PRÁCTICA XVI

BACTERIAS DEGRADADORAS DE
PETRÓLEO DIESEL

1. Introducción
La utilización masiva de combustibles fósiles genera anualmente 2 800 millones de
toneladas de dióxido de carbono de los 76 000 millones de toneladas existentes en la
atmósfera.

El dióxido de carbono junto con otros gases como el dióxido nitroso, metano,
clorofluorocarbonos, compuestos halogenados y vapor de agua constituyen el grupo de
gases invernadero que absorben la radiación reflejada provocando el calentamiento
global de la atmósfera y cambiando dramáticamente el clima del planeta.
Adicionalmente a los cambios climáticos globales el uso masivo del petróleo como
fuente de energía y como materia prima ha generado la contaminación ambiental que
ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del ambiente y constituye una amenaza
real a la salud pública así como es responsable de la extinción de gran cantidad de
especies animales y vegetales.

El principal origen del crudo y productos del petróleo tales como benceno, tolueno, xileno
(BTX) e hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs) liberados al ambiente son las
pérdidas de los tanques de almacenamiento, los vertidos y accidentes durante su
transporte. Una de las herramientas para combatir la contaminación ambiental generada
por derrames de petróleo es la biodegradación del petróleo o ruptura de los compuestos
complejos a compuestos simples y menos tóxicos. Durante los últimos años el interés
por la búsqueda de microorganismos con capacidad degradativa de petróleo como
bacterias, mohos y levaduras se ha incrementado con miras a utilizarlos en la
recuperación microbiana de los suelos y cuerpos de agua contaminados con petróleo.

La biorremediación o utilización de microorganismos como las bacterias que

metabolizan petróleo como fuente de carbono y energía, constituye una alternativa
saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento
de crudos, permitiendo la biodegradación de los hidrocarburos y recuperación de los
suelos contaminados.

2. Objetivos

2.1. Aislar bacterias degradadoras de petróleo Diésel a partir de suelo contaminado.

2.2. Cuantificar el petróleo Diese biodegradado por bacterias aisladas de suelos

contaminados.
2.1. Metodología
3.1 Muestra
100 g de suelo contaminado con petróleo

3.2 Aislamiento de bacterias heterótrofas

 Para favorecer el aislamiento de bacterias heterótrofas pesar 10 g de cada
muestra de suelo contaminado y enriquecerlas en 90 mL de caldo Bushnell
Haas, a 30 °C, durante 72 horas.
 Después, tomar una alícuota de 0,1 mL y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar nutritivo, King B y Mac Conkey. Incubar a 30
°C durante 24 horas.
 A continuación, en el agar nutritivo agrupar las colonias desarrolladas, según
sus características morfológicas y seleccionar una representante de cada
grupo.
 De igual manera en el agar King B seleccionar las colonias formadoras de
fluorescencia y en el agar Mac Conkey las colonias lactosa negativa.
 Realizar una tinción de Gram y después cultivar en agar Tripticasa Soya
(TSA) y Bushnell Haas con 4 % de petróleo Diésel, constituyendo los cultivos
puros, que serán guardados en refrigeración a 8 °C.
¿Cómo sé que mi bacteria es hidrocarbono clástica?
 Tiempo requerido para la utilización de petróleo como fuente de
carbono y energía.
 Cuantificar el número de unidades de actividad emulsificante.
 Producción de surfactante.
 Biorremedacion y determinar la toxicidad del suelo biorremediado.
3.3 Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono
y energía

Para la obtención del inóculo, cultivar cada bacteria nativa en 10 mL de caldo

nutritivo, a 30 °C durante 24 horas. Posteriormente, centrifugar el caldo nutritivo
(3500 rpm) durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, lavar el sedimento con
solución salina esterilizada (0,87 %, p/v) y estandarizar la concentración celular
con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland (9 x 108 cel mL-1). A continuación,
de cada una de las suspensiones bacterianas previamente estandarizadas tomar
1 mL e inocularlo por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL
de caldo Bushnell Haas con indicador púrpura de bromocresol y 0,1 mL de
petróleo Diésel. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como
testigo. Incubar a 30 °C hasta por 10 días, con agitación manual, diariamente por
10 minutos y en simultáneo investigar el viraje del indicador del lila al amarillo,
que se interpretará como positivo para la utilización del petróleo como fuente de
carbono y energía.

3.4 Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante (UAE)

De cada uno de los inóculos bacterianos previamente estandarizados tomar 1

mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de
caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Considerar un tubo con caldo
de cultivo no inoculado como testigo. Incubar a 30 °C, durante 3 días con
agitación manual, diaria por 10 minutos y en simultáneo investigar la presencia
de burbujas y turbidez del medio de cultivo. A continuación, verter el caldo
cultivado en tubos y centrifugarlos (3500 rpm) durante 10 minutos. Después,
tomar 1 mL de cada sobrenadante y llevar a tubos de prueba con 9 mL de caldo
extracto de levadura etanol más 0,2 mL de petróleo Diesel. Tapar
herméticamente (tapa rosca) y agitar manualmente durante 1 minuto hasta lograr
una emulsión.

Posteriormente, con un tubo “blanco” conteniendo caldo extracto de levadura

etanol más 0,2 mL de petróleo Diesel (testigo) calibrar a cero el
espectrofotómetro digital de luz visible, 335-1000 nm, y leer la absorbancia de
cada una de las muestras a 540 nm. Después, realizar la conversión de la
absorbancia a unidades de actividad emulsificante por mililitro, considerando
0,826 de absorbancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mililitro,
UAE mL-1.
4. ANEXO
4.1 Caldo Bushnell Haas (g/L)

KH2P04 1,0
K2HP04 1,0
(NH4)2S04 1,0
MgSO4 0,20
Cl2Ca 0,02
FeCl3 0,005
1000
Agus destilada csp mL
pH 7,0

4.2 Caldo Extracto de levadura etanol

(g/L) 18,0

KH2 P04 6,0

K2HP04
MgS04
0,2
(NH4)2SO
4,0
4

3,0
Extracto de
levadura Etanol 20,0 mL

Agus destilada 1000

csp pH mL

7,
5. BIBLIOGRAFIA

Llanos, C. (2012). Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con

petróleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de
Lambayeque, 2011. (Tesis de pregrado). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo,
Lambayeque, Perú.

Ramírez, N., (2005) Degradación de petróleo Disesel a diferentes concentraciones de

nitrógeno y fósforo por cepas nativas de Pseudomonas sp. Lambayeque, 2005.
(Tesis de pregrado). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Perú.

Tapia, I., (2002) Capacidad degradativa del petróleo de hongos aislados de agua de
mar-Litoral del Puerto Eten. Enero-Mayo, 2002. (Tesis de pregrado). Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Perú.