DADOS: Como funciona cada método, em que é utilizado, ano que foi inventado, vantagens e

desvantagens, equipamento utilizado, preço, vídeo.

SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO – NGS
O DNA teve sua estrutura química desvendada em 1953 e a partir de então, tornou-se uma das
moléculas mais estudadas no mundo. A molécula DNA é composta por nucleotídeos ligados em
combinações específicas e únicas que podem ser identificados pela metodologia de sequenciamento.
O sequenciamento de DNA iniciou-se nas décadas de 70 – 80, com os métodos de degradação
química (Maxam e Gilbert) e terminação de cadeia com dideoxinucleotídeos (Sanger)- “ inicialmente
procede-se à desnaturação do fragmento de DNA de dupla cadeia, originando cadeias molde para a
síntese in vitro de DNA. São necessários primers para que se inicie a reação pela DNA polimerase. É
também o primer que define qual a cadeia que é usada como molde. Usam-se ainda baixas
concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs. Em cada reação, um ddNTP é incorporado
aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização”.
Atualmente, o método de Sanger ainda é utilizado, porém sem escalabilidade, bastante trabalhoso e
demorado.
O genoma humano demorou aproximada 10 anos para ser sequenciado. Na última década, passamos
por uma revolução tecnológica que nos permite sequenciar o genoma humano completo em menos de
uma semana. A partir de 2005, o cenário começou a mudar, surgiram as primeiras tecnologias de
sequenciamento de DNA conhecidas como NGS (Next Generation Sequencing), permitindo uma
nova abordagem de sequenciamento em larga escala, para a obtenção de informação genômica rápida,
barata e precisa, cuja a principal vantagem sobre os métodos convencionais é obter milhões de leituras
de sequências de DNA em uma única corrida, aumentando consideravelmente a escala e a resolução
das análises. Além disso, as leituras são geralmente mais curtas do que o do tradicional sequenciamento
de Sanger, exigindo exame mais cuidadoso dos resultados.
Em princípio, essa tecnologia se assemelha com o mecanismo de eletroforese através de capilares,
onde as bases de um pequeno fragmento de DNA podem ser identificadas sequencialmente a partir de
sinais emitidos. No entanto, os métodos mais modernos ao invés de se limitarem a analisar pequenos
fragmentos de DNA, passaram a avaliar milhões deles em uma única corrida. Com isso, esse avanço
tecnológico permitiu que fosse realizado um sequenciamento mais eficiente, com uma maior cobertura
incluindo genomas inteiros através de uma única reação. É importante destacar que o método de
terminação em cadeia não deixou de ser utilizado, mas está caindo em desuso com o passar dos anos.
Nos anos subsequentes, diversas plataformas de NGS foram desenvolvidas, baseadas
principalmente nas metodologias de:
-Pirosequenciamento com detecção de pirofosfato (454 – Roche);
-Sequenciamento por ligação (SOLiD);
-Metodologia de semicondutores (Ion);
-Sequenciamento por síntese (Illumina);
-Sequenciamento de moléculas únicas (Pacific Biosciences e o Oxford Nanopore).
A escolha do método depende principalmente do objetivo do trabalho proposto. Grande parte destas
tecnologias ainda está em desenvolvimento e constante aprimoramento.
Atualmente, os sequenciadores estão divididos em 1ª geração (Degradação química e Interrupção
da cadeia-Sanger), 2ª geração (454-Roche, Illumina Genome Analyser-HiSeq/MiSeq e SOLID), 3ª
geração (Ion Torrent e PacBio RS) e 4ª geração (Nanopore).

RESUMO GERAL DE CADA MÉTODO:

Roche
A plataforma 454 da Roche baseia-se na detecção de fótons de luz produzidos pela incorporação de
nucleotídeos na cadeia de DNA nascente. O preparo da amostra envolve, como em todas as tecnologias
de sequenciamento de nova geração, a clivagem do DNA e a seleção e ligação dos fragmentos a
adaptadores em ambas as extremidades. Os fragmentos são ligados a microesferas onde ocorrerá a
amplificação. A cada nucleotídeo incorporado ocorre a emissão de luz pela liberação do pirofosfato na
reação, o que permite identificar a sequência.
Illumina
A plataforma Ilumina utiliza uma metodologia similar ao método de Sanger com nucleotídeos
terminadores marcados com diferentes fluoróforos. Os fragmentos são ligados a flowcell (placa de
vidro) e a emissão da fluorescência após cada nucleotídeo inserido é registrada para a obtenção da
sequência. Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq. Leituras de 30 bp nas primeiras
versões, e agora de 120x2 em HiSeq e 250x2 em MiSeq.

Ion Torrent
A plataforma NGS IonTorrent PGM, que utiliza a tecnologia de sequenciamento por
semicondutor de íons, é capaz de aliar um baixo custo por base sequenciada com a versatilidade dos
chips de sequenciamento, com outputs de 100Mb, 1Gb e 2Gb de dados gerados por corrida. Ideal
para o sequenciamento de pequenos genomas, transcriptomas e pools de produtos de PCR (painéis de
genes e metagenomas). Esta plataforma elimina a necessidade de se dividir uma corrida com
amostras de origens diferentes. Atualmente os protocolos de sequenciamento para IonTorrent PGM
são capazes de gerar leituras de 200 e 400 pb. Plataforma focada em velocidade e praticidade (é
considerada a mais rápida para sequenciamento de genomas).
 454 Roche (artigo 1)
O método do Pirosequenciamento (454 Roche), foi a primeira plataforma de sequenciamento de
nova geração disponibilizada para o mercado em meados de 2005. Esta tecnologia causou bastante
impacto, pois dispensava a necessidade de clonagem prévia de fragmentos e proporcionava o
sequenciamento de milhares de sequenciamentos de DNA e amostras em paralelo, onde todo o DNA
presente na amostra era diretamente clivado por shotgun, e um PCR em emulsão de moléculas únicas
era realizado. Esta metodologia baseia-se no princípio de detecção de luz a partir de um pirofosfato
liberado na reação, no momento em que cada nucleotídeo específico é incorporado na molécula de
DNA sendo sequenciada.
Todas estas plataformas desenvolvidas hoje fazem já parte das rotinas de laboratório, sendo que,
cada uma possui suas vantagens e especificidades. Algumas comparações podem ser feitas (tabela
abaixo), contudo, este é um campo em constante desenvolvimento e aprimoramento, possibilitando
cada vez mais a geração de uma maior quantidade de sequências, maior multiplexagem de amostras,
com maior tamanho de fragmentos, melhor qualidade e menor custo por base sequenciada.

Dentre as novas plataformas de sequenciamento, duas já possuem ampla utilização em todo o

mundo: a plataforma 454 FLX da Roche e a Solexa da Illumina.
Essas novas plataformas possuem como características comuns um poder de gerar informação
muitas vezes maior que o sequenciamento de Sanger, com uma grande economia de tempo e custo por
base para o sequenciamento. Essa maior eficiência advém do uso da clonagem in vitro e de sistemas
de suporte sólido para as unidades de sequenciamento, não precisando mais do intensivo trabalho
laboratorial de produção de clones bacterianos, da montagem das placas de sequenciamento e da
separação dos fragmentos em géis. A clonagem in vitro em suporte sólido permite que milhares de
leituras possam ser produzidas de uma só vez com a plataforma 454, Solexa ou SOLiD.
Pirosequenciamento e a tecnologia 454.
O sistema 454 foi a primeira plataforma de sequenciamento de nova geração a ser comercializada.
A plataforma 454 realiza o sequenciamento baseado em síntese, o pirosequenciamento. A leitura da
sequência nesse sistema é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas que se inicia
com a liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadeia. Em seguida,
esse pirofosfato é convertido para ATP, pela ATP sulfurilase, sendo este utilizado pela luciferase para
oxidar a luciferina, produzindo um sinal de luz.
 O sistema requer que o DNA seja mecanicamente fragmentado em sequências de 300-800pb,
transformado em fragmentos abruptos fosforilados e ligado a adaptadores de sequência específica
(Figura 1). A biblioteca de DNA da amostra é ligada a adaptadores A e B nas extremidades 3’ e 5’ dos
fragmentos, respectivamente, os quais são utilizados
nas etapas posteriores de isolamento dos fragmentos (A-B) e amplificação e nas reações de
sequenciamento. O adaptador B possui biotina ligada à extremidade 5’, o que permite o isolamento
dos fragmentos ligados ao adaptador A na extremidade 3’ e adaptador B na
extremidade 5’ na amostra. Somente os fragmentos AB são eluídos na reação de purificação e são
especificamente ligados às microesferas que carregam várias cópias da sequência complementar exata
ao adaptador B de um único fragmento. O outro adaptador é utilizado no anelamento do primer que inicia
a reação de sequenciamento. As microesferas ligadas aos fragmentos únicos de fita simples são então
emulsionadas em uma mistura de água e óleo com reagentes de PCR para amplificação clonal do
fragmento fita simples em cerca de 1 milhão de cópias. Na PCR em emulsão, o óleo em solução aquosa
forma micelas, nas quais as microesferas são capturadas. Cada micela funcionará como um
microrreator, produzindo muitas cópias idênticas de um mesmo fragmento isoladamente em um
microssuporte.
Após a PCR de emulsão, as microesferas ligadas aos fragmentos de fita simples são depositadas em
poços distintos em uma placa de sílica onde os reagentes para o sequenciamento são distribuídos. As
reações de sequenciamento ocorrem em cada poço, para um único tipo de fragmento ligado à
microesfera, não havendo, portanto, competição por reagentes com outros fragmentos da biblioteca. A
placa de sequenciamento é dividida em 1,6 milhões de poços com diâmetro suficiente para alojar uma
única microesfera (Figura 1).
A placa de sequenciamento é inserida junto ao sistema óptico de leitura no equipamento. Os
reagentes e as soluções de sequenciamento são então distribuídos por toda a placa a cada ciclo para
obtenção do sequenciamento paralelo dos 1,6 milhões de poços. O sequenciamento é realizado em
ciclos, e a cada ciclo um tipo determinado de nucleotídeo é adicionado à reação. Se o nucleotídeo
adicionado for incorporado à sequência em síntese, um sinal de luz é emitido, sendo a intensidade
desse sinal um reflexo do número de nucleotídeos desse tipo específico que foram sucessivamente
incorporados na molécula. Como o nucleotídeo que é adicionado a cada ciclo é conhecido, o sinal de
luz emitido pode ser diretamente utilizado como informação de sequência.
Os fragmentos sequenciados nessa plataforma passam por sistemas de análise de qualidade em que
sequências distintas oriundas do sequenciamento de uma única microesfera são eliminadas, bem como
as leituras em que a sequência inicial TCGA (quatro primeiros nucleotídeos dos adaptadores) não
aparece. As leituras produzidas possuem geralmente cerca de 250pb, o que representa um comprimento
de leitura muito menor que o produzido pelo sistema de Sanger (~700pb). A Roche divulgou
recentemente o lançamento da série Titanium de pirosequenciamento, em que leituras maiores que
400pb são conseguidas. Esse aprimoramento das leituras advém de otimizações nas reações químicas
do pirosequenciamento, as quais reduzem o ruído de fundo e aumentam o número de leituras por
corrida, e do novo desenho do suporte de sequenciamento (PicoTiterPlate), o qual agregou duas
mudanças principais: o uso de uma estrutura metálica, permitindo leituras mais acuradas, e esferas
ainda menores, aumentando, tanto o tamanho das leituras, quanto o número de leituras por corrida
(ROCHE, 2008). O maior
tamanho das leituras e a grande capacidade de gerar informação tornam o processo de montagem mais
fácil num projeto de sequenciamento de novo (sequenciamento de genomas desconhecidos) e permite
trabalhar com coberturas genômicas mais amplas, favorecendo o processo de montagem. Além disso,
pelo fato de não envolver clonagem bacteriana, a representação do genoma é bem mais fiel, de forma
que sequências difíceis de clonar e manter em bibliotecas genômicas podem ser acessadas.
Genomas pequenos, como os de bactérias e de alguns eucariotos, podem ser facilmente montados
usando a plataforma 454. Com relação às demais tecnologias de sequenciamento da segunda geração,
a plataforma 454 é a que produz as maiores leituras e por isso tem sido mais utilizada, inclusive para
o sequenciamento de genomas eucariotos. Outra limitação importante da plataforma 454 é a baixa
eficiência na determinação de homopolímeros. Como a intensidade do sinal de fluorescência relaciona-
se ao número de vezes que um determinado nucleotídeo foi incorporado à sequência, a determinação
precisa de sequências em que um único nucleotídeo é repetido mais de três vezes torna-se imprecisa.
O custo do sequenciamento com essa plataforma é superior ao custo das plataformas Solexa e SOLiD
(Tabela 1), mas, nos casos em que a produção de leituras maiores é necessária, a plataforma 454 deve
ser a melhor opção.
 454 Roche (artigo 2)
Apesar da eficiência do método Sanger, em 2005, foram obtidos os primeiros resultados dos
esforços dos engenheiros em produzir máquinas ainda mais eficientes no sequenciamento de DNA.
Foi lançado o sequenciador 454 (Life Sciences) que anunciou a técnica de sequenciamento por síntese,
onde cada base era lida à medida que fosse adicionada ao fragmento de DNA recém-formado,
diferentemente do método de Sanger, onde a base lida era verificada pela marcação fluorescente e pelo
peso molecular da molécula contendo a sequência parcial do DNA através de uma análise
eletroforética.
O 454 era capaz de produzir 25 milhões de pares de bases com precisão de 99% ou mais em apenas
uma análise de quatro horas na máquina. Isso representava um aumento de 100 vezes na produção de
sequências de DNA, quando comparado à tecnologia mais moderna existente no momento, sem perder
a acurácia. Apesar dos grandes benefícios da técnica de sequenciamento de nova geração (Next

generation sequencing), como foi chamado, alguns pontos ainda apresentavam desvantagens. A nova
técnica produzia sequências pequenas e de difícil análise. Enquanto a técnica de Sanger produzia
sequências de aproximadamente 750 pares de bases; a nova técnica gerava sequências contendo apenas
cerca de 100 ou 200 pares bases de DNA. No entanto, em 2006, novos trabalhos publicados,
principalmente na área da metagenômica, demonstravam a versatilidade e eficácia da nova técnica de
sequenciamento, ao amostrar a diversidade microbiana em diferentes ambientes. A tecnologia vem
sendo aprimorada, com o principal avanço feito em relação ao tamanho médio dos fragmentos de DNA
gerados (reads) por NGS, que atualmente, alcançam o tamanho médio dos fragmentos obtidos pelas
técnicas baseadas no método de Sanger, ou seja, 750 pares de bases.

454 Roche (artigo 3)

Com a necessidade de desenvolver metodologias mais eficientes para o processo de sequenciamento
de DNA, indústrias farmacêuticas, como a Roche e a Applied Biosystems, iniciaram uma corrida para
o desenvolvimento de uma nova geração de sequenciadores. Um destes sequenciadores foi
desenvolvido pela Roche e denomina-se 454, utilizando um método conhecido como
pirosequenciamento.

O pirosequenciamento baseia-se nos seguintes passos:

1. Fragmentação do DNA molde.
2. Ligação de sequências adaptadoras nas extremidades de cada fragmento gerado, onde são
utilizados dois adaptadores diferentes, um para cada extremidade da fita (5’ e 3’). Esse processo
pode ser visualizado na figura 1.
3. Separação das fitas de DNA duplo (dsDNA) em uma fita de DNA simples (ssDNA).
4. Ligação das sequencias adaptadoras das sequencias em nanoesferas, denominadas beads.
Estas nanoesferas possuem sequências que pareiam com as sequência adaptadoras, sendo que,
estatisticamente, espera-se que apenas uma sequência se ligue a cada bead. Um modelo de
nanoesfera pode ser visualizado na figura 2.
 Figura 2. Representação de uma bead (preto) e de seus adaptadores (vermelho).

O próximo passo após ocorrer a ligação do DNA às beads, é a amplificação. No caso do

pirosequenciamento, essa amplificação será realizada em uma solução oleosa emulsificada,
denominada PCR em emulsão. Desse modo, as beads serão internalizadas por gotículas de óleo e a
única fita de DNA ligada a nanoesfera dará origem a várias outras fitas, que também se ligarão a essas
nanoesferas. Desta forma, cada bead ficará coberta por milhares de cópias de uma única sequência de
DNA.
Realizado o processo de amplificação, a solução é transferida para uma placa contendo milhões de
nanopoços, que possuem diâmetros suficientes para apenas uma bead. Após isso, os reagentes da
reação de sequenciamento são adicionados, sendo os reagentes utilizados, neste caso, as enzimas DNA
polimerase, ATP sulfurilase, luciferase e apirase e o substrato luciferina.
O sequenciador adicionará um nucleotídeo (dNTP) por vez, que será utilizado no lugar do ATP pelo
fato de ser o substrato da enzima luciferase. A incorporação de um nucleotídeo liberará um pirofosfato,
que será convertido em ATP pela ação da enzima ATP sulfurilase, na presença de dATPαS. O ATP
gerado será utilizado pela enzima luciferase para converter a luciferina em oxiluciferina, um processo
que liberará luz. Caso um nucleotídeo adicionado pelo seqüenciador não seja incorporado, a enzima
aspirase o degradará, garantindo a limpeza do sistema e permitindo que um novo nucleotídeo seja
adicionado à placa. Nas figuras 2 e 3 podem ser vistas ilustrações deste processo.
 Figura 3. Esquema simplificado representando o Método de Pirosequenciamento.

Em cada nanopoço está ocorrendo milhares de reações ao mesmo tempo, sendo que uma câmera
CCD é responsável por filmar a placa e enviar todos os dados para um computador. Chegando ao
computador, poderá ser realizada a identificação da sequência de cada nanopoço, através da análise
dos picos luminosos gerados pela adição de cada nucleotídeo.
O pirosequenciamento é considerado um método mais eficiente que o método de Sanger se
considerarmos que a cobertura da sequencia é muito maior, sendo uma determinada base lida várias
vezes. Entretanto, o método tem como inconveniente a necessidade de utilizar um número elevado de
reagentes.

Plataforma Solexa da Illumina (artigo 1)

O sequenciamento na plataforma Solexa, assim como o sequenciamento de Sanger, é realizado por

síntese usando DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. A
inovação dessa plataforma consiste na clonagem in vitro dos fragmentos em uma plataforma sólida de
vidro, processo também conhecido como PCR de fase sólida. A superfície de clonagem (flow cells) é
dividida em oito linhas que podem ser utilizadas para o sequenciamento de até oito bibliotecas. Em
cada linha, adaptadores são fixados à superfície pela extremidade 5’, deixando a extremidade 3’ livre
para servir na iniciação da reação de sequenciamento dos fragmentos imobilizados no suporte por
hibridização (Figura 2).
 Os fragmentos de DNA da amostra são também ligados aos adaptadores em ambas asextremidades,
o que permite sua fixação ao suporte de sequenciamento por hibridização a um dos adaptadores fixados
(Figura 2). No primeiro ciclo de amplificação, nucleotídeos não marcados são fornecidos para que haja
a síntese da segunda fita do fragmento imobilizado no suporte. A alta densidade de adaptadores no
suporte facilita a hibridização do adaptador livre dos fragmentos imobilizados a sua sequência
complementar fixa perto do clone inicial durante o ciclo de anelamento. Após o ciclo de anelamento,
o fragmento forma uma estrutura em “ponte” na superfície de sequenciamento e a extensão ocorre,
formando a fita complementar também em “ponte”. No ciclo de desnaturação, as fitas são separadas e
linearizadas. Esses ciclos são repetidos 35 vezes e assim as cerca de mil cópias geradas de cada
fragmento nessa PCR de fase sólida permanecem próximas umas das outras, formando um cluster de
sequenciamento. Etapas de desnaturação são necessárias para a separação dos duplex formados e, nos
próximos ciclos de amplificação, nucleotídeos terminadores marcados são fornecidos para as reações
de sequenciamento que ocorrem dentro de cada cluster. A alta densidade dos clusters de
sequenciamento possibilita que o sinal de fluorescência gerado com a incorporação de cada um dos
nucleotídeos terminadores tenha uma intensidade suficiente para garantir sua detecção exata. Até 50
milhões de clusters podem ser produzidos por linha, correspondendo a uma representação satisfatória
da biblioteca. Após a incorporação de cada nucleotídeo no fragmento em síntese, a leitura do sinal de
fluorescência é realizada. Em seguida, ocorre uma etapa de lavagem para remoção dos reagentes
excedentes e remoção do terminal 3’ bloqueado e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo
anterior para que a reação de sequenciamento prossiga. A leitura das bases é feita pela análise
sequencial das imagens capturadas em cada ciclo de sequenciamento. Em geral, leituras de 25-35 bases
são obtidas de cada cluster.
 Plataforma Illumina/Solexa (artigo 2)

Essa plataforma realiza seu sequenciamento, assim como no método de Sanger, pela síntese através
da enzima DNA polimerase e de nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. A
diferença inovadora consiste no fato da execução do método de clonagem dos fragmentos in vitro ser
realizada em uma plataforma sólida de vidro (PCR de fase sólida).
Primeiramente, realiza-se a fragmentação de forma aleatória e, esses fragmentos serão,
posteriormente, ligados a adaptadores localizados nas duas extremidades. A adesão das moléculas de
DNA fita simples ocorre por afinidade ao suporte sólido, local onde se encontram os oligonucleotídeos
complementares a esses adaptadores. Na fase de anelamento, o adaptador da extremidade da molécula
que se encontra livre, se une ao seu oligonucleotideo complementar no suporte e forma uma estrutura
em ponte, logo dá-se início a PCR, fazendo uso da extremidade 3’ livre do oligonucleotídeo como
primer. Já durante a etapa de desnaturação, essa ponte é desfeita através do uso de altas temperaturas.
Posteriormente, a etapa de anelamento é repetida, dando origem a novas estruturas em ponte, iniciando
um novo ciclo de amplificação. É importante destacar que nesta plataforma podem ser gerados
fragmentos tanto paired-end quanto single-read para a preparação de bibliotecas de DNA.
No momento em que ocorrer uma quantidade suficiente desses ciclos, serão obtidos clusters de
moléculas idênticas ligadas ao suporte e, através da incorporação de nucleotídeos terminadores
marcados e da excitação a laser, é gerado sinal, que será captado por um aparelho que realizará a leitura
e a interpretação dos possíveis nucleotídeos componentes da cadeia. O procedimento de leitura é feito
de forma sequencial, o que permite a montagem da sequência completa de cada um dos clusters
gerados.

Método Life Technologies Ion Torrent™ (artigo 1)-

A plataforma de Sequenciamento Ion Torrent desenvolvida pela Life Technologies (Figura 6) possui
uma abordagem de sequenciamento de DNA diferenciada, visto que a identificação das bases se dá
unicamente por pH, e não por ddNTPs ou reações luminosas, como era o caso das tecnologias vistas
até então.

Figura 6. Imagem do sequenciador Ion Torrent PGM.

Nessa plataforma, a amostra de interesse é colocada em um pequeno chip (Figura 7), que contém
em sua superfície nanoporos providos de medidores de pH, em nanoescala. Após ser colocado no chip,
o DNA sofre uma reação irreversível de ligação a esses nanoporos.

Figura 7. Um chip de sequenciamento da plataformas Ion Torrent PGM.

Com o DNA ligado é iniciado o processo de sequenciamento. Da mesma forma que no

pirosequenciamento, no IonTorrent as bases serão adicionadas uma de cada vez e um ciclo será
repetido milhares de vezes. Caso a base correta seja adicionada, a enzima DNA polimerase agirá e um
íon H+ será liberado, provocando um aumento do pH no nanoporo. Esse aumento será detectado e,
dessa forma, a sequência presente em cada nanoporo será determinada.
A plataforma Ion é interessante, pois faz uso de um método simples e relativamente barato, por esse
motivo, ela vem sendo cada vez mais empregada em alguns países da Europa e nos EUA, em
procedimentos de sequenciamento de genomas, em clínicas, com o objetivo de análises genéticas para
auxiliar o diagnóstico médico.