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Fijación
Se le llama así al tratamiento del tejido con diversas sustancias químicas con la finalidad de conservar
los tejidos como si estuvieran vivos interrumpiendo los procesos celulares que ocurren a la muerte de
la célula deteniendo así la autólisis, aumentar su dureza para facilitar los cortes finos y ultra finos, y
destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos. Los fijadores más usados son:
– Formaldehído al 5% (Micros. Opt.)
– Formol al 10% (Micros. Opt.) Es el más usado
– Formalina (solución de formaldehído especial) (Micros. Opt.)
– Glutaraldehído al 2.5% (Micros. Opt.) (Micros. Electr.)
– Tetróxido de Osmio (Micros. Opt.) (Micros. Electr.)
– Líquido de Helly (solución con 2.5g de bicromato de potasio, 5g de cloruro de mercurio, 100ml de
agua y 5ml de formol) (Micros. Opt.)
– Fijador de Bouin ( 75ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25ml de formol, 5ml de ácido
acético glacial)(Micros. Opt.)
– Cloruro de mercurio (Micros. Opt.)
– Ácido pícrico (Micros. Opt.)
– Glutaraldehído al 2.5%(Micros. Electr.)
– Paraformaldehído (Micros. Electr.)
– Permanganato de potasio (Micros. Electr.)
Siempre se debe tener en cuenta que la mejor fijación se obtiene cuando ha transcurrido el menor
tiempo entre la muerte y la misma. Téngase en cuenta también que el tamaño de muestra debe ser,
en lo posible, de entre dos y tres centímetros.
Deshidratación
La muestra luego de ser fijada debe ser deshidratada. Para ello se la sumerge consecutivamente en
una serie gradual de soluciones acuosas deshidratantes como lo son el alcohol etílico o la acetona. Se
inicia con alcohol a 50% durante uno o dos minutos, luego al 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 98% hasta llegar
al alcohol absoluto(100%). La deshidratación se realiza paulatinamente para evitar que el agua salga
rápido del tejido y este se deforme
Aclaramiento o diafanización
La muestra es luego aclarada, es decir, se cambian sus índices de refracción. La sustancia aclarante
debe ser miscible tanto en el fijador como en la sustancia de inclusión (comúnmente parafina). La
sustancia más usada es el xilol. También se puede utilizar, tolueno, benzol o cloroformo. Si decide
usar xilol, recuerde que tanto este como el alcohol disuelven los lípidos de las células.
Inclusión o impregnación
Los tejidos son incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme (gelatina o parafina) para
facilitar los cortes posteriores. Para ello se coloca la muestra en un recipiente y se le agrega la
parafina fundida a 60º C colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6hs, manteniendo la
temperatura a 60º C. Por e calor el xilol se evapora y su lugar es ocupado por la parafina. Para
microscopía electrónica se usan fucsinas polimerizadas tipo epoxi: Epon, Mikropal, Araldit. Luego se
coloca todo en un molde hasta que solidifica a temperatura ambiente. Una vez seco se lo denomina
taco
Corte
Según el grosor del corte que se desee (esto siempre va a depender de lo que se quiera observar y de
la resolución del microscopio con que se va a usar) se utilizan diversos aparatos que nos cortan el taco
en secciones lo suficientemente delgadas para dejar paso a la luz. La mayor parte de los preparados
para microscopía óptica tienen un grosor de 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un
micrótomo. Para microscopía electrónica se requieren cortes más delgados llamados ultra finos, de
aproximadamente 25 a 100nm. de espesor y de 0.5mm de lado medio. Para esto se utiliza un
micrótomo de hoja de vidrio o diamante (ultra micrótomo). Estos preparados se montan sobre rejillas
de cobre común diámetro de 3mm.
Rehidratación
Para poder observar estos preparados al microscopio aún debemos desparinarlos y teñirlos. Para esto
es necesario rehidratar nuevamente el preparado, para lo cual eliminamos la parafina con un solvente
orgánico, de nuevo se incluyen en xilo, y la muestra se rehidrata luego haciéndola pasar por una serie
de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.