bercak dengan pengering rambut. Ekstrak yang
ditotolkan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang
diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama
dapat BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA
(t-BuOH:HOAc:H2o) 3:1:1. Kertas diangkat, keringkan di lemari
asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Eluen
kedua menggunakan biasanya berupa larutan dalam air seperti
asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang
setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.

Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian (bercak jingga sampai

lembayung yang biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan
6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk
mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366
nm dan 254 nm) diperjelas dengan uap ammonia.
Lanjutan
Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan
kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan
campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk
penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan
dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang
sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan
keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah
berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30.

Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika

tidak ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini
direndam pengelusi tingginya ± 10 cm. Kemasan kolom dibuat
bubur dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa
putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan
kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang
digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu
jam.

Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian

rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit
mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap
ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan
tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali
meresap ke dalam kemasan.
Memilih kemasan kolom disesuaikan dengan
flavonoid yang diisolasi;
1. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara
glikosida atau glikosida dengan aglikon dan
aglikon yang kurang polar
2. Silika. Baik untuk aglikon yang kurang
polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon
dan falavonol
3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan
flavonoid dan glikosida.
4. Gel sephadex (deret G). Digunakan
memisahkan campuran, terutama berdasarkan
atas ukuran molekul
5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk
menggunakan pelarut organik, dan dapat
digunakan dua cara.
 8 cm

3 cm
arah aliran
pengembang
pertama

arah aliran pengembang

pertama

(a) (b)

biarkan 5 cm

(c) (d)
Karakterisasi dan Identifikasi
Secara umum ditentukan dengan uji warna,
kelarutan, bilangan Rf dan ciri spektrum
ultraviolet.

Jika tidak tercampur, dengan uap ammonia

berwarna spesifik masing golongan. Falavon &
flavonol kuning-kuning kemerahan. Antosianin
merah biru, flavononol orange atau coklat.
Warna merah & lembayung terjadi mendadak
dalam suasana asam, khalkon atau auron.

Flavonoid kuning terang atau jingga dalam

larutan basa, jika bagian tumbuhan tanwarna
diuapi amonia, terbentuk garam karena
struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :
 OH O- O

O O O
-
OH

O O O-
Pembentukan struktur kuinoid dari flavonoid dengan basa

HO
OH OH
O B
OH
O
NaOAc, H3BO3
HO O
HO O
OH-

O
O
Kompleks flavonoid dengan asam borat dan natrium asetat
Adanya gugus fenol memberikan reaksi
positif dengan pereaksi fenol, misalnya
besi (III) klorida dan pereaksi asam
sulfat memberi warna spesifik. Reaksi ini
tidak spesifik, tidak dapat digunakan
membedakan golongan dan harus diikuti
oleh uji warna lainnya.

Flavonoid dengan gugus hidroksil

kedudukan orto berwarna kuning intensif
jika bereaksi dengan asam borat dan
larutan natrium asetat, seperti rekasi
berikut:
 Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksil
dengan kedudukan lain diduga dapat membentuk
ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam
borat, pada pemanasan, pereaksi sitroborat,
mekanisme reaksi yang terjadi belum dapat
diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang
terbentuk adalah kuning,kuning kehijauan
dengan sinar UV 366 nm.

Pereaksi AlCl3 membentuk kompleks dengan

flavonoid (gugus hidroksil berkedudukan orto)
menimbulkan warna kuning, ini tidak stabil
dengan HCl dan terurai kembali, jika gugus
hidroksil yang berkedudukan dekat gugus
karbonil akan stabil dengan penambahan HCl.
 Cl
OH O Al

OH O

HO O HO O
AlCl3

HCl
O O

Cl
O Al
OH O OH
OH
OH
HO O
HO O
HO O
AlCl3 HCl
O O
Al O O
OH O Cl Cl Al
Cl Cl
 Kompleks flavonoid dengan AlCl3 lewat gugus
hidroksil yang berkedudukan orto dan yang
berkedudukan dekat gugus karbonil, digunakan
dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada
kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid.

Lazim identifikasi flavonoid diawali dengan

reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi,
seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III)
klorida, logam magnesium dan asam klorida.
Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam
ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi,
sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu
menjadi dasar analisis spektrofotometri UV-
tampak.
Hidrolisis
Flavonoid terdapat pada semua bagian
tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting,
buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Flavanoid
tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan,
misal antosianidin zat warna bunga, buah dan
daun.

Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk

glikosida, adalah kombinasi antara gula dan
alkohol saling berikatan melalui ikatan
glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus
hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil
dari gula, sama seperti adisi alkohol ke
aldehida yang dikatalis oleh adanya asam
menghasilkan asetal.
R
R R
OR' R'-OH OR'
+C + H O R' C C + H2O
+
H H H
R OH OR'
Aldehida Alkohol Hemiasetal Asetal

CH2OH CH2OH CH2OH

OH O OH O OR'
O R'OH
OH C
OH OH
H H +
OH OH OH
OH OH OH

Glukosa Glukosa Glukosida

(rantai terbuka) (siklik hemiasetal)
Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas
komponennya menghasilkan gula dan alkohol,
alkohol disebut aglikon. Biasanya, sisa gula
dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa,
rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga
glikosida tersebut masing-masing disebut
glukosida, rhamnosida, galaktosida dan
gentiobiosida.
Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di
atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga
gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat
oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan
hanya sedikit larut dalam pelarut organik
seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.
Untuk membedakan aglikon dan gula yang
terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan
hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa.
Hidrolisis dengan asam
Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau C-
glikosida. C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan
waktu atau lama hidrolsis.
Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid.
Gula posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi
7, paling mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida
kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding
flavonol 3-rhamnopiranosida relatif lebih stabil.
Cara baku hidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida
(1mg) hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu
alas bulat 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa
larutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin.
KKt atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil :
- jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu O-
glikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida
ter-O-glikosida.
- Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau
glukoronida
- Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida
Hidrolsis dengan enzim
Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan
flavonoid (yaitu α atau β), khas hanya memutuskan
monosakarida flavonoid O-glikosida. Selanjutnya
dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil
hidrolosis,
- β-glukosidase (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksoda
dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida.
- β-galaktosidase, menghidrolsisi β-D-galaktosida
- β-glikuronidase, menghidrolsisi β-D-glukuronidase
- Pektinase, menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan
α-L-rhamnosida
- Antosianase, menghidrolsis sebagian besar antosiani
din glikosida
- Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligo
sakarida secara utuh dari glikosida dalam Rhamnus
frangula
- Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neo
hesperidosida.
HIDROLISIS DENGAN BASA
Jarang digunakan hidrolisis gliksodia flavonoid,
digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari
posisi 7, 4’, 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari
hidrolisis asam.

Hidrolsis basa melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil

asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida
terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) glukosida dan 7-
O-neohesperidosida tidak hidrolsis. Jaga tidak ada
kontak udara, sebab flavonoid terurai suasana basa
jika ada oksigen. Kebanyakan 7 – dan 4’ – O – gliksida
pecah waktu 30 menit, beberapa glikosida perlukan
waktu dua jam.Pemutusan gula yang terikat posisi 4’
secara selektif tanpa ganggu gula posisi 7.

Cara: Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH

0,5% refluks dengan tangas air 30 menit lingkungan
N2. Netralkan dengan HCl 2N, dikromatografi kertas
eluen HOAc 15% untuk isolasi flavonoid