JOSÉ ALBERTO GONZÁLES TANCARA

ESPECTROMETRÍA MOLECULAR POR LUMINISCENCIA

Tanto la fluorescencia como fosforescencia se parecen ya que la excitación se

produce mediante la absorción de un fotón. De esta manera las transiciones
electrónicas que causan la fluorescencia no cambian el spin del electrón, debido a
esto los estados de excitación en la fluorescencia presenta una vida corta. Por
otra parte las emisiones de fosforescencia están acompañados del cambio del
spin del electrón y los tiempos de vida de los estados excitados son mucho más
largos de hasta el orden se segundos a minutos. La luminiscencia presenta ondas
más largas de radiación que de excitación

Un tercer tipo de luminiscencia es la quimioluminiscencia, que es la radiación que

emite una especie excitada que se forma en el curso de una reacción química.
Mayormente el reactivo es un oxidante fuerte como el ozono o peróxido de
hidrogeno. El resultado es el espectro del producto de oxidación del reactivo o
analito, en lugar de la del analito.

La medición de la fotoluminiscencia como de la quimioluminiscencia facilita la

determinación cuantitativa de especies inorgánicas y orgánicas.

INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Muchos de los componentes de los instrumentos para medir la fotoluminiscencia

son similares a los de los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta/visible. A
continuación se muestra un esquema de los componentes en los fluorómetros y
los espectrofluorómetros.
 .

La mayoría de los instrumentos para la medición de la fluorescencia usan un

equipo óptico de doble haz, para de esta manera compensar las fluctuaciones en
la potencia radiante. El haz superior pasa por un selector de longitud de onda de
excitación que transmite la radiación que causa la fluorescencia pero excluye o
limita la radiación de la longitud de onda de emisión de fluorescencia, esta se
propaga desde la muestra en todas las direcciones, pero lo más deseable es que
forme un ángulo recto con el haz de excitación. Este factor reduce al mínimo las
contribuciones de la dispersión y de la radiación intensa de la fuente, la radiación
emitida atraviesa un selector de longitud de onda de emisión que aísla la emisión
de fluorescencia, esta radiación choca entonces contra un fototransductor, en
donde es transformada en una señal eléctrica para poder ser medida.

El otro haz más bajo, el de referencia, pasa a través de un atenuador que reduce
su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente más o menos en
un factor de 100 o más. Este haz atenuado choca contra un segundo transductor
el cual lo transforma en una señal eléctrica, y es así que el sistema electrónico
procesa las señales para determinar la relación entre la intensidad de la emisión
fluorescente y la intensidad de la fuente de excitación, y producen el espectro
resultante o los datos de longitud de onda.

Respecto a sus precios tanto de fluorómetros y los espectrofluorómetros

dependen de las características de funcionamiento. Si estos solo usan filtors para
seleccionar la longitud de onda, el instrumento es un fluorómetro, la mayoría de
estos está equipado con dos monocromadores para aislar la longitud de onda.
También existen otros los cuales son híbridos, tienen un filtro para seleccionar la
longitud de onda de excitación y un monocromador para elegir la onda de emisión.

Los espectrofluorómetros facilitan la producción de un espectro de excitación de la

fluorescencia o un espectro de emisión de fluorescencia. En la figura adjunta
mostramos el espectro de excitación del antraceno en el que la emisión
fluorescente se midió a una longitud de onda fija, mientras se barría la longitud de
onda de excitación. Una vez efectuadas todas las correcciones adecuadas para
compensar las variaciones de la intensidad de la señal de salida de la fuente y de
la respuesta del detector en función de la longitud de onda, se obtiene un espectro
de excitación absoluto que es muy semejante a un espectro de absorción.

En la figura 15.9b se ilustra el espectro de emisión de fluorescencia del antraceno.

El espectro se obtuvo manteniendo constante la longitud de onda de excitación
mientras se hacía un barrido de las longitudes de onda de la emisión. Estos dos
espectros son casi imágenes especulares entre sí porque las diferencias de
energía vibracional para los estados electrónicos fundamental y excitado son más
o menos las mismas

La mayoría de espectrofluorómetros proporcionan características electrónicas y

estructurales de las moléculas valiosas en los trabajos analíticos cualitativos y
cuantitativos. Sin embargo, en lo que se refiere a las medidas de concentración,
los fluorómetros, relativamente baratos, son suficientes.
COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS
ESPECTROFLUORÓMETROS

 Fuentes

Se usan fuentes más intensas en los métodos luminiscentes, y ya no las lámparas

de tungsteno o deuterio que se emplean en las mediciones de absorción.

 Lámparas.

La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de vapor de

mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida.

Esta fuente emite líneas útiles para producir la fluorescencia a 254, 302, 313, 546,
578, 691 y 773 nm. Cada una de las líneas se puede aislar con filtros de
interferencia o absorción apropiados.

En los espectrofluorómetros, en los que se requiere una fuente de radiación

continua, se utiliza normalmente una lámpara de arco de xenón de alta presión, de
75 a 450 W. Éstas requieren una fuente de alimentación potente, capaz de
producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a 30 V. El espectro de una
lámpara de arco de xenón es continuo desde alrededor de 300 a 1300 nm.

En los instrumentos de fluorescencia también se usan los diodos emisores de luz

azul. Estas lámparas emiten radiación a 450-475 nm y son apropiados para excitar
algunos fluoróforos. Las mezclas de luminóforos en algunos diodos emisores de
luz proporcionan longitudes de onda en la región UV a alrededor de 375 nm.

Rayos láser. Se utilizan también diversos tipos de rayos láser como fuentes de
excitación para medir la fotoluminiscencia.

 Filtros y monocromadores

Estos son usados para seleccionar la longitud de onda tanto del haz de radiación
como el haz de emisión

 Transductores
Ya que las señales de emisión de luminiscencia son de baja intensidad, requieren
transductores sensibles, los cuales cuentan la cantidad de fotones para mejorar la
relación señal -ruido

En la espectrofluorometría se utilizan los dispositivos de transferencia de carga

este tipo de transductor facilita el registro rápido tanto de los espectros de
excitación como de los de emisión y sobre todo es útil en cromatografía y en
electroforesis.

 Celdas y compartimientos

Para las celdas Para mediciones de fluorescencia se utilizan celdas o cubetas

tanto cilíndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o sílice, el diseño de su
compartimento debe ser tal que reduzca la cantidad de radiación dispersada
hasta el deflector.

Un fluorometro típico

Un espectrofluorometro
APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES

Estos dos métodos, fosforescenucastte o fluorescente, tienen límites de detección

mucho más bajo que las de espectrometría por absorción. Entre sus aplicaciones
importantes están:

A. Determinación fluorométrica de especies inorgánicas

Son de dos tipos, los directos en los que se forma un quelato fluorescente y se
mide su emisión, el segundo se basa en el descenso de fluorescencia que es la
acción amortiguadora de la sustancia en estudio.

B. Métodos para especies orgánicas y bioquímicas

La aplicación más importante de la fluórometria es el análisis de productos

alimenticios, farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales. Ya que la
sensibilidad y selectividad de estos métodos lo hacen valioso, ya que la mayoría
de compuestos importantes para nuestra fisiología manifiestan fluorescencia.
 C. Métodos fosforimétricos

Esta se usa para determinar gran variedad de especies orgánicas y bioquímicas,

como ácidos nucleicos, aminoácidos, más que todo para determinar sustancias
que tienen anillos condesados, y presencia de Halógenos o Azufre, los cuales
presentan alta fosforescencia.

D. Detección de fluorescencia en cromatografía líquida

Son de mucha importancia para la determinación de componentes cuando se

extraen de una muestra proveniente de columnas cromatografícas. Si se excita la
fluorescencia con rayos laser ya que este se puede enfocar a un mismo tamaño
de la columna cromatografica.

E. Medición del tiempo de vida

La medición del tiempo de vida proporciona información que se relaciona con la

desactivación de colisiones y velocidades de transferencia de energía y
reacciones de estados excitados

F. Métodos de imágenes por fluorescencia

Donde se combina la fluoresecencia con la microscopia óptica, para genera

imágenes de fluoróforos presentes en las matrices de las células más elementales
o únicas.

G. Quimioluminiscencia

Son métodos sensibles que en ausencia de ruido se pueden realizar con bajos
niveles de luz, estos métodos nos sirven para:

 Analizar gases, como por ejemplo para determinar contaminantes

atmosféricos
 Análisis de especies inorgánicas en fase liquida.
 Determinar especies organicas.