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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

Isolamento dos constituintes do tegumento da castanha de cajú


(TCC) e avaliação do seu potencial como antioxidante natural

Doutoranda: Natália de Freitas Oliveira

Orientadora: Dra. Tereza Neuma de Castro Dantas

Natal/RN
Abril, 2016.
Natália de Freitas Oliveira Página 1

Natália de Freitas Oliveira

ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES DO TEGUMENTO DA


CASTANHA DE CAJÚ (TCC) E AVALIAÇÃO DO SEU
POTENCIAL COMO ANTIOXIDANTE NATURAL

Tese apresentada ao Programa de


Pós-Graduação em Engenharia
Química, da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, como
parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor,
sob a orientação da Prof.ª Drª
Tereza Neuma de Castro Dantas.

Natal/RN
Natália de Freitas Oliveira Página 2

Abril, 2016.
Natália de Freitas Oliveira Página 3

Catalogação da Publicação na Fonte.


UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.

Oliveira, Natália de Freitas.


Isolamento dos constituintes do Tegumento da Castanha de Cajú
(TCC) e avaliação do seu potencial como antioxidante natural /
Natália de Freitas Oliveira. - Natal, 2016.
219 f.: il.

Orientador: Tereza Neuma de Castro Dantas.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.


Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química.
Programa de Pós-graduação em Engenharia Química.

1. Castanha de caju - Tese. 2. Antioxidantes - Tese. 3. Óleos


vegetais- Tese. 4. Fitoquímica - Tese. I. Dantas, Tereza Neuma de
RN/UF/BSEQ
Castro. II. Universidade Federal do Rio Grande do CDU
Norte. III. Título.
634.573(043.2)
Natália de Freitas Oliveira Página 4
Natália de Freitas Oliveira Página 5

OLIVEIRA, N. F. – Isolamento dos constituintes do tegumento da castanha de cajú (TCC) e


avaliação do seu potencial como antioxidante natural. Tese de Doutorado. UFRN, Programa
de Pós-graduação em Engenharia Química (PPGEQ). Área de Concentração: Engenharia
Química.

RESUMO:
O cajú (Anacardium occidentale L.) é uma das principais fontes de renda dos produtores
rurais da região Nordeste do Brasil. A castanha de cajú é constituída por três partes: casca,
amêndoa e uma película marrom conhecida como tegumento (TCC). Óleos vegetais brutos
possuem diferentes constituintes que são indesejáveis ao produto final, uma vez que podem
ocasionar a oxidação no óleo. Fatores como a degradação oxidativa são de extrema
importância para o aumento do tempo de estocagem de óleos e gorduras. Neste trabalho
procurou-se isolar os diferentes tipos de metabólitos secundários do tegumento; elaborar e
otimizar uma metodologia para o refino dos óleos de canola e girassol; e avaliar o potencial
antioxidante do extrato do tegumento da castanha de cajú na estabilidade oxidativa (EO) de
óleos vegetais. A abordagem fitoquímica demonstrou que o tegumento é rico em diversos
metabólitos, como os alcalóides, sais de amônio e os compostos fenólicos (taninos). Os óleos
foram analisados em quatro grupos de amostras: industrial, bruto, degomado e neutralizado.
Os óleos neutralizados de canola e girassol apresentaram acidez livre (IA) abaixo dos óleos
industrializados, bem como os índices de iodo (II) e peróxido (IP). Através dos resultados
obtidos, verificou-se que o processo de refino adotado resultou em um produto com padrão
semelhante ao óleo industrializado e dentro das normas. O teste de oxidação acelerada, Schaal
Oven Test, e as análises IA, IP, absortividade específiva (AE) em 232 e 270nm, dienos (DC) e
trienos conjugados (TC), e EO em PetroOxy foram realizados, observando-se que as adições
de antioxidantes naturais nos óleos vegetais asseguraram a estabilidade oxidativa após o
envelhecimento acelerado em estufa. Evidenciou-se, também, que o óleo de canola foi mais
estável e resistente a longos períodos de estocagem. O uso dos extratos metanólicos de
tegumento (MDF) forneceu melhores resultados de IA, IP, DC em relação ao controle e ao
antioxidante sintético BHA. O período de indução avaliado pelo PetroOxy foi aumentado com
a adição dos antioxidantes naturais do TCC, demonstrando que sua ação antioxidante em
óleos vegetais o torna um potencial composto bioativo natural.

Palavras-chave: Anacardium; caracterização fitoquímica; tegumento; antioxidantes; óleos


vegetais; estabilidade oxidativa.
Natália de Freitas Oliveira Página 6

OLIVEIRA, N. F. – Isolation of the constituents of cashew nut integument (CNI) and evaluation
of its potential as a natural antioxidant. Doctoral Thesis. Post Graduate Program in Chemical
Engineering (PPGEQ). UFRN.

ABSTRACT
The cashew (Anacardium occidentale L.) is one of the main sources of income for farmers in
the Northeast region of Brazil. The cashew nut is composed of thee main parts: peel, almond,
and a brown film known as integument (CNI). Crude vegetable oils have different
constituents which are undesirable in the end product, causing oil oxidation. Factors such as
oxidative degradation are extremely important to increase the shelf life of oils and fats. This
research was developed aiming to: identify and isolate different types of secondary
metabolites from the integument; develop and optimize a methodology for refining canola and
sunflower oils; and evaluate the antioxidant potential of the integument extract in oxidative
stability (OS) of vegetable oils. The phytochemical approach showed that the integument is
rich in various metabolites such as alkaloids, ammonium salts, phenolic compounds (tannins).
The oils were analyzed in four groups of samples: industrial oil, crude oil, degummed oil, and
neutralized oil. The values of acidity contente (AV) obtained for the canola and sunflower
neutralized oils were lower than the ones for industrial oils, as well as for iodine index (II)
and peroxide index (PV). The results showed that the adopted refining process resulted in na
oil with similar properties of the industrial one and in accordance with Brazilian standards.
The accelerated oxidation test, Schaal Oven Test, and the AV, PV, especific absorty (EA)
analysis, at 232 and 270nm, and OS (PetroOxy) were performed and it was observed that the
addition of the natural antioxidants in vegetable oils ensured oxidative stability after
accelerated aging in stove. It is also evident that the canola oil is more stable and resistant to
long periods of storage. The use of integument methanolic extracts (IME) provided better
results for AV, PV, DC in relation to the control and the synthetic antioxidante (BHA). The
induction period measured by PetrOxy was increased with the addition of natural antioxidants
from CNI, demonstrating that this product presents antioxidant action for vegetable oils,
allowing it’s use as a natural bioactive compound.

Keywords: Anacardium; phytochemical characterization; integument; antioxidant; vegetable oils;


oxidative stability.
Natália de Freitas Oliveira Página 7

Eu aprendi...

Que se aprende errando;


Que crescer não significa fazer aniversário;
Que tudo o que se faz, um dia volta;
Que o silêncio é a melhor resposta, quando se ouve uma bobagem;
Que trabalhar significa não só ganhar dinheiro;
Que amigos a gente conquista mostrando o que somos;
Que os verdadeiros amigos sempre ficam com você até o fim;
Que cada um é de um jeito;
Que ninguém substitui ninguém;
Que a maldade se esconde atrás de uma bela face;
Que eu construo meu próprio caminho;
Que a minha felicidade não depende de ninguém;
Que não se espera a felicidade chegar, mas se procura por ela;
Que não se precisa de muito para ser feliz, mas ninguém vê isso;
Que serei sempre a mesma, mas não serei a mesma pra sempre;
Que um só dia pode ser mais importante que muitos anos;
Que quando penso saber de tudo, ainda não aprendi nada;
Que se deve ser criança a vida toda;
Que o julgamento alheio não é importante;
Que o caráter vale mais que a reputação;
Que nosso ser é livre;
Que sonhar é preciso;
Que o que realmente importa é a Paz Interior;
Aprendi que eu posso TUDO
Basta eu QUERER!
E finalmente, aprendi que não se pode morrer, prá se aprender a viver...

(Autor desconhecido)
Natália de Freitas Oliveira Página 8

AGRADECIMENTOS

A Deus, que iluminou todos os meus passos, me amparando nos momentos


mais difíceis, me dando forças quando fraquejei, fazendo um caminho de Luz onde
havia escuridão, recuperando meu corpo quando a saúde preocupou e sendo o meu
tudo quando eu não tinha nada.

Aos meus pais, que sempre me apoiaram, incentivaram e estiveram à minha


espera nessas idas e vindas, sendo meu porto seguro e fortaleza.

Aos meus irmãos, sobrinhos e familiares, por serem meu núcleo de apoio,
fonte de alegrias e a certeza de que sempre estarão ali comigo, mesmo à
quilômetros de distância.

À minha querida orientadora Professora Dra. Tereza Neuma, que me acolheu


com muito carinho, abrindo as portas do seu laboratório, depositando a confiança
que eu não tinha, puxando a minha orelha quando precisei, me empurrando quando
empanquei… agradeço também toda a sua compreensão, seu discernimento, sua
humanidade, seu exemplo de professora, pesquisadora e mãe, pois orientar não é só
criar uma lista de afazeres a ser dita ou enviar um e-mail cheio de tarefas, existem
humanos trabalhando ali, e a senhora é um exemplo a ser seguido!

À Professora Dra. Rosélia, por ter me adotado, repassando seus


conhecimentos com tanta generosidade e empenho, estando diariamente presente
comigo no laboratório e bancada nos primeiros anos do doutorado, por todo apoio
e todos os seus sábios conselhos como professora e amiga, expresso minha eterna
gratidão, “Tchuchuca” linda.

Ao meu “Pai daqui”, como ele gosta de ser chamado, Professor Dinarte Aeda,
por ser realmente um pai para mim nesses anos fora de casa e sem família por
perto, pelo apoio em tudo que precisei nesse tempo em que residi em Natal, eu e
meus pais não temos palavras suficientes para agradecer ao senhor, sua esposa
Ancila e família por todo esse carinho gratuito e altruísta.
Natália de Freitas Oliveira Página 9

Ao meu querido bolsista Robson Gonçalo, que chegou aos 35 min do segundo
tempo, mas foi de extrema dedicação e empenho, mesmo sem bolsa não me
abandonou durante a fase mais crítica e sobrecarregada, meus sinceros
agradecimentos.

À minha bolsista Rachel Adna, pela ajuda e amizade no primeiro ano de


doutorado.

A todos os integrantes do Laboratório de Tecnologia de Tensoativos (LTT),


pelos anos de companheirismo.

Aos amigos Alex, Bruno, Denise, Daniel, Ewerton, Flávia, Glauco, Igor,
Jussara, Katherine, Laís, Marina, Nadja, Paulo, Patrícia, Rayanna, Valdeir,
Yasmine, Yguatyara e Yuri por todos os momentos de descontração, amizade e
horas de conversas calorosas na copa!

À equipe administrativa do PPGEQ, em especial à Mazinha e Medeiros.

Aos Professores do programa de Pós-Graduação em Engenharia Química,


por todo conhecimento partilhado.

Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e


à Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), pelo suporte financeiro
dado a este trabalho.

E, por fim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a


realização deste trabalho, o meu Muito Obrigada!

Agradeço a Deus pelo que conquistei até agora,


mas peço a Ele para me dar sabedoria para
conquistar muito mais! (Mr. Jokinha)

... se depender de mim


Eu vou até o fim!
Natália de Freitas Oliveira Página 10

Ao pensar em desistir mil vezes, encontrei


mil e um motivos para continuar e chegar
aqui.

“Você não é derrotado quando perde...


Você é derrotado quando desiste”
(Bob Marley)
Natália de Freitas Oliveira Página 11

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO……………..…………………………..………………………………… 19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA………………………………………………..…………... 23
2.1. Produtos naturais………………………………………...………………………………... 23
2.2. Metabolitos primários e secundários………………………………………........................ 24
2.2.1. Terpenos………………………………………...……………………………………….... 26
2.2.2. Compostos nitrogenados e derivados………………………………………....................... 28
2.2.2.1. Alcalóides………………………………………...……………………………………….. 28
2.2.2.2. Sais de amônio………………………………………...…………………………………... 29
2.2.3. Compostos fenólicos………………………………………...……………………………. 33
2.3. Extração de compostos de origem vegetal………………………………………............... 35
2.4. Família Anacardiaciae…….......……….….....………………………………………......... 37
2.4.1. Anacardium occidentale L. (cajueiro)…...………………………....................................... 38
2.4.1.1. Castanha de cajú................................................................................................................... 41
2.4.1.1.1. Beneficiamento da castanha de cajú……………..………………………………………... 43
2.4.1.1.2. Processo de separação da amêndoa e tegumento a partir da castanha……………………. 43
2.4.1.2. Tegumento da castanha de cajú (TCC)……………..…………………………..………… 50
2.4.1.2.1. Composição química do TCC.…………………….........…………..…………………….. 51
2.4.1.2.2. Metabólitos derivados do ácido graxo presente no TCC…………..….………………….. 52
2.4.1.2.3. Metabólitos secundários presentes no tegumento...…..……………………..……………. 53
2.4.1.2.4. Outros metabólitos encontrados no TCC…………..……………………..………………. 57
2.4.1.2.5. Atividade antioxidante do TCC…………..……………………....……………………..… 58
2.4.1.2.6. Outras aplicações químicas do TCC…………..……………………..…………………… 60
2.5. Óleos vegetais....................................................................................................................... 61
2.5.1. Estabilidade oxidativa de óleos vegetais.............................................................................. 64
2.5.1.1. Antioxidantes usados em óleos
70
vegetais.......…………..……………………..……………
2.5.1.2. Avaliação físico química e oxidativa de óleos…………..……………………..…………. 73
2.5.1.2.1. Testes de mensuração da oxidação de óleos…………..……………………..…………… 73
2.5.1.2.2. Testes de avaliação da estabilidade oxidativa de óleos…………..……………………….. 77
3. ESTADO DA ARTE…………..……………………..……………………..…………….. 82
4. METODOLOGIA.................................................................................…………..………. 94
4.1. Materiais............................................................................................................................... 94
4.2. Produção da farinha do tegumento da casnha do caju (TCC) …….……..……………….. 95
4.3. Abordagem fitoquímica preliminar do TCC…………..……………………..…………… 95
4.3.1. Obtenção dos extratos doTCC…….……….…………………..……………………..…… 96
4.3.1.1. Caracterização do extrato hidroalcoolico do
96
TCC................................................................
4.3.1.2. Caracterização do extrato clorofórmico do
98
TCC...................................................................
4.4. Testes fitoquímicos...............................................................................………………..….. 100
4.4.1. Abordagem fitoquímica para o extrato hidroalcoolico do TCC……......…………………. 100
4.4.1.1. Determinação do rendimento dos extratos........................................................................... 100
4.4.1.2. Teste pata fenóis e taninos………………………………………………………………… 100
4.4.1.3. Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonoides……………………………………. 100
4.4.1.4. Teste para leucotocianidinas, catequinas e flavononois…………………………………... 101
Natália de Freitas Oliveira Página 12

4.4.1.5. Teste para flavonóis, flavononas, flavonoides e xantonas………………………………... 101


4.4.1.6. Teste confirmatório para catequinas..................................................................................... 102
4.4.1.7. Teste para esteroides e triterpenóides...…………………………………………………… 102
4.4.1.8. Teste para saponinas………………………………………………………………………. 102
4.4.1.9. Teste para ácidos fixos
103
fortes………………………………….……………………….......
4.4.1.10. Teste para
103
resinas…………………………………………….…………………………….
4.4.1.11. Teste para
103
alcalóides………………………………………….……………………………
4.4.1.12. Teste para bases
103
quaternárias………………………………………….…………………...
4.4.1.13. Hidrolise ácida para o extrato hidroalcoolico…………………..…………………………. 104
4.4.1.14. Teste para ácidos fixos fortes em extratos
104
hidrolisados.....………………….……………..
4.4.1.15. Preparo dos extratos para os testes: quinonas, antranóis e agliconas
104
flavonoides.………...
4.4.2. Abordagem fitoquímica para o extrato clorofórmico do TCC…........................…………. 105
4.4.2.1. Determinação dos
105
extrativos…………………………………………….………………....
4.4.2.2. Separação de bases orgânicas……………………………………………………………... 105
4.4.2.3. Teste para presenças de
105
alcalóides…………………………………….…………………...
4.4.2.4. Teste para bases
105
quartanárias……………………………………….……………………...
4.4.2.5. Separação de ácidos
106
fortes………………………………………….……………………...
4.4.2.6. Teste para ácidos fixos
106
fortes…………………………………….………………………...
4.4.2.7. Separação dos ácidos fixos fracos e
106
fenóis………………………..………………………..
4.4.2.8. Teste para constituintes fenólicos em meio alcoólico……………………..……………… 106
4.4.2.9. Teste para constituintes fenólicos em meio aquoso………………………………………. 106
4.4.2.10. Teste para constituintes neutros…………………………………………………………... 107
4.4.2.11. Hidrólise alcalina………………………………………….………………………………. 107
4.4.2.12. Separação da fração
107
insaponificável……….………………………………………………
4.4.2.13. Teste para esteroides e triterpenóides após hidrolise alcalina…………………………….. 107
4.4.2.14. Separação dos ácidos do extrato saponificado……………………………………………. 107
4.4.2.15. Teste para fenóis…………………………………………………………………………... 107
4.4.2.16. Teste para ácidos fixos fortes……………………………………………………………... 108
4.4.3. Rendimento e classificação dos constituintes químicos da abordagem fitoquímica............ 108
Natália de Freitas Oliveira Página 13

4.5. Separação dos constituintes do TCC……………………………………………………… 108


4.5.1. Compostos fenólicos……………………………………………………………………… 108
4.5.1.1. Extração especifica para compostos fenólicos……………………………………………. 108
4.5.1.2. Análise para caracterização dos extratos………………………………………………….. 109
4.5.2. Compostos lipofílicos……………………………………………………………………... 109
4.5.2.1. Extração especifica para compostos lipofílicos (esteróides e
109
triterpenóides)………………
4.5.2.2. Separação e purificação dos compostos (esteróides e triterpenóides)
109
……………………...
4.5.2.3. Testes de Lieberman-Buchard e Solkowski………………………………………………. 110
4.5.2.4. Extração do LCC………………………………………………………………………….. 110
4.5.3. Compostos nitrogenados………………………………………………………………….. 112
4.5.3.1. Isolamento especifico para alcalóides…………………………………………………….. 112
Natália de Freitas Oliveira Página 14

4.5.3.2. Extração especifica de sais de amônio……………………………………………………. 114


4.6. Espectrofotometria na região de ultravioleta visível
114
(UV)…..……………………………..
4.7. Espectroscopia na região de infravermelho
114
(IV)……………………..………………….…
4.8. Avaliação da potencialidade do TCC como inibidor de oxidação em óleos vegetais.......... 115
4.8.1. Preparo dos extratos do
115
tegumento………………………………………………………...
4.8.2. Solubilidade dos óleos…………………………………………………………………….. 115
4.8.2.1. Refino em escala laboratorial dos óleos……………………………...…………………… 115
4.8.3. Testes em forno Schaal……………………………………………………………………. 116
4.8.4. Procedimentos analíticos………………………………………………………………….. 116
4.8.4.1. Índice de acidez (IA)……………………………………………………………………… 116
4.8.4.2. Índice de iodo (II)…………….…………………………………………………………… 117
4.8.4.3. Índice de peróxido (IP) …………………………………………………………………… 118
4.8.5. Determinação do coeficiente de extinção específica por absorção na região de
ultravioleta 119
visível………………………...…………………...…………………...…………………..
4.8.6. Atividade antioxidante pelo método b-caroteno/ ac. linoleico……………………………. 119
4.8.7. Compostos fenólicos totais (CFT).....……………………………………………………... 120
4.8.8. Método ASTM D7545 (PetroOXY) ……………………………………………………… 120
4.9. Análise estatística…………………………………………………………………………. 121
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.………………………………………………………… 123
5.1. Caracterização fitoquímica do Tegumento da Castanha de Caju
125
(TCC)..…………………
5.2. Isolamento e caracterização dos metabolitos do TCC…………………………………….. 125
5.2.1. Compostos lipofílicos……………………………………………………………………... 126
5.2.1.1. Cromatografia em coluna para isolamento de compostos apolares………………………. 134
5.3. Compostos nitrogenados e derivados…………………………………………………….. 134
5.3.1. Isolamento de alcalóides………………………………………………………………….. 134
5.3.2. Isolamento de sais de amônio…………………………………………………………….. 140
5.4. Compostos fenólicos……………………………………………………………………… 145
5.5. Avaliação do potencial do TCC como inibidore de oxidação em óleos vegetais............... 148
5.5.1. Caracterização dos antioxidantes naturais………………………………………………… 148
5.6. Eficiência do refino de óleos vegetais em escala laboratorial…………………………….. 152
5.7. Efeitos dos diferentes antioxidantes derivados do TCC nos óleos de canola e girassol sob
155
a estabilidade oxidativa……………………………………………………………………
5.7.1. Índice de acidez (IA) ………………………………………………………...…………… 155
5.7.2. Índice de peróxido (IP) …………………………………………………………………… 158
5.7.3. Dienos (DC) e trienos (TC) conjugados…………………………………………………... 161
5.7.4. Método ASTM D7545 (PetroOxy)… ………………………..…………………………… 164
6. CONCLUSÕES.................................................................................................................... 168
7. REFERÊNCIAS................................................................................................................... 171
Natália de Freitas Oliveira Página 15

LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 2.1 – Resumo da biossíntese dos metabolitos secundários……………………….. 26
Figura 2.2 – Estrutura química de terpenóides repelentes de insetos……………………... 27
Figura 2.3 – Alcalóide verdadeiro (Escopolamina), proctoalcalóide (Efedrina) e
pseudoalcalóide (Teofiline)…..……………………………………………………………… 29
Figura 2.4 – Efedrina e cloridrato de efedrina.……………………………………………... 30
Figura 2.5 – Estrutura básica de um sal de amônio.......................................................... 31
Figura 2.6 – Caráter anfifílico dos compostos orgânicos (Cloreto de
hexadeciltrimetilamômio) …………………………………………………………………… 31
Figura 2.7 – Cloreto de benzalcônio ………………………………………………………. 32
Figura 2.8 – Estrutura espacial (A) e planar (B) de um fenol simples…………………. 33
Figura 2.9 – Fórmula geral dos compostos anfifílicos do alquilbenzeno, onde o grupo
lateral pode ser R= –OH; -OR1; -COOR2, entre outros……………………………………. 36
Figura 2.10 – Estrutura química de alguns compostos fenólicos do cajú…………………. 36
Figura 2.11 – Primeiro registro oficial do gênero Anacardium, colheita de frutos de um
cajueiro…………………………………………………………………………….................... 39
Figura 2.12 – Disseminação do Anacardium occidentale…...................…………………. 40
Figura 2.13 – Anacardium occidentale L. (Caju e castanha)....................... ……………… 40
Figura 2.14 – Corte transversal na castanha de caju………………………………………. 41
Figura 2.15 – Esquema do beneficiamento da castanha de caju…………………………… 42
Figura 2.16 – Local de armazenagem da castanha de caju na Unidade de
Beneficiamento de Macaíba/RN……...……………………………………………………... 44
Figura 2.17 – Local usado para a secagem da casca da castanha………………………… 44
Figura 2.18 – Peneiras vibratórias para a classificação da castanha……………………… 45
Figura 2.19 – Autoclave usada no cozimento das castanhas……………………………… 46
Figura 2.20 – Caldeiras usadas para o cozimento em LCC………………………………… 46
Figura 2.21 – Processo semimecanizado para a extração da castanha por meio de
decorticação…………………………………………………………………………………… 47
Figura 2.22 – Telas e caixas de polipropileno usadas na secagem e resfriamento da
castanha……………………………………………………………………………………….. 48
Figura 2.23 – Processo de despeliculagem manual para a separação da castanha e o
tegumento…………………………………………...………………………………………… 49
Figura 2.24 – Classificação das castanhas na Unidade de Beneficiamento de Castanha
de Caju de Macaíba/RN………..…………………………………………………………….. 50
Figura 2.25 – Castanha de caju com o tegumento…………………………………………. 51
Figura 2.26 – Estrutura da (+) catequina e (-) epicatequina isoladas do TCC…………… 57
Figura 2.27 – Produção mundial de óleos vegetais em milhões de toneladas…………… 61
Natália de Freitas Oliveira Página 16

Figura 2.28 – Esquema do processo hidrolítico …………………………………………….. 66


Figura 2.29 – Mecanismo de formação de radicais livres………………………………… 66
Figura 2.30 – Esquema geral da auto oxidação lipídica………………………………..…... 68
Figura 2.31 – Representação da ação da luz ultravioleta, decomposição de
hidroperóxidos pela presença de cátions metálicos e ação do oxigênio singleto na região
insaturada de um ácido graxo, respectivamente……………………………………………. 69
Figura 2.32 – Estruturas químicas de antioxidantes sintéticos…………………………… 72
Figura 2.33 – Esquema reacional do teste de iodo…………………………………………. 74
Figura 2.34 – Esquema reacional do teste de peróxido …………………………………… 74
Figura 2.35 – Curva de determinação da estabilidade oxidativa…………………………... 78
Figura 2.36 – Comparação entre os métodos para determinar a estabilidade
oxidativa……………………………………………………………………….………………. 79
Figura 2.37 – Apresentação do PetroOXY………………………………………………….. 80
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA
Figura 4.1 – Divisão geográfica da produção de castanha de caju no Rio Grande do
Norte…………………………………………………………………………………………… 95
Figura 4.2 – Casca da castanha in natura e após à moagem……………………….……… 110
Figura 4.3 – Sohxlet (a) e Rotaevaporador (b)................................................................. 111
Figura 4.4 – Apresentação do funcionamento esquemático do PetroOxy……………..… 121
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 5.1 – Eluições da coluna 1 versus frações coletadas……………………………….. 126
Figura 5.2 – Espectros de infravermelho das frações da cromatografia da coluna 1....... 128
Figura 5.3 – Espetros do LCC natural (A), ácido anacárdico (B), cardonol (C), LCC
técnico (D) …………………..………………………………………………………………… 129
Figura 5.4 – Eluições da coluna1.1 versus frações coletadas……………………………… 130
Figura 5.5 - Espectros de IV das frações escolhidas da coluna 1.1......... ……………...... 131
Figura 5.6 – Eluições da coluna 1.2 versus frações coletadas……………………..……… 132
Figura 5.7 - Espectros IV das frações escolhidas da coluna 1.2.... ……………................ 132
Figura 5.8 – Eluições da coluna 2 versus frações coletadas…….………………………… 134
Figura 5.9 – Eluições da coluna 3 versus frações coletadas……….……………………… 135
Figura 5.10 – Espectros de infravermelho das frações isoladas…………………………… 138
Figura 5.11 – Espectros de infravermelho da extração de sais de amônio ……….……… 144
Figura 5.12 – Varredura no UV-vis dos extratos metanólicos em diferentes diluições.... 149
Figura 5.13 – Infravermelho dos extratos do TCC………………………………………… 149
Figura 5.14 – Atividade antioxidante dos extratos relativo ao tempo ……………………. 151
Figura 5.15 – Índice de acidez dos óleos de canola (OC) (a) e girassol (OG) (b) nos
diferentes tempos de oxidação e antioxidantes…………..………………………………… 157
Figura 5.16 – Índice de peróxido dos óleos de girassol (a) e óleos de canola (b) versus
os tempos de oxidação acelerada utilizando diferentes antioxidantes…………………… 158
Figura 5.17 – Gráfico de superfície do IP versus IA e o tempo de oxidação acelerada
dos OC (a) e OG (b)..................……………………………………………………………… 160
Figura 5.18 – Formação de dienos (232 nm) e trienos (270 nm) conjugados, extinção
específica versus o antioxidante e tempo de oxidação acelerada dos óleos de canola (a) e
(b) e óleos de girassol (c) e (d)……………………………………………………………… 162
Natália de Freitas Oliveira Página 17

Figura 5.19 – Fator de proteção (%) dos antioxidantes naturais aos óleos de canola (a) e
girassol (b) sem antioxidante.....................…..…..………………………………………… 164

LISTA DE FLUXOGRAMAS
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA
Fluxograma 4.1 – Esquema de trabalho........................................................................... 94
Fluxograma 4.2 – Marcha para a caracterização dos constituintes químicos presentes no
96
extrato hidroalcoólico.…………………………………………………………………….
Fluxograma 4.3 – Hidrolise ácida do extrato hodroalcoólico do TCC e seus
97
tratamentos…………………………………………………………………………………….
Fluxograma 4.4 - Marcha para a caracterização dos constituintes químicos presentes no
98
extrato clorofórmico.……………………………………………………………………...
Fluxograma 4.5 – Hidrólise alcalina do extrato clorofórmico do TCC e seus
99
tratamentos……………………………………………………………………………………..
Fluxograma 4.6 – Extração e isolamento de alcalóides em meio ácido …………………. 113

CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÕES


Fluxograma 5.1 – Tratamento residual da sílica da coluna 2………….………………….. 135
Fluxograma 5.2 – Tratamento residual da sílica da coluna 3……………………………… 137
Fluxograma 5.3 – Tratamento ácido para o isolamento de sais de amônio ……………… 141
Fluxograma 5.4 – Tratamento alcalino para o isolamento de sais de amônio …………… 142
Fluxograma 5.5 – Extração e isolamento de taninos em solventes polar/apolar.............. 146
Natália de Freitas Oliveira Página 18

LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 2.1 – Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico 34
Tabela 2.2 – Composição físico-química e mineral do tegumento da castanha de cajú.. 52
Tabela 2.3 – Composição de ácidos graxos de lipídeos extraídos do TCC……………... 53
Tabela 2.4 – Perfil químico do TCC usando diferentes solventes……………………….. 54
Tabela 2.5 – Teor de compostos fenólicos totais do TCC sob diferentes métodos…….. 56
Tabela 2.6 – Teor de carotenoides, tocoferóis e tiamina no TCC………………………... 58
Tabela 2.7 – Atividade antioxidante do TCC sob diferentes métodos…………………... 59
Tabela 2.8 – Teor de antioxidantes do TCC variando a metodologia e a temperatura.... 60
Tabela 2.9 – Teor de ácido graxo em óleos vegetais…………………………..………….. 62
Tabela 2.10 – Principais etapas do refino industrial de óleos vegetais………..……..….. 63
Tabela 2.11 – Modificações e alterações dos óleos em diferentes etapas oxidativa........ 65
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA
Tabela 4.1 – Representação das cores características, em determinado pH, para a
identificação das constituintes antocianinas, antocianidinas e flavonoides …………….. 101
Tabela 4.2 – Representação das cores características, em determinado pH, para a
identificação dos constituintes leucoantocianidinas, catequinas e flavononas………… 101
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 5.1 – Teste de rendimento dos constituintes dos extratos hidroalcoólico e
clorofórmico…………..………………………………………………………………………. 123
Tabela 5.2 – Resultado do perfil fitoquímico do Tegumento da Castanha do Caju (TCC) 124
Tabela 5.3 – Análises qualitativas de frações da caracterização fitoquímica…………….. 125
Tabela 5.4 – Resultados dos testes de Liebermann- Burchard e Salkowski……………… 127
Tabela 5.5 – Rendimento das diferentes extrações do LCC……………………..………... 127
Tabela 5.6 – Atribuição das absorções na região de IV dos espectros apresentados nas
figuras 5.4 e 5.5………………………………………………………………………………... 129
Tabela 5.7 – Atribuição das absorções na região de IV dos espectros apresentados nas
figuras 5.2 e 5.3………………………………………………………………………………... 133
Tabela 5.8 – Atribuição das absorções na região de IV das frações da coluna 2, coluna 3
e dos espectros da figura 5.10....... ………………………………………………………… 139
Tabela 5.9 – Testes qualitativos do isolamento de sais de amônio……………………….. 143
Tabela 5.10 - Atribuição dos dados de IV da figura 5.11………………………………...... 144
Tabela 5.11 – Rendimento das frações de taninos obtidas no fluxograma 5.5 …………… 146
Tabela 5.12 – Testes qualitativos para compostos fenólicos das extrações de taninos…. 146
Tabela 5.13 – Solubilidade dos extratos do TCC…………………………………………… 148
Tabela 5.14 – Análise de compostos fenólicos totais dos extratos………………………… 150
Tabela 5.15 – Percentual de inibição antioxidante em b-caroteno/ ac. linoleico………… 152
Tabela 5.16 – Caracterização química dos OC e OG em diferentes estágios…………… 153
Tabela 5.17 – Índice de acidez dos OC e OG com e sem a ação de antioxidante............... 156
Tabela 5.18 – Correlações entre o IA e o IP dos OC e OG com o DT e TC..................... 163
Tabela 5.19 – Fatores de proteção dos antioxidantes naturais (5000 ppm) e do BHA nos
óleos de canola e girasso l em diferentes tempos de oxidação acelerada…………….. 166
Natália de Freitas Oliveira Página 19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS


AA Percentual de inibição antioxidante
ABIOVE Associação Brasileira Indústrias Óleos Vegetais
ABTS 2,2 '-azino-bis 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico
ACC Amendoa da Castanha de Caju
AGL Ácido Graxo Livre
ANVISA Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
AOM Active Oxygen Method
ASTM American Society for Testing and Materials
BHA 2,3-terc-butil- 4-metil-metoxifenol
BHT 3,5-di-t-butil-4- hidroxitolueno
CC Cromatografia em Coluna
CCC Casca da Castanha de Cajú
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CFT Compostos Fenólicos Totais
DC Dieno Conjugado
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
E% Extinção específica
EAG Equivalent Acid Galic
EO Estabilidade Oxidativa
FRAP Parâmetro do íon férrico reduzido
GAeq Ácido Gálico Equivalente
IA Índice de Acidez
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica
II Índice de Iodo
IP Índice de Peróxido
IPP Isopentenil difosfato
IV Infravermelho
LCC Líquido da castanha do cajú
LDL Inibição da peroxidação lipídica
LI 1,4-cineol
LII 1,8-cineol
LSD Dietilamida do Ácido Lisérgico
MDF Extrato Metanólico Desengordurado à Frio
MDQ Extrato Metanólico Desengordurado à Quente
MF Extrato Metanólico à Frio
MQ Extrato Metanólico à Quente
OC Óleo de Canola
OG Óleo de Girassol
OSI Open Systems Interconnection
PDSC Pressure Differential Scanning Calorimeter
PG 3,4,5-ácido triidroxibenzóico-propil galato
RMN Ressonância Magnética Nuclear
ROS Reactive Oxygen Species
SAQ Sais de Amônio quartenário
SD Desvio Padrão
TBARS Ácido tiobarbitúrico
TBHQ Terc-butil-hidroquinona
TC Trienos Conjugados
TCC Tegumento da castanha de Cajú
USDA United States Department of Agriculture
UV Ultravioleta-vis
Natália de Freitas Oliveira Página 20

Capítulo 1

Introdução
Natália de Freitas Oliveira Página 21

1. INTRODUÇÃO

Os recursos naturais possuem um grande potencial na produção de compostos. Isto se


deve não apenas à quantidade de espécies vegetais existentes, mas principalmente à variedade
de metabólitos primários e secundários por elas sintetizados.

O cajueiro (Anacardium occidentale) é uma planta originária do Brasil e tem como


“habitat” a região litorânea que se estende da Amazônia ao Nordeste. Encontra-se distribuída
em diversas regiões tropicais do mundo, entre as quais se destacam: Moçambique, Tanzânia,
Quênia, Guiné Bissau, Indonésia, Tailândia e Vietnã (LUBI; THACHIL, 2000;
PARAMASHIVAPPA et al., 2001) e Índia (DAS; SREELATHA; GANESH, 2004). O
comércio de castanha de cajú começou no início de 1920. A Índia foi pioneira no seu
processamento e comercialização em escala industrial. Ainda hoje é o principal produtor de
castanha de cajú, seguida pelo Vietnã e o Brasil (CHAVES et al., 2010).

No Brasil, a agroindústria do cajú está concentrada na região Nordeste, sendo os


estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte responsáveis por 95% da produção. Segundo o
IBGE, o Brasil tem uma área de plantio próxima a 775 mil hectares, praticamente sem
alteração nos últimos 10 anos, cuja produção vem oscilando em torno de 276 mil toneladas
por ano (IBGE, 2011).

O cajueiro tem sido descrito, há séculos, como uma ótima fonte medicinal e suas
aplicações na medicina popular são relatadas na literatura. Diferentes constituintes químicos,
isolados e identificados de várias partes do cajueiro, podem ser associados à usos medicinais,
como por exemplo as folhas que contêm flavonóides, tais como: agatisflavona, apigenina,
kanferol, miricetina, quercetina, quercetina-3-O-glicopiranosila, quercetina-3-O-
ranminopiranosila, robustoflavona e amentoflavona foram encontrados e aplicados (ARYA et
al., 1989). Das flores foram isolados o éster do ácido gálico (galato de etila) (SANKARA
SUBRAMANIAN; JOSEPH; NAIR, 1969). A casca do seu caule apresenta o ácido gálico
como componente majoritário. Como produto de hidrólise de taninos, foram obtidos os
esteróides: mioinositol, colesterol, campesterol, estigmasterol e sitosterol (DINDA;
CHATTERJEE; BANERJEE, 1987; MOTA, 1982). Da casca da castanha isolou-se o
occidentosideo (-)-salipurposideo (BHAT; MURTHY; RAO, 1981; MURTHY, 1982),
naringenina, naringenina–7-O-(6’’-O-p-cumaroil)- β-D-glicosila (RAHMAN et al., 1978),
naringenina-5β- glicosila (MURTHY, 1982). No tegumento selecionaram-se para estudos as
Natália de Freitas Oliveira Página 22

diversas fontes fenólicas, das quais foram isoladas a (+)-catequina e (-)-epicatequinas


(SANKARA SUBRAMANIAN; JOSEPH; NAIR, 1969). Além disto, suas atividades
farmacológicas têm sido testadas e uma das classes de compostos bioativos que tem
despertado maior interesse são os lipídios fenólicos, sobretudo por suas propriedades
antioxidantes ( KAMATH; RAJINI, 2007; KUBO et al., 2006).

O interesse pelos antioxidantes naturais tem-se intensificado devido à sua baixa


toxicidade em relação aos antioxidantes sintéticos. Outros subprodutos gerados pela indústria
alimentícia e no uso doméstico, como peles, cascas e fibras de frutas e vegetais, são
importantes fontes de antioxidantes naturais. Consequentemente, as preocupações do setor
industrial na tentativa de atender à essas exigências fazem com que novas tecnologias sejam
buscadas, visando à obtenção de produtos que proporcionem benefícios aos consumidores e,
ao mesmo tempo, diminuam perdas econômicas (PEREIRA; VIDAL; CONSTANT, 2009).

Óleos e gorduras vegetais são reconhecidos como componentes importantes da dieta


humana. Sua produção tem aumentado nos últimos anos devido à tendência de substituir
gradualmente a gordura animal. Estas mudanças decorrem devido à busca de um estilo de
vida mais saudável, aumentado o consumo de alimentos ricos em compostos benéficos à
saúde humana (SHAHIDI; ALASALVAR; LIYANA-PATHIRANA, 2007b; TUBEROSO et
al., 2007; SHAHIDI; SENANAYAKE, 2008; ROBLEDO et al., 2014). Os óleos vegetais
representam um dos principais produtos extraídos de plantas, seus usos na indústria
alimentícia correspondem a 70% de sua produção (ABIOVE, 2013). O mercado mundial de
oleaginosas representa cerca de 36% do valor total gerado pelo comércio dos produtos
agropecuários (USDA, 2015).

A indústria brasileira de processamento de óleos está entre as maiores do mundo e a


maior da América Latina, com capacidade atual de 177.980 ton./dia. Os óleos de soja, canola,
milho e girassol são os óleos com maior volume de produção e comercialização (ABIOVE,
2013; QUEIROGA NETO et al., 2009). O óleo vegetal bruto possui características físico-
químicas que fogem dos padrões para o seu consumo imediato. A indústria de refino de óleos
tem um papel determinante, que reúne um conjunto de recursos operacionais, convertendo o
óleo vegetal cru em produto comestível (LIST; PATTERSON, 2009; O'BRIEN, 2010). Sendo
assim, o refino do óleo é indispensável para que o mesmo adquira características desejáveis
para o seu consumo.
Natália de Freitas Oliveira Página 23

Devido as suas composições químicas e as condições de armazenamento, os óleos


vegetais têm a susceptibilidade de sofrer degradação por meio de oxidação acelerada,
termólise e/ou polimerização sob exposição ao calor (KONSOULA; LIAKOPOULOU-
KYRIAKIDES, 2010; LEE; LEE; CHOE, 2008; MOHDALY et al., 2010; VELASCO;
DOBARGANES, 2002). Estas reações afetam tanto as suas propriedades organolépticas
quanto a vida de prateleira do produto, se tornando um dos grandes desafios da indústria
alimentícia (IQBAL; BHANGER, 2007; SHAHIDI; HO, 2007; Y., 2001).

A adição de antioxidantes é eficaz em retardar a oxidação de lipídios (SUJA et al.,


2004). No entanto, a preocupação atual no que se refere aos possíveis efeitos adversos dos
antioxidantes sintéticos, tais como 2,3-terc-butil- 4-metil-metoxifenol (BHA), 3,5-di-t-butil-4-
hidroxitolueno (BHT) e terc-butil-hidroquinona (TBHQ) que são amplamente utilizados na
indústria alimentícia, está relacionada a propensão de causar diversos tipos de cânceres (
DUH; YEN, 1997; ITO, 1982;). Portanto, pesquisas para obter antioxidantes naturais mais
seguros e eficazes estão em andamento e várias fontes naturais estão sendo
examinadas (BOYER; LIU, 2004; HEMALATHA, 2007; SUJA et al., 2004; WANG et al.,
2007).

Baseado nesse contexto, este estudo procurou-se isolar os diferentes tipos de


metabólitos secundários do tegumento; elaborar e otimizar uma metodologia para o refino dos
óleos de canola e girassol; e avaliar o potencial antioxidante do extrato do tegumento da
castanha de cajú na estabilidade oxidativa (EO) de óleos vegetais.
Natália de Freitas Oliveira Página 24

Capítulo 2

Revisão bibliográfica
Natália de Freitas Oliveira Página 25

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Produtos Naturais

Na história dos produtos naturais, a utilização de plantas no tratamento de doenças é


considerada tão antiga quanto a própria humanidade. Os primeiros habitantes do planeta
queimavam plantas de odor agradável para pedir proteção aos bons deuses, às de perfume
desagradáveis, como um meio de afugentar os animais ou para afastar os deuses maléficos.
Além destas, outras utilidades, como: o uso na fabricação de ferramentas, confecção de
roupas, armas de caça e ainda, o uso alimentício (BEVILACQUA, 2010; MCCURDY;
SCULLY, 2005).

Com o tempo, o homem primitivo aprendeu com os animais a distinguir as plantas


comestíveis daquelas que podiam ajudá-lo na cura de suas doenças e, assim, já usavam a
fitoterapia. Chineses, babilônios e egípcios já cultivavam diversas ervas que eram utilizadas
como purgantes, vermífugos, diuréticos, anticépticos e cosméticos (RATES, 2001). No
entanto, o registro mais antigo que se conhece sobre esta utilização foi encontrado em um
túmulo do Período Neolítico (entre 5000 e 2500 anos a.C.), no qual encontraram vestígios de
uma múmia envolvida com plantas aromáticas, identificadas pela presença de restos de grãos
de pólen (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991).

Os primeiros registros do uso das plantas na medicina estão nos papiros egípcios, nos
escritos chineses, nas folhas de bambu e nas tábuas de argila dos sumérios. Também foram
encontrados documentos na Índia e na Grécia antiga, que descrevem diversas plantas e suas
respectivas finalidades curativas (BELTRAN, 1996; STOCKWELL, 1988). No século XVI
a.C., já eram utilizadas cerca de 700 drogas, incluindo a babosa, o absinto, a hortelã, a mirra e
o cânhamo no Egito Antigo (BEVILACQUA, 2010).

Já no século XVIII a.C., o médico grego Galeno foi o pioneiro em experimentos com
animais, desenvolvendo as primeiras teorias médicas baseadas em experimentações
científicas, revolucionando o estudo da medicina, e sendo importante posteriormente para a
compreensão da atuação dos medicamentos no organismo humano. Paracelso, foi o primeiro a
defender a importância da química na preparação de medicamentos, além de ser considerado
o primeiro a propor a cura através de princípios homeopáticos (BELTRAN, 1996;
BEVILACQUA, 2010).
Natália de Freitas Oliveira Página 26

O primeiro isolamento de princípios ativos oriundos de produtos naturais (alcalóides


como a morfina, estricnina e quinina) ocorreu no século XIX e reacendeu as pesquisas do uso
de plantas medicinais (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991). Nos últimos anos houve
um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas
medicinais, os quais visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas
(CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; CALIXTO et al., 2003).

No Brasil, a utilização de produtos naturais foi descrita pelos portugueses desde a sua
chegada em 1500, onde diversas espécies vegetais foram citadas a partir de observações da
cultura indígena, como é o exemplo da Carapa guianensis (andiroba) e Bixa orellana
(urucum), utilizadas como produtoras de corantes. Outras espécies, como é o caso da
Hymeneae coubaril (jatobá), produtora de resina, e Strychnos guianensis (erva-besteira), do
qual isolou-se o “curare”, também foram bastante procuradas por exploradores europeus,
ainda antes do século XVIII (PINTO, 1995). No século XIX, mais precisamente no ano 1847,
chega ao Brasil um farmacêutico, Theodoro Peckolt, que por suas extensas pesquisas, é
considerado o pai da fitoquímica brasileira. A partir de então, vários grupos de pesquisas
foram modificando seu foco, que outrora se restringia à fitoquímica tradicional (isolamento e
determinação estrutural) ampliando seus trabalhos para práticas que envolvam: atividades
biológicas, ecologia química, biossíntese de micromoléculas de plantas, microrganismos e
organismos marinhos (PINTO et al., 2002; VIZZOTO et al., 2010).

O extenso consumo e uso de plantas para fins terapêuticos no Brasil deve-se ao fato de
que a maioria dos remédios possui um elevado custo, mesmo os fabricados no país. O
desenvolvimento de compostos sintéticos é bastante prejudicado, pois suas matérias-primas
são normalmente importadas, assim elevam o custo da produção e, consequentemente, o preço
final ao consumidor. Vale salientar que a utilização de plantas traz inúmeras vantagens
ambientais, já que são produtos biodegradáveis, seu suprimento é auto-sustentável devido à
diversidade da flora e com uma utilização de maior valor econômico (CLARDY; WALSH,
2004; HAMMOND et al., 1997; KOEHN; CARTER, 2005; SILVA JUNIOR; VIZZOTTO,
1996).

2.2 Metabólitos primários e secundários

As plantas podem sintetizar dois tipos de metabólitos: primários e secundários.


Denomina-se como metabolismo primário o conjunto de reações participantes de processos
Natália de Freitas Oliveira Página 27

essenciais à vida, desenvolvimento e manutenção celular, sendo comuns aos seres vivos
(VIZZOTO et al., 2010). Os metabólitos primários tais como: os ácidos nucleicos,
aminoácidos, clorofila, proteínas, monossacarídeos, ácidos carboxílicos do ciclo de Krebs,
lipídeos, glicerídeos e glicólise (ALBUQUERQUE, 2013; ANDRADE; CASALI, 1999;
FONSECA, 2001; PROBST, 2012; ROGERIO, 2006; TAIZ; ZAIGER, 1998).

A maioria dos vegetais, microrganismos e, em menor escala os animais, possuem um


arsenal metabólico (enzimas, coenzimas e organelas) que são usados como precursores na
síntese de outros compostos, originando os metabolitos secundários. Este conjunto metabólico
é caracterizado por uma grande diversidade química, que embora não sejam necessariamente
essenciais ao organismo produtor, garantem vantagens na sobrevivência e perpetuação da
espécie no ecossistema (MORAES, 2008; SANTOS, 1999).

Os metabólitos secundários já foram considerados por diversos autores como produtos


sem valor ou mesmo resultantes de erro metabólico. Entretanto, a partir da década de 1950,
estudos envolvendo diversas áreas do conhecimento passaram a ser mais compreendidos.
Atualmente, sabe-se que muitas destas substâncias estão diretamente envolvidas com a
adequação do seu produtor ao meio como, por exemplo: defesa contra patógenos e herbívoros,
proteção contra raios UV, atração de polinizadores, tolerância a temperaturas extremas e
adaptação ao estresse hídrico ou deficiência de nutrientes e minerais do solo (DIXON, 2001;
HARBORNE, 2001; MANN, 1987; PROBST 2012; SANTOS, 1999; SANTOS, 2004;
VERPOORTE; ALFERMANN, 2000; WINK, 1990).

Uma vantagem econômica, tanto dos metabólitos primários como dos secundários, é a
facilidade de obtenção através de processos relativamente simples, como a destilação a vapor
ou por extração com solventes aquosos ou orgânicos (CHAGAS, 2004; COSTA, 2008), mas
muito destes metabólitos têm estruturas altamente complexas, que determinam sua atividade
biológica e não podem ser economicamente sintetizados.

O ácido chiquímico (precursor de vários compostos aromáticos), acetato (precursor de


ácidos graxos, fenóis, isoprenos, prostaglandinas, etc.) e aminoácidos aromáticos (biossíntese
de alcalóides) originam três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos (compostos
apolares/polares), componentes contendo nitrogênio (compostos nitrogenados) e compostos
fenólicos (Figura 2.1) (CROTEAU et al., 2000; KING; YOUNG, 1999; MORAES, 2008;
SHAHIDI, 1997; SHAHIDI; HO, 2005; SHAHIDI; NACZK, 2003; TAIZ; ZEIGER, 2006).
Natália de Freitas Oliveira Página 28

Figura 2.1 – Resumo da biossintese dos metabólitos secundários.

Fonte: Adaptado por Taiz; Zeiger, 2004.

2.2.1 Terpenos

Os terpenos ou terpenóides, também conhecidos como isoprenóides, são a maior


classe de metabólitos secundários, com maior variedade estrutural e funcional existentes nas
plantas, com mais de 55 mil compostos isolados. Seu nome deriva do fato de que os primeiros
membros da classe foram isolados da terebentina (terpentin em alemão). São em sua maioria
apolares, insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos (CHANG et al., 2010;
OLIVEIRA, 2003).

Os terpenos são formados a partir da união de unidades básicas chamadas de isopreno


(C5), como por exemplo: monopreno (2 unidades de isopreno), sesquiterpenóides (3 unidades
de isopreno), diterpenóides (4 unidades de isopreno), sesterpenos (5 unidades de isopreno),
triterpenóides (6 unidades de isopreno), tetraterpenóides (8 unidades de isopreno),
polisoprenóides (n unidades de isoprenos) (AHARONI et al., 2006; ALVES, 2001;
CROTEAU et al., 2000; VERPOORTE; ALFERMANN, 2000).

A maioria destes compostos apresenta baixo peso molecular, grande variedade de


estruturas e alta pressão de vapor à temperatura ambiente (BAKKALI et al., 2008). A maioria
dos terpenoides são produtos do metabolismo secundário, tendo como função intermediar a
relação da planta e o ambiente, podendo ser: alelopáticos (DUKE; OLIVA, 2004; MACIAS
et al., 2007), como o 1,4-cineol (LI) e o 1,8-cineol (LII) (Figura 2.2); repelentes contra insetos
Natália de Freitas Oliveira Página 29

(VIEGAS JÚNIOR, 2003) e agentes contra infecções de patógenos (saponinas agem como
detergentes rompendo as membranas de fungos e bactérias patogênicas) (YANG et al. 2006).

FIGURA 2.2 – Estrutura quimica de terpenóides repelentes de insetos.

Fonte: MITCHELL, 1989.

Dentro do grupo dos terpenos destacam-se os óleos voláteis e as saponinas. Os


primeiros são dotados de forte aroma, líquidos e oleosos extraídos principalmente de plantas
por arraste a vapor. Suas principais características físico-químicas são a volatilidade, o aroma
intenso e agradável e a solubilidade em solventes orgânicos apolares, são derivados dos
triterpenóides em sua maioria. As saponinas são glicosídeos, estas formadas de várias
unidades monossacarídeos em um núcleo, que pode ser constituído por esteróides ou
triterpenos, podendo ser classificados como saponinas esteroidais ou saponinas triterpênicas.
Sua maior característica é a formação de espuma abundante quando agitadas na água, devido
a sua estrutura química, onde os açúcares solúveis ligados a esteróides lipofílicos ou
triterpênicos reduzem a tensão superficial da água (COSTA, 2008; LÉON, 2015; MATOS,
2007; SILVA, 2007; SIMAS et al., 2004; SIMÕES; SPITZER, 2004).

Quanto à importância farmacológica, muitas propriedades são estabelecidas a


respeito dos terpenóides, entre elas: ação hepatoprotetora, analgésica, antiespasmódica, anti-
inflamatória, antimicrobiana, antioxidante, antisséptica, antiviral, carminativa, hemolítica,
estimulante gastrointestinal, estimulante do Sistema Nervoso Central, secretolítica, dentre
outras (ABDON et al., 2002; AGNANIET et al., 2005; BREMNER; HEINRICH, 2002;
COMPAGNONE et al., 2010; COSTA et al., 2008; LIMA et al., 2006; LIU, 1995;
MAGALHÃES et al., 2008; MAHATO, et al., 1988; MORAIS et al., 2006; SANTOS et al.,
2005; SILVA et al., 2004; SIMINIONATO et al., 2007; SIMÕES; SPITZER, 2004; SOUZA
et al., 2006; SUAREZ et al., 2005; SYLVESTRE et al., 2006; TORRES et al., 2008).
Natália de Freitas Oliveira Página 30

2.2.2 Compostos nitrogenados e derivados

Os compostos orgânicos nitrogenados são moléculas orgânicas que apresentam em sua


constituição o heteroátomo nitrogênio. Os alcalóides são bases orgânicas bastante comuns nos
vegetais, possuem um átomo de nitrogênio em um ou mais anéis heterocíclicos de carbono,
podendo apresentar-se na forma de aminas primárias, secundárias ou terciárias. Sua utilidade
vai desde as suas ações contra herbívoros (nicotina e a estricnina) como a produção de
fármacos importantes (morfina, cocaína, codeína, escopolamina) e alelopáticos (BLUA et al.,
1998; BLUM, 2004).

2.2.2.1 Alcalóides

Os alcalóides eram antigamente classificados como “álcalis vegetais”, devido sua


grande maioria possuir caráter alcalino como consequência do par de elétrons não
emparelhados no nitrogênio (BRUNETON, 1999). Porém existem alcalóides de caráter ácido
como a colchicina e piperina, oximas e alguns sais quaternários (DEWICK, 2002;
KUTCHAN, 1995). Estes possuem estrutura variada: alguns são líquidos, como a nicotina,
esparteína e coniina, mas sua grande maioria é composta por sólidos raramente corados,
opticamente ativos e solúveis em solventes orgânicos apolares ou pouco polarizados. Como
os alcalóides se encontram nas plantas na forma de sais de ácidos orgânicos, normalmente são
extraídos com soluções de ácidos minerais fortes (ácido clorídrico) devido a sua fácil
complexação em cloretos de alcalóides, tornando-os solúveis em água (COSTA, 2008;
GERHARDT, 2012; SILVA, et al., 2012; VIZZOTO, 2010).

Compondo a principal classe de compostos nitrogenados, os alcalóides são


encontrados no metabolismo secundário de plantas superiores, constituindo cerca de 20% das
substâncias naturais descritas, aproximadamente 20.000 substâncias identificadas
(BRUNETON, 1999; PROBT, 2012; SIMÕES, 2008). Esses compostos podem ser
encontrados em todas as partes do vegetal, mas seus acúmulos preferenciais ocorrem nos
tecidos em crescimento ativo, como: células epidérmicas e hipodérmicas, bainhas vasculares e
vasos lactíferos (ALBURQUERQUE, 2013; COSTA, 2008; SIMÕES, 2003).

Nas plantas, os alcalóides apresentam como função principal a defesa contra a invasão
de microrganismos, patógenos e herbívoros, devido a sua toxicidade e ao seu gosto amargo.
Porém outras funções podem ser sugeridas para essas substâncias, como a ação fotoprotetora
contra radiação ultravioleta (ZHANG; BJORN, 2009). Um exemplo disto se dá pelo aumento
Natália de Freitas Oliveira Página 31

da concentração do alcalóIde solanina em batatas quando estas são atacadas por


microrganismos (ALBURQUERQUE, 2013; COSTA, 2008; JOSSANG et. al., 1991;
HENRIQUES et al.,2004; HOCQUEMILLER et. al., 1981; SILVA et. al., 2009; SIMÕES;
BENNETT; ROSA, 2009; WUERATIN et. al., 1996).

Os alcalóides podem ser classificados em alcalóides verdadeiros (Figura 2.3 a),


protoalcalóides (Figura 2.3 b) e pseudoalcalóides (Figura 2.3 c). Os alcalóides verdadeiros são
formados pelo átomo de nitrogênio pertencente ao anel heterocíclico; enquanto nos
protoalcalóides, o nitrogênio não pertence ao anel heterocíclico. Já os pseudoalcalóides são os
compostos nitrogenados cujos precursores não são aminoácidos, mas sim outras substâncias
como os terpenos e esteróides (HENRIQUES et al., 2004).

FIGURA 2.3 - Alcalóide verdadeiro (Escopolanima) (a), Protoalcalóide (Muscina) (b)


e Pseudoalcalóide (Teofilina) (c).

(a) (b) (c)

Fonte: GOBBO-NETO, 2007.

2.2.2.2 Sais de amônio

Sais de amônio são sólidos iônicos com alto ponto de fusão, muito mais solúveis em
água que as aminas originais e ligeiramente solúveis em solventes orgânicos apolares. Essas
propriedades são muito úteis no isolamento e purificação de aminas. Diversas técnicas
analíticas têm sido desenvolvidas visando a separação das aminas bioativas em vegetais,
dentre elas: as cromatografias de papel, camada fina, gasosa e líquida de alta eficiência
(BUFFET-BATAILLON et al., 2012; KALAČ; DADAKOVA; PELIKÁNOVÁ, 2009;
WALLEN, 1954).

A solubilidade de um sal de amônio de cadeia longa na fase aquosa, depende do ânion


e do tipo de diluente podendo ser afetado com o aumento do peso molecular.

Sua ocorrência em vegetais é vasta, uma delas é o cloreto de D-tubocurarina, principal


componente da espécie vegetal Chondodendron tementosum (uva do mato). Seu extrato é
Natália de Freitas Oliveira Página 32

usado pelos índios para o envenenamento de flechas e ao atingir o animal é capaz de produzir
um quadro de paralisia progressiva, mesmo em animais de grande porte (KALAČ;
DADAKOVA; PELIKÁNOVÁ, 2009)

Sua fórmula geral é representada por R1R2R3R4N+, onde Rn (alquila, arila ou


hidrogênio) e classificados em função do número de substituintes ligados ao átomo de
nitrogênio em primários, secundários, terciários e quaternários. Os sais de amônio podem ser
divididos em duas classes bem distintas. Primeiro, aqueles nos quais um ou mais substituintes
são átomos de hidrogênio; esses cátions amônio formados por protonação de aminas podem
ser facilmente desprotonados, de acordo com a representação a seguir (TEZEL, 2009).

R1R2R3N + H3O+ R1R2R3NH+ + H2O

Muitas drogas ou moléculas biologicamente ativas são aminas, comumente


armazenadas em formato de sais, por serem mais estáveis e não sofrerem reações de
decomposição. Outro ponto importante é que os sais não apresentam o desagradável odor de
peixe, característico das aminas.

Um exemplo é a amina efedrina (Figura 2.4 (a)), amplamente utilizada em gripes e


crises alérgicas. A efedrina funde a 79 °C, tem um odor desagradável e é decomposta por
oxidação pelo ar em produtos indesejáveis. Já o seu sal, cloridrato de efedrina (Figura 2.4 (b)),
funde a 217°C, não se oxida e é inodoro, sendo o ideal para compor os medicamentos
(BUFFET-BATAILLON et al., 2012; KALAČ; DADAKOVA; PELIKÁNOVÁ, 2009;
WALLEN, 1954).

FIGURA 2.4 – Efedrina (a) e Cloridrato de efedrina (b).

(a) (b)

Fonte: TOUBRO et al., 1993.

O segundo tipo de sais de amônio são os sais de amônio quaternário (SAQ). Nesses
cátions todos os quatro grupos R na estrutura R1R2R3R4N+X- são grupos alquil ou aril e não
estão em equilíbrio com a amina livre, possuindo propriedades e características bem
Natália de Freitas Oliveira Página 33

peculiares e X- representa um ânion, como demonstrados na figura 2.5 (BUFFET-


BATAILLON et al., 2012).

Figura 2.5 - Estrutura básica de um sal de amônio.

R1
+ X-
N R4
R2
R3

Fonte: Autora.

Os sais quaternários de amônia possuem caráter anfifílico (Figura 2.6), ou seja, são
compostos polares e apolares ao mesmo tempo. Por essa propriedade, são utilizados como
catalisadores de transferência de fase para mover bases e nucleófilos iônicos em solventes
orgânicos, facilitando reações nas quais um dos reagentes é insolúvel em soluções aquosas e o
outro insolúvel em soluções orgânicas. O cátion amônio (N+R1R2R3R4) do sal transferidor de
fase forma um par iônico com o ânion solúvel em água, e os grupos alquila do amônio
proporcionam solubilidade na fase orgânica (KALAČ; DADAKOVA; PELIKÁNOVÁ, 2009;
WALLEN, 1954).

FIGURA 2.6 - Caráter anfifílico dos compostos orgânicos (Cloreto de


hexadeciltrimetilamônio).

Fonte: http://www.homecleanbrasil.com.br/noticia.php?xampus-2-em-1--17

Os SAQ são grandes moléculas com pesos moleculares geralmente entre 300 e 400
g/mol e são compostos por duas porções distintas, já descritas acima. Apresentam
propriedades físico-químicas diferentes, podendo ser afetadas pelo comprimento da cadeia.
Um exemplo disso é a sua solubilidade em água, que diminui à medida que o comprimento da
cadeia apolar aumenta (BOETHLING, 1994; WALLEN, 1954). Da mesma forma, a
Concentração Micelar Crítica (CMC) de SAQ afeta a eficiência de muitas aplicações
Natália de Freitas Oliveira Página 34

relacionadas com a sua função surfactante, que diminui à medida que o comprimento da
molécula aumenta. Estas características resultam em um grande número de estudos sobre as
suas propriedades de superfície, especialmente aquelas que pertencem no grupo dos sais de
alquiltrimetilamônio (BEYER; LEINE; BLUME, 2006; DOPIERALA; PROCHASKA, 2008;
GARCIA et al., 2006; TEZEL, 2009; WALLEN 1954).

O cloreto de benzalcônio (Figura 2.7) é o sal de amônio quaternário mais conhecido,


suas formulações mais comuns incluem uma mistura de cloretos de alquil-benzil-
dimetilamónio com várias cadeias alquilo lineares que variam tipicamente de 8 a 18 carbonos.
Outros SAQ comuns incluem o bromo e o cloro sais de cetrimónio (cetil trimetil amónio) com
um comprimento de cadeia de 16 alquilos. Destes, cloreto de cetrimônio é o mais utilizado em
produtos domésticos, xampus e cosméticos (BUFFET-BATAILLON et al., 2012; HEGSTAD
et al., 2010)

FIGURA 2.7 - Cloreto de benzalcônio.

Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Cloreto_de_benzalc%C3%B4nio.

Os SAQ são usados em muitas aplicações: na metalurgia, petroquímica, produtos


químicos orgânicos, produtos farmacêuticos, eletrônicos e equipamentos elétricos, fabricação
de automóveis, vidro óptico, mineral geológico, cimento, cerâmica, joias, galvanoplastia,
limpeza e desinfecção dos edifícios agrícolas, água e tratamento de águas residuais,
tratamento antifúngico em horticultura, bem como a inclusão em produtos farmacêuticos do
nosso dia a dia, dentre outros (BUFFET-BATAILLON et al., 2012; HEGSTAD et al., 2010;
SCHCHIPUNOV, 1987; TEZEL, 2009). O interesse em SAQ não diminuiu durante anos e o
número de combinações possíveis de cátions/ânions em sal de amônio quaternário é estimada
em 1558. No entanto, até o ano de 2012 apenas 800 compostos estavam comercialmente
disponíveis (BUFFET-BATAILLON et al., 2012).
Natália de Freitas Oliveira Página 35

2.2.3 Compostos fenólicos

Compostos fenólicos são substâncias orgânicas aromáticas que possuem hidroxilas


ligadas ao anel aromático. O composto mais simples é o fenol simples (Figura 2.8), que
ocorre como resultado da descarboxilação de ácidos fenólicos, degradação térmica da lignina
ou atividade microbiana. Estão amplamente distribuídos no reino vegetal e em micro-
organismos, fazendo parte também do metabolismo animal. No entanto, os animais são
incapazes de sintetizar o anel aromático e a síntese dos compostos fenólicos ocorre em
pequena quantidade. Por outro lado, os vegetais, e a maioria dos micro-organismos têm a
capacidade de sintetizar o anel benzênico, e, a partir dele, produzir diferentes tipos de
compostos fenólicos (SIMÕES, 2001).

FIGURA 2.8 - Estrutura espacial (a) e planar (b) de um fenol simples.

(a) (b)

Fonte: OLIVEIRA, 2011.

A biossíntese completa de compostos fenólicos pode ser observada em plantas


vasculares. Todas as gimnospermas e angiospermas possuem lignina na parede celular, a qual
tem os fenilpropanóides como precursores. Pode-se ainda encontrar os ácidos hidroxibenzóico
e hidroxicinâmico e flavonóides, além de outras classes de fenóis de menor distribuição. Os
isoflavonóides estão presentes principalmente na família das leguminosas, enquanto que as
antraquinonas podem ser encontradas em aproximadamente seis famílias do reino vegetal
(MANN et al., 1994).

Os compostos fenólicos sintetizados por duas rotas distintas: rota do ácido chiquímico
a partir de carboidratos, do qual se originam os fenilpropanóides, e a rota do ácido malônico,
que se inicia com acetil-coenzima A produzindo fenólicos simples. Destas rotas, originam-se
os flavonóides e seus derivados (OLIVEIRA, 2011).
Natália de Freitas Oliveira Página 36

Os compostos fenólicos são encontrados na forma livre ou conjugada a grande


variedade de substâncias naturais, principalmente monossacarídeos como glicose, galactose,
xilose e ramnose, por meio de ligações glicosídicas, aumentando, assim, ainda mais a sua
variedade química (PICCIN, 2004).

São compostos bastante reativos e possuem em geral características ácidas, podendo


ser isolados por meio da sua solubilidade em soluções fracamente básicas, como, por
exemplo, solução de carbonato de sódio. São capazes de formar pontes de hidrogênio
intramoleculares ou intermoleculares e, devido a sua estrutura aromática, apresentam intensa
absorção na região do ultravioleta. Uma característica importante é sua habilidade de
complexação com metais, sendo que muitos desses quelatos metálicos são importantes em
sistemas biológicos. Os compostos fenólicos são facilmente oxidáveis, tanto por meio de
enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, luz, calor ou em meio alcalino,
ocasionando o escurecimento de soluções ou compostos isolados (SIMÕES, 2001).

Os compostos fenólicos podem ser classificados de diversas maneiras. Uma possível


classificação seria baseada no tipo de esqueleto principal, conforme apresentado na tabela 2.1.

TABELA 2.1 - Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico.
Esqueleto básico Classe de compostos fenólicos
C6 Fenóis simples, benzoquinonas
C6-C1 Ácidos fenólicos
C6-C2 Acetofenonas e ácidos fenilacéticos
C6-C3 Fenilpropanóides: ácidos cinâmicos e
compostos análogos, fenilpropenos,
cumarinas, isocumarinas e cromonas
C6-C4 Naftoquinonas
C6-C2-C6 Estilbenos, antraquinonas
C6-C3-C6 Flavonóides, isoflavonóides e chalconas
(C6-C3)2 Lignanas
(C6-C3-C6)2 Diflavonóides
(C6)n Melaninas vegetais
(C6-C3)n Ligninas
(C6-C1)n Taninos hidrolisáveis
(C6-C3-C6)n Taninos condensados

Fonte: OLDONI, 2007.

Os compostos fenólicos também podem ser classificados com base em sua cadeia
carbônica principal. De acordo com esta classificação, existem quatro classes principais:
Natália de Freitas Oliveira Página 37

ácidos hidroxibenzóicos, ácidos hidroxicinâmicos, cumarinas e flavonóides, das quais


derivam outras subclasses (ESCARPA; GONZÁLES, 2001).

2.3.Extração de compostos de origem vegetal

A extração de compostos vegetais é influenciada pela natureza química dos compostos


presentes, pelo método de extração empregado, pelo tamanho das partículas da amostra,
presença de substâncias interferentes e método de análise escolhido, além do tempo e
condições de armazenamento das amostras (NACZK; SHAHIDI, 2006). O preparo da amostra
é uma etapa crítica, especialmente quando os componentes da matriz são biologicamente
ativos, já que se deseja preservar a atividade dos mesmos.

Os diferentes métodos de extração são elaborados com a finalidade de se obter extrato


livre de componentes interferentes. Para isso, os numerosos métodos de extração de
compostos fenólicos incluem desde procedimentos exaustivos com várias extrações
sequenciais, até métodos mais simples que utilizam extração líquido-líquido ou líquido-
sólido, seguida de filtração (ANTOLOVICH et al., 2000).

A solubilidade dos fenólicos é governada por sua natureza química, que pode variar
desde substâncias simples até altamente polimerizadas. No entanto, também há a
possibilidade de interação dos fenólicos com outros componentes da planta, como
carboidratos e proteínas. Estas podem chegar a formar complexos insolúveis,
comprometendo, assim, a confiabilidade dos dados obtidos. Deste modo, é improvável o
desenvolvimento de um único procedimento de extração, capaz de recuperar todos os
fenólicos presentes na amostra, limitando-se a uma fração desses compostos, solúvel no
solvente utilizado (ROCKENBACH et al., 2008; SOONG; BARLOW, 2004; BENAVENTE-
GARCIA et al., 2000).

Apesar de não ser possível tomar isso como uma tendência universal, soluções de
etanol ou metanol diluídas em água são, muitas vezes, mais eficientes na extração de
compostos fenólicos do que a própria água e etanol ou metanol puros, pois a água tem elevada
polaridade e, consequentemente, possui facilidade em formar pontes de hidrogênio com as
hidroxilas dos compostos fenólicos, além de ser um solvente de baixo custo e não prejudicar o
organismo animal (ARAÚJO, 2007; RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1997). De
acordo com Lucas (1998), os compostos fenólicos têm estrutura química bem parecida com os
compostos anfifílicos, mostrados nas figuras 2.9 e 2.10. O etanol é um solvente orgânico
Natália de Freitas Oliveira Página 38

detentor de características anfifílicas e tende a arrastar formas monoméricas dos compostos


fenólicos e, assim, soluções aquosas de etanol tendem a extrair mais compostos do que a água
pura. De qualquer forma, vale salientar que cada sistema, seja ele de natureza alimentar ou
não, tem suas próprias particularidades que deve ser considerada caso a caso.
FIGURA 2.9 - Fórmula geral dos compostos anfifílicos do alquilbenzeno, onde o grupo
lateral pode ser R= –OH; -OR1; -COOR2, entre outros.

Fonte: Autora.
FIGURA 2.10 - Estruturas químicas de alguns compostos fenólicos do cajú.

Fonte: OLIVEIRA, 2015.

Alonso, Bourzeix e Revilla (1991) avaliaram o efeito de várias misturas de etanol em


água (5, 40, 60, e 80% (v/v)) para extração de compostos fenólicos de sementes de uva e
observaram maior extração destes compostos nos extratos contendo maior percentual de
etanol. Por outro lado, Kallithaka, Garcia e Bakker (1995) apontaram o metanol como sendo o
solvente mais apropriado para a extração de fenólicos, porém este não é aconselhável para
extratos que são aplicados em alimentos. Entretanto, o etanol e a água são os solventes mais
empregados para a extração de antioxidantes por razões de não toxicidade e de abundância,
respectivamente (LIGGIANE, 2008; MOHAN et al., 2005).

Além dos possíveis interferentes, também há outros fatores que podem influenciar a
extração dos compostos fenólicos, tais como temperatura e tempo de extração. Por exemplo,
segundo Naczk e Shahidi (2004), tempos prolongados de extração aumentam a chance de
oxidação dos fenólicos, a menos que agentes redutores sejam adicionados ao sistema solvente.
Natália de Freitas Oliveira Página 39

Da mesma forma, temperaturas elevadas durante a secagem e extração podem afetar a


estabilidade dos compostos, devido à degradação química, térmica e enzimática (IBANEZ et
al., 1999). Entretanto, em certos casos, o uso de temperaturas de ebulição pode levar ao
aumento no rendimento de compostos fenólicos (SHAHIDI; NACZK, 2001).

2.4. Família Anacardiaceae

Anacardiaceae é uma família constituída por cerca de 82 gêneros e mais de 700


espécies. Seus gêneros são subdivididos em cinco tribos (Anacardieae, Dobineae, Rhoeae,
Semecarpeae e Spondiadeae). São mais abundantemente representados no Sudeste Asiático,
onde existe quase metade de todas as espécies da família, mas há ocorrência também em
países tropicais e temperados.

São geralmente árvores ou arbustos (não há ervas nessa família), sua madeira possui
canais resinosos que estão localizados no córtex primário ou na casca regular e esta é
característica de muitas das espécies, estes quando expostos por injúrias, têm um cheiro
característico (BANDYOPADHYAY et al., 1985; LINDLEY, 1831; SOLEREDER, 1908).
As folhas são alternadas, simples ou imparipenadas, às vezes ternadas, sempre sem estípulas.
Suas flores crescem na extremidade de um ramo ou tronco ou num ângulo a partir de onde a
folha se une à haste e tem brácteas (MITCHELL; MORI, 1987). Há algumas plantas com
flores bissexuais e masculinas ou flores bissexuais e femininas e às vezes flores com ambos
os estames e pistilos (BRITTON; LORD; HON. 1897; LINDLEY, 1831). Os Frutos
raramente possuem uma abertura na maturidade e são na maioria das vezes drupas. A
diversidade morfológica da fruta é extremamente alta, com uma miríade de tipos encontrados
na família. Embora a maioria da família tenha frutos drupaceous, muitos destes são
variadamente modificados para diferentes mecanismos de dispersão (LORENZI, 2002). As
sementes possuem um fino revestimento com pouco ou nenhum endosperma e cotilédones
carnosos (BRITTON; LORD; HON, 1897; LINDLEY, 1831).

Aproximadamente 25% das plantas dos gêneros dessa família são caracterizadas como
tóxicas e causadoras de dermatite de contato. Nos últimos anos, a origem dos lipídios
fenólicos e derivados também foi objeto de investigação; além disso, espécies da família
Anacardiaceae têm se mostrado promissoras na busca de substâncias bioativas (KATO;
AKISUE, 2002; EVAN; SCHMIDT, 1980; JUDD et al., 1999; KATO; LAMB; BIRCHLER,
2004; YI; LOWRY; PLUNKETT, 2004).
Natália de Freitas Oliveira Página 40

Do ponto de vista químico, os gêneros mais estudados nesta família são Mangifera,
Rhus (Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia,
Lithaea, Tapirira, Melanorrhoea e Rhus, destacam-se pelo número de investigações relativas
à composição química de suas espécies e atividades biológicas de seus extratos e metabólitos.
Embora as famílias desta ordem tenham constituintes quimicamente diversos, muitas vezes
produzindo compostos resinosos ou substâncias amargas como triterpenóides e alcalóides,
estudos destas espécies possibilitaram verificar a ocorrência de flavonóides, terpenos,
esteróides, xantonas e, principalmente, dos lipídios fenólicos e derivados como o Urushiol,
presente na casca de quase toda a família (MESESAME et al., 2000; SHARMA; ALI, 1995;
TYMAN, 1979). O Urushiol é o nome dado a uma mistura de compostos fenólicos isolados
de plantas da família Anacardiaceae (ADWADKAR; ELSOHLY, 1986; BILLETS et al.,
1976; GROSS; BAER; FALES, 1975; LEE et al., 1999; LU et al., 2004). A função destas
substâncias na planta é de proteção contra invasões de fungos ou vírus, além de funcionarem
como unidades iniciadoras de outras substâncias vegetais, como os flavonoides (VICKERY;
VCKERY, 1981).

A família Anacardiaceae está representada principalmente pelos gêneros Anacardium,


Lithaea, Schinus e Tapirira. Na América Tropical o gênero Tapirira é representado por
Tapirira guianensis, que produz um óleo aromático (WATSON; DALLWITZ, 1992). No
Brasil conhecem-se aproximadamente 40 espécies (CRONQUIST, 1981; RAVEN; EVERT;
EICHHORN, 2004). O gênero Anacardium apresenta um pequeno número de espécies, todas
elas originárias da América Central e do Sul, à exceção de Anacardium encardium,
provavelmente procedente da Malásia. A espécie mais importante é Anacardium occidentale,
por ser a única cultivada em escala comercial e apresentar o maior grau de dispersão em todo
o mundo (WATSON; DALLWITZ, 1992).

2.4.1. Anacardium occidentale L. (Cajueiro)

O cajúeiro (Anacardium occidentale L.) é uma árvore de aparência singular, troncos


tortuosos, folhas glabras, flores masculinas e hermafroditas e fruto reniforme representando
uma cultura perene. Da árvore pode ser obtido um conjunto de produtos, dentre os quais o
principal é a castanha de cajú, de onde se extrai a amêndoa da castanha de cajú, utilizada
como alimento humano em formas variadas.
Natália de Freitas Oliveira Página 41

Ainda da casca dos galhos podados da árvore, da folha, da película da amêndoa da


castanha de cajú, ou mesmo do bagaço do pedúnculo, podem ser extraídos polifenois de
origem vegetal, composto químico com vastas aplicações industriais, como na substituição do
cromo no curtimento de couro. Porém, a sua tecnologia de extração não é amplamente
acessível. Historicamente é uma planta nativa do Brasil, isto de acordo com a mais antiga
referência conhecida sobre a planta, à ilustração feita pelo monge naturalista francês André
Thevet (1502-1590) em seu livro intitulado “Singularidades da França Antártica” (Les
singularitez de la France Antartique), em 1557, escrito após sua passagem pela costa do
Nordeste e Norte do Brasil, representado na figura 2.11 (ALVES, 2013; THEVET, 1557).

FIGURA 2.11 - Primeiro registro oficial do gênero Anacardium, colheita de frutos de


um cajueiro.

Fonte: GARCIA, 2009.

Atualmente, a planta está disseminada em diversos países como Índia, Moçambique,


Tanzânia, Quênia e mais recentemente Vietnã, Indonésia e Tailândia. No Brasil, ocorre um
amplo domínio dos Estados do Nordeste, que concentram praticamente 100% da produção da
castanha de cajú, com destaque para o Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte, de acordo com o
IBGE (Figura 2.12).
Natália de Freitas Oliveira Página 42

FIGURA 2.12 - Disseminação do Anacardium occidentale.

Fonte: ORWA, 2009.

Segundo o IBGE, o Brasil tem uma área colhida próxima a 775 mil hectares,
praticamente sem alteração nos últimos 10 anos, cuja produção vem oscilando em torno de
276 mil toneladas por ano, mas no ano de 2011 sua safra atingiu o recorde de 299 mil
toneladas de castanha de cajú.

Seu pedúnculo superdesenvolvido e muito apreciado pela suculência é frequentemente


confundido com o fruto, quando na verdade se trata do pseudofruto, cientificamente
denominado de pedúnculo floral, com coloração variante entre o amarelo e o vermelho
(Figura 2.13). Este proporciona a obtenção de inúmeros produtos. No ramo de bebidas, por
exemplo, destacam-se a cajúína, o suco integral, néctares, vinhos, licores, refrigerantes,
aguardente, champanha, entre outros. No fabrico de doces, diferentes modalidades são
produzidas: em massa, em calda, seco, tipo ameixa, etc (DANTAS; LEAL; OLIVEIRA,
2015).

FIGURA 2.13 - Anacardium occidentale L. (Cajú e castanha).

Fonte: www.wikipedia/cajú/cajúeiro
Natália de Freitas Oliveira Página 43

Seu fruto verdadeiro é a castanha de cajú, de onde se extrai o principal produto de


consumo, a amêndoa, que pode atingir até 2 cm de comprimento. O cardol, popularmente
conhecido como LCC (líquido da castanha de cajú), extraído da castanha por pirólise
(queima) ou prensagem, é utilizado na produção de solventes e vermífugos. Entretanto, o
mercado desses produtos encontra-se basicamente restrito ao plano interno, mais
especificamente, regional (DANTAS; LEAL; OLIVEIRA, 2015).
2.4.1.1.Castanha de cajú

A castanha é constituída de três partes: casca, película e amêndoa O peso de uma


castanha pode variar desde 2g até 30g. A maioria das castanhas que chegam às indústrias
apresenta um peso médio em torno de 7,0g. Suas partes são descritas na figura 2.14 a seguir:

FIGURA 2.14 - Corte transversal na castanha de cajú.

Fonte: MAZZETO; LOMONACO; MELE, 2009.

a) A casca, que representa de 65% a 70% do peso da castanha, é constituída por um


epicarpo coriáceo, atravessado por um mesocarpo esponjoso, cujos alvéolos são
preenchidos por um líquido cáustico e inflamável - o LCC (líquido da casca da
castanha) (PAIVA; GARRUTTI; SILVA NETO, 2000);
b) A película, ou tegumento da amêndoa, que representa cerca de 3% do peso da
castanha, é rica em tanino (LIMA, 2009);
c) A amêndoa, que é a parte comestível da castanha, formada por dois cotilédones de cor
marfim, representa cerca de 28% a 30% do seu peso, porém no processo industrial o
rendimento médio é de 50-55% (ANDRADE NETO, 2006).
Natália de Freitas Oliveira Página 44

Quanto ao processamento da castanha para extração da amêndoa, podem ser


identificados dois modelos com diferenças substancias na quebra da casca da castanha
(tecnicamente denominada de decorticação): o mecanizado tradicional e o das minifábricas.
Enquanto no processo tradicional as castanhas com casca são cozidas no seu próprio líquido
(LCC), depois ressecadas para serem submetidas ao processo de retirada da casca por
impacto, nas minifábricas as castanhas são autoclavadas (cozinhadas no vapor), estufadas e
depois seguem para a quebra semi-manual da casca, que também pode ser automatizada
(Figura 2.15).

FIGURA 2.15 – Esquema do beneficiamento da castanha de cajú.

CASTANHA DE CAJÚ

LIMPEZA
SECAGEM
CLASSIFICAÇÃO

ARMAZENAGEM

COZIMENTO
RESFRIAMENTO/SECAGEM
CORTE
DESPELICULAGEM
SELEÇÃO
FRITURA
EMBALAGEM
AMENDOA FRITA

Fonte: DANTAS; LEAL; OLIVEIRA, 2015.

O custo de processamento maior obtido pelo sistema das minifábricas no Brasil, US$
30 por caixa de 50 libras de amêndoa da castanha de cajú, em comparação com US$ 20 por
caixa nos grandes processadores mecanizados, é compensado pelo maior rendimento de
amêndoas inteiras, 75-85% para as minifábricas versus 50 - 55% para os grandes
processadores, e a maior alvura e o melhor sabor das amêndoas, que implicam um maior
preço para o mix resultante e maior margem para o processador (DANTAS; LEAL;
OLIVEIRA, 2015).
Natália de Freitas Oliveira Página 45

O LCC é constituído por um liquido marrom escuro, viscoso, acre e cáustico rico em
compostos fenólicos (ácido anacárdio, cardol, cardonol e 2-metilcardol) (ANDRADE et al.,
2011; PATEL; BANDYOPADHYAY; GANESH, 2006; RÍOS et al., 2009).

2.4.1.1.1. Beneficiamento da castanha de cajú

O beneficiamento da castanha de cajú tem como finalidade obter amêndoas inteiras,


totalmente despeliculadas, de cor branco-marfim, sem manchas e de bom tamanho. Seu
processamento pode ser mecanizado, semimecanizado e artesanal. O processo artesanal de
beneficiamento da castanha ainda é muito adotado em pequenas propriedades no interior do
Nordeste, principalmente no Piauí e Bahia. Em outros países (África, Índia, Sri Lanka e
Vietnã) utiliza-se também este processo devido à disponibilidade de mão de obra barata e
também por seu maior rendimento de castanhas inteiras, em torno de 85-95% (FAO, 2015).
Este processo apresenta vários inconvenientes, principalmente das condições precárias de
higiene do ambiente utilizado, que na maioria dos casos são realizados em beira de estradas e
outros locais inadequados (GUALBERTO FILHO; FIGUEREDO, 1997).

A indústria brasileira da produção de castanha é composta por 4 indústrias


processadoras e com capacidade de processar cerca de 90% da produção brasileira (LIMA;
GARRUTI; BRUNO, 2012), e o segmento semi mecanizado, formado por mais de cem mini
fábricas, com capacidade de processar 20 mil toneladas por ano (PAIVA et al., 2006).

2.4.1.1.2. Processo de separação da amêndoa e do tegumento a partir da castanha de


cajú

O beneficiamento é iniciado com a chegada das castanhas na indústria em caminhões,


acondicionadas em sacos de aniagem ou a granel. Na recepção, os lotes de castanhas são
pesados, sendo retiradas as amostras para a determinação de umidade (Figura 2.16) Como a
safra do cajú é curta, a fábrica precisa formar estoques para que possa trabalhar o ano todo
(PAIVA; GARRUTTI; SILVA NETO, 2000).
Natália de Freitas Oliveira Página 46

FIGURA 2.16 - Local de armazenagem da castanha de cajú na Unidade de Beneficiamento de


Macaíba/RN.

Fonte: Autora.

A secagem é feita por exposição à luz solar, em piso cimentado e coberto com telhas
de fibra de vidro (Figura 2.17). As castanhas são constantemente misturadas, para a redução
da umidade (variando entre 7 a 10%), evitando, assim, problemas de deterioração,
principalmente por fungos, durante a estocagem. Além da retirada da umidade, a exposição
solar, segundo Russel (1969), provoca a maturação da castanha pela atuação de raios
infravermelho e ultravioleta. As castanhas permanecem na secagem por um período que pode
alcançar até sete dias e, após uma prévia limpeza (em peneiras vibratórias ou chapas
perfuradas), é efetuada a classificação por tamanho (geralmente feita em cilindros horizontais
rotativos ou em peneiras de malhas de arame perfurados com diversos calibres) (Figura 2.18).
Este procedimento visa uma padronização da castanha, permitindo uma maior uniformidade
tanto no processamento quanto no rendimento industrial (LIMA, 2009).
FIGURA 2.17 - Local usado para a secagem da castanha.

Fonte: Autora.
Natália de Freitas Oliveira Página 47

FIGURA 2.18 - Peneiras vibratórias para a classificação da castanha.

Fonte: Autora.

A castanha, depois de seca, limpa e classificada, pode ser armazenada por mais de um
ano. O armazenamento em sacos é mais recomendável, devendo estes ser empilhados sobre
estrados, em local arejado, limpo e seco, e sobre piso impermeabilizado (JAIN; KUMAR,
1997; PAIVA et al., 2006).

Em seguida, as castanhas são lavadas e submetidas à reidratação ou umidificação,


sendo colocadas em silos, onde ficam imersas em água, por um período que varia de 140 a
330 minutos, de acordo com a classificação por tamanho (SOARES, 1986). A umidificação é
realizada através de jatos de água alternando com períodos de repouso, em que as castanhas
ficam cobertas com sacos de aniagem molhados. A umidificação evita que o LCC quente
penetre na amêndoa, queimando-a e provocando sabor desagradável, prejudicando a
qualidade do produto (LIMA, 2009).

Como preparação para o corte, as castanhas devem ser submetidas a uma etapa de
cozimento, que pode ser feita em autoclave a 110ºC/10 min (Figura 2.19), ou em caldeirão
Natália de Freitas Oliveira Página 48

comum, por aproximadamente 30 minutos. Esse último sistema consiste de um caldeirão


simples, aberto (sem pressão), colocado sobre uma fogueira, no qual se dispõe uma camada de
água (INAMASU; BISCEGLI; PAIVA, 2006).
As castanhas são acondicionadas em saco, para facilitar a carga/ descarga. Elas ficam
isoladas da água por meio de uma chapa perfurada, apoiada sobre armação de metal, de modo
que somente o vapor da água entra em contato com as castanhas (AZAM-ALI; JUDGE,
2001).
FIGURA 2.19 - Autoclave usada no cozimento das castanhas.

Fonte: Autora.

Após a umidificação ocorre a etapa de cozimento da castanha, na qual é extraído o


primeiro produto nobre do processo de beneficiamento, o LCC. A castanha é imersa em LCC
aquecido a uma temperatura de aproximadamente 210°C (Figura 2.20). O LCC contido na
casca da castanha é então arrastado pelo LCC aquecido juntamente com a água absorvida na
umidificação.

FIGURA 2.20 - Caldeiras usadas para o cozimento em LCC.

Fonte: Autora.
Natália de Freitas Oliveira Página 49

Elas então são cozidas e antes da retirada da casca (decorticação), as castanhas são
resfriadas, classificadas novamente por tamanho e armazenadas por aproximadamente 12
horas, visando um melhor rendimento na etapa de decorticação.

O descasque ou decorticagem pode ser realizada por centrifugação (processo


“Stutervant”) ou por corte (processo “Oltremare”), demonstrado na figura 2.21. O processo de
centrifugação consiste em um decorticador baseado na força centrífuga, seus discos
arremessam as castanhas contra as paredes do equipamento, fazendo com que o produto caia
em um recipiente perfurado em formato de um cone levando-o a uma esteira, em que se efetua
a separação. Já na decorticagem por corte, as castanhas passam automaticamente através de
máquinas, onde são cortadas com lâminas ou serras (LIMA, 2009).

FIGURA 2.21 - Processo semimecanizado da extração da castanha por meio de um


decorticador.

Fonte: Autora.

Seguido do descasque, a secagem tem a finalidade de reduzir a umidade da amêndoa


até 2,5%-4,0%, para que o tegumento, até então firmemente a ela aderido, torne-se
quebradiço, facilitando a sua soltura. A secagem realiza-se em estufas com circulação de ar
Natália de Freitas Oliveira Página 50

quente (60 °C a 80 °C), por um período de 6 a 8 horas. As castanhas são colocadas em


bandejas teladas e devem ser aquecidas, de modo que a tegumento se solte por igual (Figura
2.21). Em muitos casos, a amêndoa é submetida a um processo de umidificação por vapor
saturado (1 a 2 minutos), que facilita a separação do tegumento da amêndoa (AZAM-ALI,
JUDGE, 2001).

O resfriamento da amêndoa, que pode ser feito sobre mesas ou nas próprias bandejas,
em suportes apropriados, por cerca de duas horas à temperatura ambiente, tem como objetivo
preparar o produto para a retirada do tegumento (Figura 2.22).

FIGURA 2.22 – Telas e caixas usadas na secagem e resfriamento das castanhas.

Fonte: Autora.

Com a desidratação, as amêndoas tendem a se contrair e o tegumento torna-se


quebradiço, aderindo fracamente à amêndoa. Aproveitando-se destas características físicas
especiais, procede-se a despeliculagem, que consiste na remoção do tegumento que envolve a
amêndoa, mediante injeção de ar comprimido, que atritando as amêndoas, faz com que haja o
desprendimento ou a quebra do tegumento ou por um cilindro despeliculador provido de
escovas ou cilindro rotativo elétrico (TROPICAL; FRUTICULTURA, 2003).

A despeliculagem com o uso de um cilindro rotativo acionado por motor elétrico de


baixa rotação consiste em submeter às amêndoas ao atrito em uma tela perfurada,
promovendo a liberação parcial do tegumento. Já na despeliculagem com cilindro
despeliculador provido de escovas, as amêndoas são colocadas em uma mesa de madeira ou
chapa galvanizada dotada com tela de metal, onde as mesmas são submetidas ao atrito através
das escovas de cerdas até a obtenção da amêndoa parcialmente sem tegumento. Em qualquer
uma destas operações pode-se obter até 70% de amêndoas totalmente sem tegumento, sendo o
Natália de Freitas Oliveira Página 51

restante submetido ao processo de raspagem manual com auxílio de facas de despeliculagem


(Figura 2.23). Esta operação em muitas fábricas é descentralizada e feita por mulheres
(PAIVA et al., 2006).
FIGURA 2.23 - Processo de despeliculagem manual para a separação da castanha e o
tegumento.

Fonte: Autora.

Após a despeliculagem, faz-se a reidratação da amêndoa, que devido ao seu baixo teor
de umidade, de 2,5 a 3,0%, torna-se muito quebradiça, sujeita a quebra em cada manuseio,
assim a amêndoa terá uma umidade final em torno de 5% (FERRAZ et al., 2005).

Após a seleção, ainda cruas, as amêndoas são classificadas em duas etapas. A primeira
por processo eletrônico, que utiliza máquinas pneumáticas que separam as amêndoas em
inteiras, pedaços e bandas. A segunda etapa é realizada por processo manual considerando-se
os tipos das amêndoas segundo a cor, tamanhos e integridade, assim classificadas em 30
diferentes combinações de tamanho e cor, conforme demonstrado na figura 2.24, no qual
observa-se que o número de classificações irá depender da unidade fabril. Parte das amêndoas
cruas é embalada e comercializada, outra parte é encaminhada para o setor de torragem
(LIMA; GARCIA; LIMA, 2004).
Natália de Freitas Oliveira Página 52
Natália de Freitas Oliveira Página 53

FIGURA 2.24 - Classificação das castanhas na Unidade de Beneficiamento da


Castanha de Cajú de Macaíba/RN.

Fonte: Autora.

Se for de interesse comercializar as amêndoas fritas, deve-se proceder à fritura das


amêndoas já separadas por tamanho, para permitir uma fritura uniforme. O equipamento pode
ser o mesmo utilizado para batata frita, a gás, com controle de temperatura. O óleo deve ser de
boa qualidade, com recomendação de uso de gordura hidrogenada, para não conferir sabor
estranho à amêndoa, sendo os óleos de milho ou de soja mais utilizados (PAIVA et al., 2006).

2.4.1.2.Tegumento da castanha de cajú (TCC)

O tegumento da castanha de cajú representa uma fina camada protetora da castanha


(Figura 2.25), correspondendo a 3% do seu peso (LIMA, 2009). Foi utilizado inicialmente
para manter o funcionamento de caldeiras, extração do LCC e alimentação do gado
(HURTADO, 1986). Até hoje estas são as aplicações mais comuns. A atividade fenólica do
tegumento foi observada por vários autores, abrindo portas para os mais diversos estudos de
aplicabilidades de taninos, destacando-se a fabricação de vernizes elaborados a partir de
resinas obtidas dos extratos tânicos do tegumento (VINOD KUMAR; SETHURAMAN,
2004). O tegumento de castanha de cajú constitui um problema ambiental para as regiões
produtoras (MOHOD; KHANDETOD; POWAR, 2008).
Natália de Freitas Oliveira Página 54

FIGURA 2.25 - Castanha de cajú com o tegumento.

Fonte: www.pirabay.com

2.4.1.2.1. Composição química do TCC

Centenas ou milhares de constituintes químicos podem estar presentes em tecidos


vegetais, embora, em grande parte, ocorram em concentrações irrisórias. Mesmo sob estas
condições, vários destes constituintes são responsáveis por características como cor, aroma e
sabor, além dos efeitos nutricionais e nutracêuticos (BISHOP, 2007; MORAES, 2007;
GRANGEIA et al., 2011).

Muitos constituintes químicos foram identificados no tegumento da castanha de cajú,


destacando-se os que pertencem as seguintes classes: flavonóides, terpenóides (presentes em
óleos essenciais), catequinas, epicatequinas, taninos e esteróis. Os compostos fenólicos estão
relacionados por vários autores como os principais responsáveis pela atividade farmacológica
(ANDREESCU; SADIK, 2004; ASHIDATE et al., 2005; CALDERON-MONTANO et al.,
2011; IVANOVA et al., 2005; KWON et al., 2007; LAUGHTON et al., 1991; QUETTIER-
DELEU et al., 2000; SADIK; SIES; SCHEWE, 2003; WOJDYŁO; OSZMIAŃSKI;
CZEMERYS, 2007).

Estudos recentes feitos por Donkoh et al. (2012) tiveram como objetivo determinar a
composição mineral do tegumento da castanha de cajú e comprovou-se que o TCC continha
mais proteínas, fibras, cálcio, magnésio, fósforo e potássio, mas com menos energia em
comparação com os valores relatados para o milho (Tabela 2.2).
Natália de Freitas Oliveira Página 55

TABELA 2.2 - Composição físico-química e mineral do tegumento da castanha de cajú.


Análises TCC (g/Kg) Milho (g/Kg)
Massa seca (MS) 905 890
Proteína bruta 190 88
Fibra bruta 103 22
Extrato etéreo 20,1 38
Cinzas 20,2 13
Cálcio 5,6 0,2
Fosforo 1,9 2,8
Magnésio 5,8 1,2
Taninos 1,8 --
Energia metabolizável 7,12 14,02
Fonte: DONKOH et al., 2012.

2.4.1.2.2. Metabólitos derivados do ácido graxo presentes no TCC

O ácido graxo é um metabólito essencial para o reino vegetal e animal. É derivado de


uma rota biosintética do acilpolimalonato, originando longas cadeias carbonadas. Sua
desidrogenação e/ou oxidação podem dar origem a compostos heterocíclicos, como
triglicerídeos e lipídeos (SIMÕES et al., 2008).

O tegumento da castanha de cajú apresenta um elevado teor de extrato etéreo (Tabela


2.2) despertando interesse na elucidação da sua composição lipídica, estudada por diversos
autores (TROX et al., 2010). Os principais ácidos graxos encontrados no tegumento são:
ácido esteárico, oleico, linoleico, linolênico e palmítico (Tabela 2.3).

A análise da tabela 2.3 permite a comparação dos dois métodos realizados por Maia e
Stull, (1977) e Trox et al. (2011), usando como solventes de extração
clorofórmio/metanol/água e acetato de etila/hexano, respectivamente.
Natália de Freitas Oliveira Página 56

TABELA 2.3 - Composição de ácidos graxos de lipídios extraídos do TCC.


Ácidos graxos MAIA e STULL (1977) TROX, et al. (2011) (g/kg)
(%)
Ácido láurico (C12: 0) 0,2 -
Ácido mirístico (C14: 0) 0,3 -
Ácido fisetérico (C14: 1) 0,4 -
Ácido palmítico (C16: 0) 16,4 -
Ácido palmitoleíco (C16: 1) 1,1 -
Ácido hexadecodienóico (C16: 2) 1,4 -
Ácido esteárico (C18: 0) 6,4 40,9± 6,3
Ácido oleico (C18: 1) 35,3 214±33,2
Ácido linoleico (C18: 2) 30,4 68,6± 10
Ácido linolênico (C18: 3) 5,8 -
Ácido gadoleíco (C20: 1) 1,6 -
Ácido eicosadienóico (C20: 2) 0,8 -

Uma das vantagens do método adotado por Maia e Stull (1977) é a formação de um
sistema bifásico a partir das proporções de solventes adicionados durante o processo de
extração, apoiado na teoria do equilíbrio líquido-líquido de três componentes
(clorofórmio/metanol/água). A metodologia usada por Trox et al. (2010) seguiu o método
de Thurnhofer, Lehnert e Vetter (2008), que analisa os ácidos esteárico, ácido oleico e ácido
linoleico, por serem de maior importância na caracterização de extratos e óleos. Diferente do
método adotado por Maia e Stull (1977), os autores buscaram solventes como acetato de etila
e hexano, em substituição ao clorofórmio. A análise por cromatografia gasosa foi acoplada a
espectros de massas com os ácidos analisados padronizados. O uso desta metodologia teve
como vantagem a quantificação exata dos ácidos graxos presentes no tegumento.

2.4.1.2.3. Metabólitos secundários presentes no tegumento


Os metabólitos secundários são responsáveis pela manutenção do funcionamento da
planta, ou seja, a sua interação com o meio ambiente no qual se encontra. Geralmente
possuem uma estrutura complexa, baixo peso molecular e marcantes atividades biológicas,
atuando como contra-ataques de patógenos, proteção microbiana, ação herbívora. Apresentam
resistência a situações de stress em geral, como a deficiência de nutrientes, salinização,
escassez de água e elevada exposição à radiação UV, que intensificam a produção de
compostos mais polares (DIXON, 1999; PERES, 2004; SIMÕES et al., 2008). Os metabólitos
secundários são divididos em três principais classes: Compostos fenólicos (fenóis, ácidos
fenólicos, cumarinas, flanonóides, taninos e ligninas); terpenos (carotenos, esteroides,
polisoprenos, saponinas e triterpenos) e alcalóides (compostos nitrogenados) (NACZK;
SHAHIDI, 2004; PERES, 2004).
Natália de Freitas Oliveira Página 57

Autores como Kannnan et al. (2009) e Tedong et al. (2006) identificaram as classes de
metabólitos secundários alcalóides, polifenóis e saponinas na castanha de cajú (Tabela 2.4).
Trox et al. (2011), em seus estudos com o tegumento (TCC), ressaltou que os constituintes
fenólicos que se destacam são os taninos hidrolisados com protoantocianidinas poliméricas.

TABELA 2.4 - Perfil químico do TCC usando diferentes solventes.


Solvente
Fitoquímico
Etanol Acetato de etila Acetona
Alcalóides - - -
Carboidratos - + +
Esteroides - - -
Fenólicos + + +
Flavonóides - - +
Glicosídeos - - -
Óleos voláteis + + +
Triterpenóides + - +
Xantoproteínas - + +
Fonte: KANNAN et al., 2009.
Os compostos naturais apresentam diferentes comportamentos de solubilidade, que
depende da natureza química dos diversos grupos funcionais presentes e que podem variar
desde substâncias simples até altamente polimerizadas. Além disso, também há a
possibilidade de interação entre as várias classes de compostos, tais como carboidratos e
proteínas. Estas podem chegar a formar complexos insolúveis, comprometendo, assim, a
confiabilidade dos dados obtidos. Deste modo, é improvável o desenvolvimento de um único
procedimento de extração, capaz de recuperar todos os compostos presentes na amostra,
limitando-se a uma fração desses compostos, solúvel no solvente utilizado (BENAVENTE-
GARCÍA et al., 2000; SOONG; BARLOW, 2004; ROCKENBACH et al., 2008). Este fato
explica a diferença dos resultados da tabela 2.4, no qual os extratos etanólicos do TCC
resultaram na presença de vários compostos fitoquímicos como triterpenóides, compostos
fenólicos e óleos voláteis; o extrato com acetato de etila exibiu uma combinação diferente de
fitoquímicos, sendo estes fenóis, óleos voláteis, xantoproteinas e carboidratos; e o extrato
contendo a acetona se mostrou eficaz na dissolução de triterpenóides, fenólicos, óleos
voláteis, flavonóides, xantoproteinas e carboidratos (KANNAN et al., 2009).
Natália de Freitas Oliveira Página 58

Compostos Fenólicos

Hartley et al. (1990), relata que as camadas externas, tais como cascas, conchas e
tegumentos de materiais vegetais contêm alto teor de compostos fenólicos, que atuam na
defesa ao ataque de patógenos, parasitas e predadores, além de contribuir para a variedade de
cores encontradas nas plantas. Estudos posteriores demonstraram que a avaliação do teor de
compostos fenólicos existentes no TCC depende do método de extração e do tipo de extrato.
Em extratos etanólicos, Chaves et al. (2010) observou que a concentração de fenólicos totais
existentes do tegumento é de aproximadamente 185,44mg/EAG. Já Kamath e Rajini (2007),
ao analisar a quantidade de fenolicos, notou que o tegumento apresentou um conteúdo
fenólico total maior (243 mg/ EAG), conforme a tabela 2.5.
Estudos realizados com extratos etanólicos desengordurados do TCC realizado por
Chandrasekara, Shahidi e Fereidoon (2011) mostraram diferentes comportamentos com a
variação de temperatura, evidenciando que sua elevação resultava em um aumento no teor de
fenólicos, tendo 790,9 mg/EAG em seu ponto máximo, enquanto que a baixas temperaturas
houve a diminuição do teor de fenólicos (701,2mg/EAG). A explicação para esta variação é
consequência da libertação de compostos fenólicos conjugados durante o tratamento térmico e
a produção de produtos da reação de Maillard (HAYASE et al., 1990; JEONG et al., 2004;
ŞAHIN et al., 2009).
Em outro estudo, Chandrasekara e Shahidi (2011) analisaram os rendimentos do teor
fenólico solúvel e conjugado nos extratos etanólicos do tegumento bruto, quando submetidos
a baixas e altas temperaturas. Os maiores rendimentos dos extratos fenólicos foram de 44,2 ±
1,4 g/100 g de farinha desengordurada e seu teor de fenólicos totais foi de 347,99 ± 6,88 g/g
de farinha desengordurada, no qual o TCC foi submetido a temperatura de 130 ° C durante 33
min (Tabela 2.5).
Natália de Freitas Oliveira Página 59

TABELA 2.5 - Teor de compostos fenólicos totais do TCC submetidos a diferentes métodos.
Extrato Tratamento Compostos fenólicos Referência
submetido totais (CFT)
Etanólico Shaker 37°C/3h 243 mg /g EAG KAMATH; RAJINI, 2007
Etanólico Temperatura ambiente 185,44±12,04 mg /g EAG CHAVES et al., 2010
Etanólico (80%) CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
Desengordurado 656,2±23,0 mg /g EAG
FEREIDOON, 2011
Etanólico (80%) Desengordurado CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
701,2 ± 21,1 mg /g EAG
70ºC/ 6h FEREIDOON, 2011
Etanólico (80%) Desengordurado CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
790,9±15,4 mg /g EAG
130°C/33min FEREIDOON, 2011
Etanólico (80%) CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
Desengordurado 269,05±9,77 mg EAG/g
2011
Etanólico (80%) Desengordurado CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
308,5±6,88 mg EAG/g
70ºC/ 6h 2011
Etanólico (80%) Desengordurado CHANDRASEKARA; SHAHIDI,
347,51±9,35 mg EAG/g
130°C/33min 2011

Vários compostos fenólicos já foram encontrados no TCC, tais como taninos,


flavonoides, catequinas e epicatequinas e em menores proporções os ácidos fenólicos
(siringico, gálico e cumárico). Estudos feitos por Chandrasekara e Shahidi (2011a)
ressaltaram que os valores destes ácidos em condições extremas podem chegar a 0,974 ±
0,030; 5,705 ± 0,001 e 0,693 ± 0,043mg/g MS desengordurada (Tabela 2.5). Estes ácidos também
se encontram presentes em outras nozes e em seus tegumentos, como a amêndoa, pinho e
avelã (COLARIC et al., 2005; WIJERATNE; AMAROWICZ; SHAHIDI, 2006; SHAHIDI;
ALASALVAR; LIYANA-PATHIRANA, 2007b).

Taninos

Os taninos do tegumento da castanha de cajú já vem sendo intensamente estudados ao


longo dos anos, como fonte de taninos hidrolisáveis. A estimativa quantitativa de taninos no
TCC mostra que do percentual de 82,5% de polifenóis totais, 80% são taninos, enquanto o
restante são constituintes fenólicos ( PILAI et al. , 1963; VINOD KUMAR; SETHURAMAN,
2004). Estudos mais recentes elucidaram e identificaram os taninos mais presentes no
tegumento, indicando a presença de procianidina como o principal constituinte (VINOD
KUMAR; SETHURAMAN, 2004).

Catequinas

As catequinas são pertencentes ao grupo dos flavonóides da classe dos flavanois.


Apresentam um esqueleto básico do fenilbenzopirano, sem a carbonila no carbono 4 e sem
insaturação na ligação do carbono 2 e 3 (Figura 2.26) (NEIVA et al., 2003; SIMÕES, 2008).
Catequinas têm efeitos benéficos sobre a saúde humana, (+)-catequina e (-)-epicatequina tem
Natália de Freitas Oliveira Página 60

recebido recentemente muita atenção como agentes protetores contra doenças


cardiovasculares e câncer (DUBEY et al., 2002; KIM et al., 2003).

O conteúdo de catequina, epicatequina, epigalocatequina encontrado nas amostras


desengorduradas do tegumento da castanha de cajú foram 47,28; 28,29 e 2,0 mg/g,
respectivamente (CHANDRASEKARA; SHAHIDI, 2011).

Trox et al. (2010), ao analisar o extrato do tegumento da castanha de cajú observou


que a análise por HPLC/MS do extrato fenólico revelou dois picos proeminentes com
máximos de absorção em 278 nm.

Chaves et al. (2010) relatou também a presença de catequinas e epicatequinas no


tegumento, através de análises dos espectros de RMN sob frações isoladas do fracionamento
por meio de coluna cromatografica em silica gel na fase acetato de etila.

FIGURA 2.26 - Estruturas da (+)-catequina e (-)-epicatequina isoladas no TCC.

Fonte: DANTAS; LEAL; OLIVEIRA, 2015.

2.4.1.2.4. Outros metabólitos encontrados no TCC

A exposição a radicais livres, provenientes de diversas fontes, leva o organismo a


desenvolver mecanismos de defesa (defesas endógenas) para eliminar estes radicais livres
(CADENAS, 1997; FERREIRA et al. 2007). Estas defesas endógenas podem ser enzimáticas
ou não enzimáticas. As defesas antioxidantes enzimáticas são em grande número e
encontram-se espalhadas por todo o organismo, tanto no meio intracelular como no meio
extracelular. Exemplo destas defesas são a superóxido dismutase, a catalase, a glutationa
peroxidase, a glutationa redutase, entre outras. Entre as defesas antioxidantes não enzimáticas
destacam-se compostos como a glutationa, o γ-tocoferol (vitamina E), o ácido ascórbico
(vitamina C), o ácido lipóico, os carotenóides, entre outros (VALKO et al., 2007; FERREIRA
et al., 2007).
Natália de Freitas Oliveira Página 61

Trox et al. (2010) avaliou os índices destes compostos no TCC e notou a presença em
quantidades superiores aos encontrados na amêndoa da castanha (Tabela 2.6). A presença de
tais quantidades elevadas dos carotenoides (β-caroteno, luteína e α-zeaxantina) no tegumento
é de grande importância para a germinação da castanha, protegendo-a de insetos, infecção
microbiana e luz solar, por meio do invólucro. Após a quebra da casca, a função de proteção
de antioxidantes contidos no tegumento é ativada (CHUNG et al., 1998). Além disso, os
carotenóides são também conhecidos por desempenharem um papel importante na prevenção
do câncer e ateorosclerose (KRINSKY; JOHNSON, 2005).

TABELA 2.6 – Teor de carotenóides, tocoferóis e tiamina no tegumento da castanha de cajú.


Compostos bioativos Concentração (mg/KgMS)
β-caroteno 218 ± 11,8
Luteína 525 ± 45,2
α- zeaxantina 7,0 ± 2,2
α-tocoferol 10,1 ± 0,7
γ-tocoferol 10,6 ± 0,6
Tiamina 3,0 ± 0,5
Os valores são médias ± desvio padrão de 10 determinações separadas (n = 10).
Fonte: TROX et al., 2010

2.4.1.2.5. Atividade antioxidante do TCC

Pesquisas envolvendo compostos antioxidantes oriundos de fontes naturais, como


extratos de plantas e seus componentes, têm sido extensivamente revisadas. Isto inclui
diferentes órgãos, tais como sementes (soja, amendoim, algodão, mostarda, canola, arroz e
sementes de gergelim), frutas (uva, frutas cítricas, pimenta e azeite), folhas (chá verde,
alecrim, tomilho e orégano) e outros (cebola, batata e aveia) (CHAVE et al., 1992). Estas
pesquisas têm sido desenvolvidas em diferentes centros de estudos visando a sua aplicação
tanto em alimentos quanto em organismos animais e industrias (DANTAS; LEAL;
OLIVEIRA, 2015).

O especial interesse acerca dos antioxidantes naturais, sobretudo aqueles encontrados


em alimentos corriqueiramente presentes na dieta da população, reside na possibilidade de
que doenças como câncer, arteriosclerose, artrite, diabetes, doenças cardiovasculares e
processos responsáveis pelo envelhecimento do corpo estejam ligados à presença de ROS
(reactive oxygen species) no organismo (BRENNA; PAGLIARINI, 2001; YILDRIN; MAVI;
KARA, 2001). Estudos indicam que determinados compostos bioativos presentes
Natália de Freitas Oliveira Página 62

naturalmente em alimentos possam inibir esses processos, a partir de suas qualidades como
antioxidantes naturais (ZAMORA-RES; LEON; HIDALGO, 2010).

Diversos estudos e diferentes metodologias foram aplicadas sobre o tegumento da


castanha de cajú para a medição da sua atividade antioxidante, como o DPPH (2,2-difenil-1-
picril-hidrazil), co-oxidação do β-caroteno/ácido linoleico, ABTS (2,2'-azino-bis 3-
etilbenzotiazolina-6-sulfônico), ORAC (Sequestro do radical peroxil), sequestro do peróxido
de hidrogênio (H2O2), sequestro do radical hidroxil-deoxirribose, inibição da oxidação de
LDL (Inibição da peroxidação lipídica), FRAP (parâmetro antioxidante do íon férrico
reduzido) e o RANCIMAT (DANTAS; LEAL; OLIVEIRA, 2015).

Kamath e Rajini (2007) procuraram avaliar a atividade antioxidante do tegumento da


castanha de cajú em um conjunto de sistemas de métodos diferentes de análise de
antioxidantes. Pelo método ABTS a atividade antioxidante foi medida através da descoloração
+
em relação a concentração do radical ABTS e ao extrato do tegumento e um antioxidante
sintético, BHA (2,3-terc-butil-4-metil-metoxifenol), fazendo uma comparação entre os
mesmos. Seu potencial foi também medido pelos métodos: sequestro do peróxido de
hidrogênio (H2O2), sequestro do radical hidroxil-deoxirribose, LDL e FRAP (Tabela 2.7).

TABELA 2.7 - Atividade antioxidante do TCC sob diferentes métodos.


Método da atividade antioxidante EC 50 (μg/mL)
ABTS 1,30±0,02
FRAP 6000±0,24
LDL 24,66±0,32
Sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2) 10,69±1,13
Sequestro do radical hidroxil-deoxirribose 17,70±0,05
Fonte: KAMATH; RAJINI, 2007

Os resultados estão expressos em EC50 (mg.mL–1 ), que corresponde à quantidade de


extrato necessária para reduzir o radical DPPH em 50%; assim, quanto menor o EC 50, melhor
é a capacidade antioxidante do extrato. A partir dos dados obtidos em diferentes ensaios é
evidente que a ordem de eficácia do TCC é: ABTS> superóxido> desoxirribose> LDL>
FRAP (Tabela 2.7). Assim, concluiu-se que o extrato do tegumento é um antioxidante mais
potente que o redutor férrico.

Outros autores, como Chaves et al. (2008), investigaram o potencial dos extratos
etanólicos do tegumento da castanha para sequestrar o radical DPPH. Os resultados obtidos,
Natália de Freitas Oliveira Página 63

expressos por meio da porcentagem de atividade antioxidante, foram analisados nas


concentrações de 25 a 250 µg/mL, no qual o tegumento teve variações de 12-40% de inibição.

Por os ácidos e compostos fenólicos presentes em vegetais apresentarem uma elevada


atividade antioxidante (PRADEEP; GUHA, 2011; WIJERATHNE; AMAROWICZ;
SHAHIDI, 2006), autores como Shahidi e Chandrasekara (2011b) procuraram avaliar a
atividade antioxidante, usando diversas metodologias, do extrato fenólico do tegumento,
variando a temperatura de secagem deste (Tabela 2.8). Eles concluiram que os extratos tinham
um elevado potencial antioxidante, sendo este comparado com um antioxidante sintético
BHA.

TABELA 2.8 – Teor de antioxidantes do TCC por várias metodologias e temperaturas.


Métodos Condições de processamento Controle
Tambiente T 70°C/6h T 130°C/33min BHA(1)/Catequina(2)
Oxidação lipídica-TBARS (eq.MDA-
2,75±0,34 2,34±0,31 2,75±0,18 2,12±0,15(1)
Malonaldeido / kg de extrato)
Co-oxidação β-caroteno/ác.linoleico
370 365 345 -
(coef. Ativi. Antiox./g do extrato)
Peroxidação -inibição da oxidação do
46,05±0,24 41,51±0,72 43,66±2,13 40,00±1,52 (2)
LDL (%)
Indução do DNA por H2O2 (%) 87 91 84 -
Rancimat (Fator de inflexão) 2,83±0,05 1,57±0,02 1,48±0,01 2,48±0,13(1)
Valores expressos em média ± desvio padrao (n=3); (-) Não analisado.

Com os dados expressos na tabela 2.8, pode-se afirmar que embora o tegumento
possua uma elevada porcentagem de catequinas em sua composição (CHANDRASEKARA;
SAHIDI, 2011(b); CHAVES et al.,2010; TROX et al., 2010; PARAMESWARAN PILLAI,
1959), outros compostos de função antioxidante, como tocoferol, tiaminas e/ou outros
fenólicos podem ter influenciado esta variação em relação a catequina de 1,5 a 6,05%.

A taxa de oxidação de lipídios, proteínas e DNA pelo radical superóxido é


relativamente baixa. Porém, sua importância em processos oxidativos está relacionada a sua
capacidade de gerar outras espécies reativas de oxigênio, como o •OH, que possui alta
reatividade (DANTAS; LEAL; OLIVEIRA, 2015).

2.4.1.2.6. Outras aplicações do TCC

Alem das aplicações biológicas na atividade antioxidante e atividade antimicrobiana,


os extratos do tegumento da castanha de cajú, ricos em taninos, foram estudados por Vinod
Kumar e Sethuraman (2004), na formulação de resinas de fenol-formaldeído para a
Natália de Freitas Oliveira Página 64

preparação de vernizes. Estas apresentaram-se homogêneas, de cobertura lisa, sem poros ou


quaisquer outros defeitos, assim apresentando um verniz de boa qualidade (esmaltes com bom
brilho, flexibilidade, resistência a riscos e corrosão). Uma larga escala de preparação deste
verniz pode ser uma alternativa para minimizar ainda mais o custo e também para melhorar a
qualidade dos vernizes.

2.5. Óleos vegetais

Os óleos vegetais representam um dos principais produtos extraídos de plantas. Seus


usos na indústria alimentícia correspondem a 70% de sua produção (ABIOVE, 2013). O
mercado mundial de oleaginosas representa cerca de 36% do valor total gerado pelo comércio
dos produtos agropecuários, contabilizando mais de 75% do total dos triglicerídeos
consumidos no mundo, com produção anual aproximada de 176 milhões de toneladas (USDA,
2015). Entre eles, quase 70% é extraído do endosperma de sementes com potencial
oleaginoso, como a soja, o girassol e a canola, enquanto os demais são extraídos do pericarpo
de frutos, como oliva e palma (FAO, 2013; GRUPP, 1997; GUNSTONE; HARWOOD, 2007;
MANHÃES, 2014; SALAS et al., 2000).
A indústria de processamento de óleos brasileira está entre as maiores do mundo e a
maior da América Latina, com capacidade atual de 180.384 ton./dia. Os óleos de soja, canola,
milho e girassol são os óleos com maior volume de produção e comercialização (ABIOVE,
2015; QUEIROGA NETO et al., 2009). Na safra 2014/15 foram produzidas 8,41 milhões de
toneladas de óleos vegetais no Brasil, representando 4,8 % da produção mundial, figura 2.27,
no qual a maior parte da produção brasileira de óleos vegetais é destinada para uso alimentar
(USDA, 2015). A produção brasileira de óleo de soja na última safra (2014/15) foi de 7,57
milhões de toneladas, considerado o segundo maior produtor mundial (USDA, 2015).
FIGURA 2.27 - Produção mundial de óleos vegetais em milhões de toneladas.
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Fonte: Autora, elaborado com base nos dados USDA (2015).

Os óleos contêm diferentes tipos de ácidos graxos. Estes ácidos carboxílicos de cadeia
longa, livres ou esterificados, dependendo do comprimento da cadeia e do grau de
instauração, diferenciam suas propriedades químicas e físicas, tais como: ponto de fusão, peso
específico, viscosidade, estabilidade hidrolítica, reatividade química e estabilidade térmica e
oxidativa (ARAÚJO et al., 2005; BERBEL, 2015; KNOTHE, 2005; MORETO et al., 2002).
Quando saturados, possuem apenas ligações simples (interações intermoleculares por forças
de van der Waals) entre os carbonos e com elevada superfície de contato, resultando em
pontos de fusão relativamente elevados e pouca reatividade química, assim mais estáveis ao
processo degradativo de rancidez auto-oxidativa (BERBEL, 2015; SOLOMONS; FRYHLE,
2006; MARINHO, 2012; SOLOMONS; VIANNI; BRAZ-FILHO, 1996). Já os ácidos graxos
insaturados, contêm uma ou mais ligações duplas, estes mais reativos e mais suscetíveis a
oxidação térmica. Na Tabela 2.9 são apresentados o teor de gordura saturada e insaturada e o
teor em ácidos graxos de alguns óleos vegetais estudados, tais como soja, girassol e canola,
que possuem baixo teor de triacilglicerídeos saturados (BERBEL, 2015; CARVALHO, 2011).

TABELA 2.9 - Teor de ácidos graxos em óleos vegetais.


Composição em ácidos graxos (% em massa)
Óleos
12 14 16 16:1 18 18:1 18:2 18:3 20 20:1
Algodão - 0,4-2 17-31 0,5-2 1-4 13-44 33-59 0,1-2,1 - -
Canola - <0,2 2,5-6,5 <0,6 0,8-3 53-70 15-30 5-13 0,1-1,2 0,1-4,3
Coco 44-52 13-19 8-11 <1 1-3 5-8 0-2,5 <1 <1 -
Dendê <1 <1 35-50 - 5-8 32-45 9-15 <1 <1 -
Girassol <0,4 <0,5 3-10 <1 1-10 14-35 55-75 <0,3 <1,5 <0,5
Milho <0,3 <0,1 9-14 <0,5 0,5-4 24-42 34-62 <2 <1 <0,5
Soja <0,1 <0,5 7-14 <0,5 1,4-5,5 19-30 44-62 4-11 <1 <1
Fonte: Elaborada a partir de dados cedidos pela ANVISA.

Após o processamento dos óleos brutos, como citado anteriormente, observa-se a


presença de várias outras substâncias. Além dos ácidos graxos, encontra-se: mono- e
diglicerídeos, fosfatídios, esterois, tocoferóis, hidrocarbonetos, clorofila, caroteno, pesticidas,
metais e materiais resinosos ou mucilaginosos (CARVALHO, 2011; FARIA et al., 2002;
MORETTO; FETT, 1998). O conteúdo e a composição destes componentes podem variar
devido às condições agronômicas e climáticas, qualidade da oleaginosa, sistema de extração
do óleo e principalmente seu processo de refino (CERT; MOREDA; PÉREZ-CAMINO,
2000). O objetivo do refinamento é a remoção destas substâncias indesejáveis, reduzindo ao
mínimo a alteração dos triglicerídeos e a perda de constituintes, que podem afetar tanto as
suas propriedades organolépticas, quanto a vida de prateleira do produto, se tornando um dos
Natália de Freitas Oliveira Página 66

grandes desafios da indústria alimentícia (CMOLÍK et al., 1995; IQBAL; BHANGER, 2007;
MELO, 2010; MORETTO; FEET; GONZAGA, 2002; SHAHIDI; HO, 2007 Y., 2001).

Os processos tradicionais de refino compreendem etapas de clarificação, degomagem,


desacidificação alcalina-neutralização, winterização, branqueamento e desodorização (Tabela
2.10). As etapas de degomagem e neutralização são de maior importância, pois impactam
consideravelmente na qualidade e custo do óleo, sendo muitas vezes fator decisivo na
competitividade global (OETTERER; D'ARCE; SPOTO, 2006).

TABELA 2.10 - Principais etapas do refino industrial de óleos vegetais.


Etapa do refino Descrição
Ocorre a remoção das gomas (fosfatídeos), ceras
e substâncias coloidais, com a adição de água,
Degomagem
removendo os compostos polares resultantes do
óleo.
Consiste na remoção dos ácidos graxos livres
com NaOH, removendo também fosfatídeos
Neutralização
residuais (não hidratáveis) e corantes (clorofila,
carotenoides).
Atua na remoção de cristais de estearinas, ceras,
resinas; faz-se um resfriamento lento do óleo
Winterização
para formação de cristais, que são retirados por
centrifugação.
Remove o excesso de pigmentos, corantes em
geral, subprodutos de sabões, fosfatídeos e
Branqueamento
metais; adicionando terra diatomácea ao óleo
seguido de filtragem.
O óleo passa em contracorrente com vapor de
água para a retirada das substâncias que
conferem odor ao óleo, tais como os peróxidos,
Desodorização
ácidos graxos livres, pesticidas, aldeídos,
cetonas, ácidos graxos oxidados e,
principalmente, o tocoferol (vitamina E).

Estes processos demandam vários gastos para a indústria. Além do impacto ambiental
causado pelo consumo de água e geração de efluentes, há também o aumento da concorrência
e, consequentemente, baixo valor agregado ao produto final, fazendo-se necessário estudos e
técnicas que visam melhorar, simplificar ou até modificar para novos métodos de refino, este
praticamente o mesmo desde a década de 1930 (COUTINHO, 2008).
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2.5.1. Estabilidade oxidativa de óleos vegetais

Óleos e gorduras são substâncias vulneráveis ao processo de oxidação. A resistência


do óleo aos processos oxidativos determina a sua estabilidade oxidativa, um parâmetro
utilizado para avaliar a qualidade de óleos e gorduras e não depende apenas da composição
química (teor de ácidos graxos insaturados), mas, também, reflete as condições de manuseio,
processamento e estocagem do produto (BEBEL, 2015; GARCIA; LUQUE; VARCACEL,
1993; OLIVEIRA, 2015; PULLEN; SAEED, 2012). A oxidação de ácidos graxos é um
processo complexo, procedente por uma variedade de mecanismos. Os óleos vegetais
compostos por polinsaturações são mais propensos a processos oxidativos, principalmente
aqueles com proporções variáveis dos ácidos oléico (C18:1), linoléico (C18:2) e linolênico
(C18:3) (KNOTHE et al., 2006; MELO, 2010).

A deterioração de óleos, rancidez ou oxidação lipidica, pode ser catalisada tanto por
enzimas como pela exposição à luz, radiações ionizantes, calor, íons metálicos (DAKER et
al., 2008). Esta se caracteriza pelo desenvolvimento de produtos organolepticamente
inaceitáveis, em função da ocorrência de odores e sabores estranhos (off flavours) (NILO,
2015; OLIVEIRA, 2015; TELLES, 2006). Além disso, pode causar efeitos como a mudança
em sua coloração ocasionada pela reação de Maillard, inativação de vitaminas lipossolúveis e
perda de ácidos graxos essenciais, diminuindo assim seu valor nutritivo e, consequentemente,
levando à rejeição do produto ou redução do seu tempo de consumo (FERNÁNDEZ-LÓPEZ
et al., 2008; QUINTEIRO; VIANNI, 1995). Os produtos primários de oxidação compreendem
os compostos de baixo peso molecular, que são voláteis indesejáveis (BAILEY, 1996;
BUENO, 2012; FENNEMA, 2000; JUNG et al., 1998; KANNER, 1994; MELO, 2010;
NILO, 2015; OLIVEIRA, 2015; TELLES, 2006).

Nos alimentos contendo óleos, quando são aquecidos a altas temperaturas, o processo
da oxidação é acelerado, ocorrendo reações de oxipolimerização e decomposição termo-
oxidativa (HELLÍN; CLAUSELL, 1984; KOWALSKI,1990). As modificações e alterações
dos óleos podem ser classificados de diversas formas, como as expostas na tabela 2.13. O óleo
de fritura é considerado deteriorado se a acidez estiver acima de 1%. Nos óleos vegetais, as
insaturações presentes na cadeia carbônica são um alvo de ataques de agentes oxidantes,
como os radicais livres, enzimas e metais, que atuam como catalisadores da oxidação. Os
radicais livres são originados da quebra de peróxidos e hidroperóxidos, formados durante o
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processo de oxidação dos óleos vegetais e que originam compostos de oxidação secundária
incluindo aldeídos e cetonas (German Society for Fat Research (DGF) (OLIVEIRA, 2015).

TABELA 2.11 - Modificações e alterações de óleos em diferentes etapas degradativas.


Processo Descrição
Auto-oxidação Oxidação que ocorre a temperaturas abaixo de 100ºC
Oxidação que ocorre a temperaturas que variam entre 200 e
Polimerização térmica
300ºC, na ausência de oxigênio
Oxidação que ocorre na presença de oxigênio e altas
Oxidação térmica
temperaturas (oxipolimerização)
Modificações físicas Modificações que ocorrem nas propriedades físicas
Modificações nos aspectos fisiológicos e nutricionais dos
Modificações nutricionais
óleos
Modificações químicas:
Hidrólise dos Resulta na liberação de ácidos graxos, glicerina, mono e
triglicerídios diglicerídio
Oxidação Ocorre nos ácidos graxos com ligações duplas
Extensa condensação de monômeros de ácidos graxos
Polimerização polinsaturados quando submetidos a altas temperaturas por
períodos prolongados.
Fonte: adaptado a partir de SOUZA 2010.

Dois tipos de degradação nos óleos vegetais são de particular interesse, podendo
ocorrer por processos oxidativos ou hidrolíticos.

O início da oxidação ocorre na ligação carbono-hidrogênio próxima à dupla ligação da


cadeia de carbono e pode ocorrer através da ação de enzimas ou por auto-oxidação,
fotoxidação e termoxidação; estas divididas em três etapas: iniciação, propagação e
terminação (ADAMS, 1999; SANTOS, 2010; TELLES, 2006; SICHIERI, 2013; BEBEL,
2015).

Processo hidrolítico

O processo hidrolítico resulta na formação de glicerol e ácidos graxos livres e é


causado pela reação do lipídio e pela água na presença de um catalisador ou pela ação de
enzimas lípases (enzimas presentes nas oleaginosas, nos alimentos ou microbianas),
ocorrendo geralmente durante o armazenamento dos óleos (BUENO, 2012; HAMILTON,
1983; SICHIERI, 2013; SOUZA. 2010; TELLES, 2006).

Em oleaginosas, as reações lipídicas podem ser desencadeadas por diversos fatores,


como o tempo em que são colhidas e condições em que são transportadas e estocadas antes do
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seu processamento; por exemplo, em frutas e sementes danificadas, ocorre a libertação natural
de enzimas, principalmente fenolases, lipases e lipoxigenases, que com umidade e
temperaturas relativamente altas favorecem a formação de ácidos graxos livres. Estes ácidos
graxos livres, mesmo em baixas concentrações, proporcionam sabor e odor desagradável,
como demonstrado na figura 2.28. (SICHIERI, 2013; TELLES, 2006).

FIGURA 2.28 - Esquema do processo hidrolítico.

Fonte: http://pt.slideshare.net/bromatologia-lipidios

Processo oxidativo

A rancidez oxidativa resulta de processos mais complexos da oxidação do lipídio. A


oxidação no óleo é iniciada por radicais livres e seu mecanismo é demonstrado na figura 2.29.
Os hidroperóxidos e peróxidos, produtos da oxidação primária, quando decompostos
produzem aldeídos e cetonas de baixa massa molecular. Estes são modificadores de sabor e
odor muito potentes (CARVALHO, 2011; HAS et al., 2000; NOGALA-KALUCKA et al.,
2005; SOUZA et al., 2004; SOUZA, 2010; TELLES, 2006). O processo mais estudado é a
auto-oxidação e geralmente, seu processo ocorre em três fases: uma fase da iniciação ou da
indução, uma fase da propagação, e uma fase da terminação.

FIGURA 2.29 – Mecanismo de formação de radicais livres.

Fonte: BELITZ e GROSCH (1987).


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Auto-oxidação

A auto-oxidação de lipídios é um processo muito estudado devido a sua relevância no


campo da química, biologia e alimentos. Na indústria de óleos, a auto-oxidação é um
problema crítico porque afeta a qualidade sensorial e nutricional, além de aumentar a sua
toxicidade devido à formação de radicais livres, que geram produtos indesejáveis primários,
secundários e terciários (BUENO, 2012; CARVALHO, 2011; CONEGLIAN et al., 2011).

O nome auto-oxidação foi dado pelo fato de que o grau de oxidação aumenta à medida
que a reação progride, envolvendo o mecanismo autocatalítico de radicais livres em cadeia,
podendo ser iniciada por espécies endógenas (H2O2, ROOH) e radicais (O2, ROO, OH) ou por
espécies exógenas (O2, O3), radicais (NOx, SO3), e agentes (UV, radiação ionizante, calor)
(GUNSTONE, 1994; HAMILTON et al., 1997; TELLES, 2006;).

A química da autoxidação dos alquenos foi primeiramente reportada na década de 50 e


até hoje não foi elucidada completamente. O processo de auto-oxidação se baseia na teoria de
formação de radicais livres a partir dos ácidos graxos insaturados, na ausência de
antioxidantes que impeçam a perda de um íon hidrogênio de um carbono próximo à dupla
ligação. É o principal mecanismo de deterioração lipídica, podendo ser dividido em três
etapas distintas: iniciação, propagação e terminação (Figura 2.30) (CARVALHO, 2011;
O’BRIEN et al., 2000; SICHIERI, 2013). A velocidade do processo de auto oxidação é
limitada pelas fases de iniciação e propagação.
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FIGURA 2.30 – Esquema geral da auto-oxidação lipídica.

Fonte: MELO, 2010.

Na etapa de iniciação há a formação de radicais livres, em que os ácidos graxos poli-


insaturados (RH) são atacados por uma espécie suficientemente reativa capaz de retirar um
átomo de hidrogênio do carbono alílico (α-metileno), formando um radical carbono. Este
radical é estabilizado por ressonância para formar um dieno conjugado. A formação dos
primeiros radicais livres pode ser explicada pela ação da luz sobre o grupo alélico (Figura
2.28), pela presença de cátions de metais com Fe2+, Cu2+, Cr3+ e pelo ataque do oxigênio
singleto (¹O2) (Figura 2.31) diretamente à dupla ligação (BOBBIO; BOBBIO, 2001;
CARVALHO, 2011; KNOTHE; DUNN, 2003; MELO 2010; OLIVEIRA, 2015).
Natália de Freitas Oliveira Página 72

FIGURA 2.31 - Representação da ação da luz ultravioleta, decomposição de


hidroperóxidos pela presença de cátions metálicos e ação do oxigênio singleto na região
insaturada de um ácido graxo, respectivamente.
ℎ𝑣
𝑅1 𝐶𝐻(𝑅2 )𝑅3 → 𝑅1 𝐶̇ (𝑅2 )𝑅3 + 𝐻̇ 𝑜𝑢 𝑅1 𝐶̇ 𝐻 𝑅2 + 𝑅3̇
𝐹𝑒 3+ + 𝑅𝑂𝑂𝐻 → 𝐹𝑒 2+ + 𝑅𝑂𝑂̇ + 𝐻 +
𝐹𝑒 2+ + 𝑅𝑂𝑂𝐻 → 𝐹𝑒 3+ + 𝑅𝑂̇ + 𝐻𝑂−
𝐶𝑢2+ + 𝑅𝑂𝑂𝐻 → 𝐶𝑢+ + 𝑅𝑂𝑂̇ + 𝐻 +
𝐶𝑢+ + 𝑅𝑂𝑂𝐻 → 𝐶𝑢2+ + 𝑅𝑂̇ + 𝐻𝑂 −

Fonte: MELO, 2010; GATTO et al., 2007.

Segundo Sharma e Graham (2010), durante o período inicial de oxidação, a


concentração de hidroperóxidos é baixa até um intervalo de tempo conhecido como período
de indução. Depois que o período de indução é alcançado, o nível de hidroperóxidos aumenta
rapidamente, indicando o início do processo de oxidação global.

Na fase de propagação, o odor e sabor da amostra começam a sofrer modificação e os


radicais peroxila produzidos a partir da reação do radical alquila, formado na etapa anterior
com o oxigênio, começam a reagir com os lipídios insaturados presentes na amostra,
convertendo-os a hidroperóxidos lipídico e formando novos radicais livres, tornando-se um
processo autocatalítico (propagam ainda mais a oxidação) e dando origem a uma reação em
cadeia. Os hidroperóxidos formados nesta etapa constituem os produtos primários da
oxidação (BEBEL, 2015; CARVALHO, 2011; MORRIS et.al.,1947; NOSARI, 2012;
OLIVEIRA, 2015; SIMENCIO, 2014; SOLOMONS, 2009).

Na etapa de término, ocorre a formação de espécies não-radicais estáveis, através das


reações dos radicais livres entre si. É nesta fase que há uma forte mudança sensorial, com a
formação do aroma característico de ranço nos alimentos lipídicos, devido à formação dos
aldeídos, cetonas e álcoois (ALLEN; HAMILTON, 1994; BUENO, 2012; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1986; SICHIERI, 2013).

Os peróxidos formados na primeira oxidação são instáveis e se decompõem formando


aldeídos ou produtos secundários de oxidação (CARVALHO, 2011; RAMALHO; JORGE,
Natália de Freitas Oliveira Página 73

2006) Tais produtos são também suscetíveis à oxidação, como, por exemplo, os aldeídos,
transformando-se em ácidos, que por sua vez constituem os produtos terciários de oxidação
(OETTERER et al., 2006; ROMAN et al., 2013; SANTOS, 2010; TELLES, 2006;
THOMAIDIS; GEORGIOU, 1999).

Segundo Souza et al. (2004), a auto-oxidação dos ácidos graxos insaturados produz
uma redução na estabilidade térmica dos óleos vegetais, diminuindo o tempo de indução
oxidativa. Outros processos de degradação de óleos relacionam-se a baixa estabilidade que os
mesmos apresentam quando expostos a luminosidade ou a presença de enzimas, como
facilitadores da inserção do oxigênio à cadeia graxa insaturada, desencadeando reações
oxidativas.

Na indústria de alimentos, a velocidade de auto-oxidação é reduzida através da


refrigeração, congelamento, embalagem sob gás inerte, embalagens impermeáveis ao
oxigênio e embalagem a vácuo (DAKER et al., 2008). Nos casos em que estes métodos não
são nem economicamente nem nutricionalmente práticos no ponto de vista tecnológico, é de
extrema importância controlar a oxidação através do uso de antioxidantes (GRAMZA et al.,
2006).

2.5.1.1. Antioxidantes usados em óleos vegetais

Os óleos vegetais contêm diferentes variedades de antioxidantes e estabilizantes


naturais, como tocoferóis e esteróis, que podem exibir um papel importante na inibição da
degradação do lipídio. Alguns óleos vegetais apresentam melhores ações contra a degradação
do que outros, devido a uma composição especial de ácidos graxos, antioxidantes e
estabilizantes (BELINATO, 2010). Por exemplo, o óleo de soja é mais estável oxidativamente
do que o óleo de girassol, embora o óleo de soja possua 8-9% de ácido linolênico, que é
altamente instável, enquanto o óleo de girassol não possui ácido linolênico. Entretanto, o óleo
de soja tem níveis elevados de gama e delta tocoferóis, que são antioxidantes bem melhores in
vitro do que o alfa tocoferol, que se apresenta em aproximadamente 95% do perfil tocoferol
do óleo de girassol. Os óleos vegetais de uso alimentar (óleo de soja, de amendoim, de milho,
de canola, de cártamo, de trigo e de arroz) possuem níveis mais elevados de ésteres de ácidos
graxos insaturados (ácido oléico, ácido linoleíco, ácido linolênico) (NOSARI, 2012).

Os antioxidantes atuam na redução do processo oxidativo do óleo, mantendo a


qualidade e prolongando a vida útil do produto, pois estes capturam os elétrons que se
Natália de Freitas Oliveira Página 74

encontram livres na amostra, doando um átomo de hidrogênio para os radicais livres que são
formados durante a iniciação ou propagação da reação, aumentando o tempo para que ocorra
o processo oxidativo (ANGELO, JORGE, 2007; BEBEL, 2015; CHEUNG; CHEUNG; OOI,
2003; RAMALHO; JORGE, 2006; TELLES, 2006).

O uso de antioxidantes tem sido muito difundido na indústria de alimentos, a fim de


prolongar a vida útil do produto que irá chegar ao consumidor. Para selecionar um
antioxidante devem ser levadas em conta certas propriedades, como: uso de baixas
concentrações (0,001 a 0,01%), produtos que não causem alterações na cor, odor e sabor dos
alimentos, de fácil aplicação, e não tóxicos. Os antioxidantes são normalmente classificados e
divididos de acordo com sua origem em naturais e sintéticos (CARVALHO, 2011;
RAMALHO; JORGE, 2006). Dentre os antioxidantes sintéticos, os mais conhecidos são: PG
(3,4,5-ácido triidroxibenzóico-propil galato), THBQ (t Butil hidroquinona), BHT (3,5-di-t-
butil-4- hidroxitolueno), BHA (2,3-terc-butil- 4-metil-metoxifenol), ácido ascórbico e os
tocoferóis (α, β, γ e δ-tocoferol). Porém, cada antioxidante atua de uma determinada maneira,
dependendo das propriedades do material utilizado. A quantidade relativa de tocoferois e
tocotrienois em óleos vegetais depende da espécie da planta e do procedimento de extração,
sendo que estes mostram menor eficiência quando comparados com antioxidantes sintéticos
(FERRARI; SOUZA, 2009; NILO, 2015; ROCHA, 2008; TELLES, 2006).

Antioxidantes sintéticos, tais como: BHA, BHT, PG e TBHQ (Figura 2.32), são
amplamente usados na indústria de alimentos porque estes são efetivos e menos caros que os
antioxidantes naturais, porém sua segurança tem sido questionada quanto às doses de
segurança e toxicidade. O TBHQ está banido no Japão e alguns países da Europa, o BHA e o
BHT estão relacionados a carcinogênese (BEBEL, 2015; BARREIROS; DAVID; DAVID,
2006; MOHDALY et al., 2010; MARINHO, 2012; SICHIERI, 2013).
Natália de Freitas Oliveira Página 75

FIGURA 2.32 - Estruturas químicas de antioxidantes sintéticos.

Fonte: RAMALHO; JORGE (2006)

Com a crescente consciência do consumidor em relação à segurança dos aditivos


alimentares, criou-se a tendência e a necessidade de se identificar alternativas de fontes
naturais que promovam uma maior segurança quando comparados aos antioxidantes sintéticos
em alimentos (OLIVEIRA et al., 2009). Pesquisas que têm como objetivo a segurança e
efetividade dos antioxidantes naturais estão sendo realizadas e muitas fontes naturais, como o
isolamento de compostos vegetais de frutas, folhas, raízes e sementes, estão sendo observadas
nas últimas décadas (CHANG et al., 1977; CHEVOLLEAU, et al., 1992;
HETTIARACHCHY, et al., 1996; MANCINI-FILHO et al., 1998; MARINHO, 2012;
NAKATANI, 1992; NAKATANI, 1997; PINO, 2009; PRATT, 1992; RACANICCI et al.,
2004; RAVELLI, 2011; SICHIERI, 2013; SHAHIDI; WANASUNDARA; BRUNET, 1994;
SHIMANO, 2012; SUJA et al., 2004; TRINDADE et al., 2005; WETTASINGHE; SHAHIDI,
1999; XING; WHITE, 1997).

Muitas pesquisas estão sendo realizadas para melhor entendimento dos processos
básicos da oxidação dos ácidos graxos poli-insaturados, ação antioxidante e efeitos dos
produtos de decomposição da oxidação lipídica. A metodologia para avaliar os antioxidantes
Natália de Freitas Oliveira Página 76

naturais deve ser cuidadosamente interpretada, dependendo do tipo de alimento (óleo puro ou
em emulsões) e que método analítico é usado para determinar a oxidação (FRANKEL, 1996).

A compreensão dos conceitos básicos dos mecanismos de oxidação é fundamental


para o projeto, operação, manutenção e fabricação de óleos e gorduras vegetais. Alguns
fatores importantes, inerentes ao processamento, devem ser reconhecidos e possivelmente
eliminados, com o objetivo de minimizar problemas de oxidação e garantir uma produção de
qualidade (BAILEY, 1951; NILO, 2015; SHAHIDI, 2005; SIMENCIO, 2014).

2.5.1.2. Avaliação físico-química e oxidativa de óleos

Diversos métodos analíticos foram desenvolvidos para avaliar a qualidade e


comportamento dos óleos e gorduras (físicos, químicos e físico-químicos). Por exemplo, a
determinação dos índices de iodo, peróxido e acidez, que são técnicas volumétricas clássicas,
e processos que demandam tempo, e estão sujeitos às dificuldades na visualização do ponto
final da titulação. Mais recentemente, as técnicas instrumentais de análises foram acrescidas
nas análises de óleos, como: a análise térmica; a espectroscopia de ultravioleta, visível e
infravermelho; espectrometria de massa; e ressonância magnética nuclear (RMN). Porém,
nenhum método supriu à necessidade de predizer o comportamento de um óleo ou gordura
quanto à oxidação, assim foram desenvolvidos os métodos de estabilidade oxidativa, que
aceleram o processo e fornecem uma ideia de resistência ou suscetibilidade à oxidação, além
de avaliarem o potencial do antioxidante, tais como: teste em forno Schaal, calorimetria de
varredura diferencial pressurizada (P-DSC), Rancimat, PetroOxy, dentre outros. Estes testes
devem abranger um período de tempo, de tal forma que represente a vida útil do produto
(LIMA; GONÇALVES, 1997; RIAL, 2014; SIMENCIO, 2014).

2.5.1.2.1. Testes de mensuração da oxidação de óleos

A avaliação do estado de oxidação dos óleos é muito importante, pois ajuda a


mensurar a rancidez. Segundo Souza (2007), há diferentes métodos analíticos que avaliam a
qualidade dos óleos, como a determinação dos índices de acidez, iodo e peróxido, além da
formação de dienos e trienos por detecção em UV-vis.

Índice de acidez

O índice de acidez revela o estado de conservação do óleo, o qual é utilizado para


determinar os ácidos graxos livres presentes em óleos provenientes de lipólises. É um
Natália de Freitas Oliveira Página 77

indicativo da deterioração dos triacilglicerídeos. Com estocagem prolongada, os triglicerídeos


sofrem hidrólise parcial e formam ácidos graxos livres. Por isso, não é uma constante ou
característica, mas é uma variável intimamente relacionada com a qualidade e o grau de
pureza da gordura. Esta hidrólise é ocasionada pela presença de umidade no óleo, natureza e a
qualidade da matéria-prima, processamento e com as condições de conservação, como a
temperatura elevada e, o mais importante, lipases oriundas da fonte ou de contaminações por
microrganismos (BUENO, 2012; CARVALHO 2011; MORETTO; FETT, 1998; SICHIERI,
2013; TELLES, 2006). A presença de ácidos graxos livres em excesso é indesejável
principalmente por causar alteração nas características organolépticas do óleo (escurecimento,
aparecimento de odor e sabor desagradáveis, entre outras).

Segundo Santos et al. (2001), o índice de acidez classifica os óleos em tipos, por
exemplo: óleos com acidez inferior a 1% são classificados como do tipo 1 e os de no máximo
2,5% de acidez livre são considerados do tipo 3. A acidez pode também ser expressa em (mL)
de solução normal por cento (V/p) ou em g de ácido oléico por cento (p/p).

Índice de iodo

O índice de iodo é a quantidade de gramas de iodo absorvido por 100g de gordura ou


óleo, quando usada a solução de Wijs (cloreto de iodo). O teste é uma medida do grau de
insaturação das gorduras ou, ainda, uma medida do grau de insaturação dos ácidos graxos
presentes na gordura. Assim, quando o óleo está oxidado, o iodo se adiciona
quantitativamente às ligações duplas não conjugadas e pode ocorrer a reação de adição.
Quanto maior a insaturação de um ácido graxo, maior será a sua capacidade de absorção de
iodo e, consequentemente, maior também será o índice (CARVALHO, 2011; COSTA, 2006;
MORETTO; FETT, 1998; REDA, 2004) A figura 2.33 mostra o esquema reacional do teste
de iodo.

FIGURA 2.33 - Esquema reacional do teste de iodo.


Natália de Freitas Oliveira Página 78

Fonte: CARVALHO, 2011.

Os valores de iodo devem ser interpretados com cautela, mas pode ser usado para
monitorar o grau de hidrogenação e verificar adulteração por outros tipos de óleos, pois a
quantidade de duplas ligações presentes na amostra e a redução observada deste índice se
deve à quebra de duplas ligações resultantes de reações de polimerização, ciclização e
oxidação, sempre associada com um aumento do ponto de fusão e consistência da amostra,
principalmente à incorporação de gorduras saturadas ao óleo, confirmando a adulteração com
outros tipos de óleos ao produto ou processamento ineficiente do óleo (CARVALHO, 2011;
CECCHI, 2003; COSTA, 2006; TELLES, 2006).

Índice de peróxido

O índice de peróxido é um dos testes mais usados para medir rancidez oxidativa,
oferecendo uma medida da concentração de peróxidos e dos hidroperóxidos formados no
estágio inicial da deterioração de óleos. Quanto maior o índice de peróxido inicial do óleo,
mais instável às reações de oxidação (BUENO, 2012; CECCHI, 2003; ROSSEL, 1983;
SICHIERI, 2013; SOUZA, 2007). O método é bastante específico, determinado em
miliequivalentes de O2 por quilograma de lipídios (meq/kg), e tem como limite máximo, 10
meq/kg lipídio, abaixo deste valor indica uma baixa possibilidade de deterioração oxidativa.

Os peróxidos orgânicos formados no início da rancificação atuam sobre o iodeto de


potássio, liberando o iodo, que em excesso não reage e fica em solução. Ao adicionar amido,
como indicador, em presença de I2, a amostra ficará azul, que em seguida será titulada com
tiossulfato de sódio, este é oxidado a tetrationato de sódio e o iodo é reduzido a I -, causando a
perda da cor azulada. Assim, a quantidade de tiossulfato consumida é proporcional a
quantidade de peróxidos presentes na amostra, como a reação demonstrada na figura 2.34
(AOCS, 2004; BACCAN et al., 2001; MALACRIDA; JORGE, 2003; MORETTO; FETT,
1998).

FIGURA 2.34 - Esquema reacional do teste de peróxido.

Fonte: CARVALHO, 2011.


Natália de Freitas Oliveira Página 79

Óleos que foram recém refinados devem ter o índice de peróxido próximo de zero;
óleos que foram estocados por algum período, podem apresentar índice de peróxido menor ou
igual a 2,5 mmol/Kg. Sua variação ao longo do tempo ocorre de uma forma gaussiana, pelo
que um nível baixo de peróxidos não constitui uma garantia de boa estabilidade oxidativa,
podendo, pelo contrário, ser sinônimo de alguma alteração (SILVA et al., 2009; SOUSA;
ROCHA; ROCHA, 2013).

Determinação de dienos e trienos conjugados

Um aumento na absorção de UV teoricamente reflete a formação de produtos de


oxidação primários em gorduras e óleos. Quando os ácidos graxos linoléico e linolênico são
oxidados, há a formação de hidroperóxidos, e as duplas ligações dos óleos se tornam
conjugadas. O mecanismo envolve a subtração do hidrogênio alirico, seguida pela migração
da dupla ligação, dienos conjugados são tipicamente produzidos (TELLES, 2006). Os dienos
conjugados podem ser medidos quantitativamente por medição espectrofotométrica UV no
comprimento de onda 234nm; trienos conjugados absorvem a 268 nm (AOCS, 2004; MELO
2010; SHAHIDI; WANASUNDARA, 2002; SHAHIDI; WANASUNDARA; BRUNET,
1994; WANASUNDARA; SHAHIDI; JABLONSKI, 1995).

Devido a oxidação ser variada nos diferentes ácidos graxos, os resultados das
determinações de dienos/trienos conjugados não informam o grau de deterioração do óleo,
mas a variação das concentrações com o tempo nos proporciona dados suficientes para o
acompanhamento da oxidação de uma amostra. A medição de dienos conjugados é um
método sensível para seguir as fases iniciais do processo de oxidação (ANTOLIVICH et al.,
2002; FRANKEL, 2014; POKORNY; YANISHLIEVA; GORDON, 2001).

A medida dos valores de dienos conjugados durante a oxidação de gorduras e óleos


tem sido bastante correlacionada com o índice de peróxidos, isto porque nas etapas iniciais de
auto-oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, o aumento de peróxidos ocorre paralelo ao
incremento na absorção de UV pelos dienos conjugados, sendo útil a medida do valor de
dienos conjugados na avaliação da oxidação lipídica (FARIA; ESPINOZA-ATENCIA, 1994;
HILST, 1999).
Natália de Freitas Oliveira Página 80

2.5.1.2.2. Testes de avaliação da estabilidade oxidativa de óleos

Para avaliar a suscetibilidade a oxidação de um óleo ou gordura, estes são submetidos


a teste de oxidação acelerada, sob condições padronizadas e um ponto final escolhido, no qual
são mensurados os sinais de deterioração oxidativa. Esses métodos acelerados têm por fim
estimar a vida de prateleira de óleos e gorduras (BRASILINO, 2010).

Existem vários métodos empregados para determinar a resistência à oxidação, ou seja,


o tempo de indução oxidativa de uma substância. Dentre eles, temos:

 Métodos não automatizados (AOM (Active Oxygen Method) e o método Schaal Oven
Test ou de estufa) têm sido os mais utilizados na determinação da estabilidade
oxidativa, apesar do alto consumo de reagente, e longo tempo de análise.
 Métodos automatizados determinam a estabilidade oxidativa através do período de
indução por meio de aparelhos (RANCIMAT, PETROOXY, OSI E PDSC), que
medem a absorção de oxigênio ou a formação de voláteis. São usados principalmente
para o controle de qualidade do óleo, verificar o efeito de adição de antioxidantes
naturais e variações no processamento (FRANKEL, 1993; KNOTHE, 2007).

Testes feitos para avaliar a estabilidade oxidativa e a atividade antioxidante de óleos e


gorduras são ferramentas indispensáveis para o estudo e solução dos problemas relacionados à
oxidação lipídica. Para avaliar a oxidação e, consequentemente, os antioxidantes presentes em
óleos e gorduras, podem ser utilizados testes acelerados de estabilidade oxidativa.

Schaal Oven Test

O método de estufa ou “Schaal Oven Test” tem sido bastante utilizados na


determinação da estabilidade oxidativa, pois fornece uma correlação melhor com o
armazenamento ao ambiente do que com o de oxigênio ativo (REGITANO-D´ARCE;
SPOTO, 2006). Inicialmente destinava-se à avaliação de produtos de padaria e confeitaria em
que a limpeza da estufa e pessoal bem treinado distinguia o ponto olfativo final
(MEHLENBACHER, 1960). Este procedimento inicialmente envolvia a colocação de um
béquer contendo 100g de amostra em uma estufa a temperatura de 70°C ou 63°C até o
desenvolvimento do ranço. Amostras são examinadas a intervalos que podem variar de diários
a semanais e o ponto final é determinado por uma avaliação organoléptica do odor.
Natália de Freitas Oliveira Página 81

Foi observada correlação entre o Schaal Oven Test e o armazenamento, sendo que: 10
dias a 63°C é similar a 1 a 2 meses a uma temperatura de 32°C e 2 a 4 meses a 21°C. Para o
óleo de girassol estes valores correspondem a: 2 a 4 dias no teste de Schaal Oven Test à 60-
65°C correspondem a 16 semanas. Não existe padronização para o teste de Schaal Oven Test,
pois são utilizadas relações área/volume diferentes de um trabalho para outro, além das
divergências na avaliação sensorial (AKOH, 1994; TELLES, 2006).

O período de indução, chamado também de índice de estabilidade oxidativa, é um


parâmetro comparativo muito utilizado para controle de qualidade de ácidos graxos, usado
para avaliar diferentes tipos de óleos para fritura, acompanhar alterações na composição
química em ácidos graxos e avaliar a eficiência de adição de antioxidantes, entre outros
(BRASILINO, 2010) (Figura 2.35). Este é definido pelo tempo do início da oxidação de uma
amostra exposta a um gás oxidante em uma determinada temperatura até o momento em que
há um aumento brusco dos produtos da oxidação. Este parâmetro é também utilizado como
ferramenta para controle de qualidade e classificação da eficiência de vários inibidores de
oxidação que são adicionados em polímeros, lubrificantes, gorduras, óleos e biodiesel
(RUDNIK et al., 2001; SIMON et al., 2000; VELASCO; ANDERSEN; SKIBSTED, 2004).

FIGURA 2.35 – Curva de determinação da estabilidade oxidativa.

Fonte: SIMENCIO (2014).

Encontram-se disponíveis na literatura diversas determinações do período de indução


de óleos e gorduras. Suas condições são variadas, que vão desde a variadas temperaturas,
vazões distintas de fluxo de ar e diversidade na quantidade de amostra utilizada, dificultando
assim as análises comparativas. A determinação da estabilidade oxidativa de uma amostra é
Natália de Freitas Oliveira Página 82

realizada com equipamentos comerciais, tais como Rancimat, PetroOXY e PDSC


(CARVALHO, 2011; VALE, 2011).

PetroOXY

O PetroOXY é um método recente e tem sido usado para avaliar a estabilidade


oxidativa de combustíveis líquidos (gasolina, diesel, biodiesel e misturas biodiesel / diesel),
graxas ou óleos (RIAL, 2014). Este método tem a vantagem de apresentar boa
reprodutibilidade nos resultados, menor tempo de análise quando comparado ao método
Rancimat. O PetroOXY tem de 2 a 5 vezes melhor reprodutibilidade que o Rancimat. O
tempo de teste para indicar a oxidação no PetroOXY normalmente é de 50 minutos. Isto e
uma redução drástica no tempo de teste em comparação aos métodos convencionais, que são
Rancinmat e ASTM D 525 (PETROTEST INSTRUMENTS). Diferentemente de outros
equipamentos, seus resultados incluem todos os produtos voláteis e os não voláteis da
oxidação, promovendo uma completa análise de estabilidade oxidativa (MANHÃES, 2014;
MARINHO, 2012; NEUMANN; JEBENS; WIERZBICKI, 2008). A Figura 2.36 mostra um
comparativo entre os métodos acelerados PetroOxy, Rancimat e PDSC.

FIGURA 2.36 - Comparação entre os métodos para determinar a estabilidade oxidativa.

Fonte: CARVALHO, 2011.

A determinação do período de indução utilizando equipamento PetroOXY, do


fabricante Petrotest, é baseada na detecção de forma direta da queda de pressão do processo
de oxidação, acelerado pelo calor e pressão do oxigênio, que indica consumo de oxigênio pela
amostra (NEUMANN; JEBENS; WIERZBICKI, 2008; MARINHO, 2012).

O equipamento é formado por uma pequena câmara de ensaio hermeticamente fechada


(Figura 2.37), onde a amostra (5,0 mL) é colocada e combinada com oxigênio à temperatura
ambiente até a pressão de 700 KPa. Após esta etapa, a temperatura é aumentada
Natália de Freitas Oliveira Página 83

gradativamente, promovendo um acréscimo na sua pressão interna. Essas condições simulam


um mecanismo de envelhecimento rápido e, à medida que o processo de oxidação prossegue,
o oxigênio é consumido e a queda de 10 % desta pressão indica o período de indução
oxidativa da amostra (ARAÚJO et al., 2009; CARVALHO, 2011; MARINHO 2012;
RODRIGUES FILHO, 2010).

FIGURA 2.37 - Apresentação do PetroOxy.

A B

Fonte: www.directindustry.com
Natália de Freitas Oliveira Página 84

Capítulo 3

Estado da Arte
Natália de Freitas Oliveira Página 85

3. Estado da Arte

Produtos naturais e seus compostos

As espécies vegetais representam uma fonte importante de substâncias ativas, que têm
uma grande gama de aplicações devido as suas estruturas, propriedades físico-químicas e
biológicas (LETERME et al., 2005; SANTOS, 2011). Nos últimos anos, o interesse por essas
substâncias tem se renovado e suas razões podem ser explicadas, pois as plantas têm várias
vantagens, como: a sua disponibilidade ser quase inesgotável, ter um custo relativamente
baixo, uma única planta pode conter um número extraordinário de substâncias químicas.
Além das investigações sobre novos fitoquímicos metabólitos bioativos, há uma necessidade
crescente de métodos qualitativos e quantitativos de análise de controle de qualidade destes
compostos à base de plantas e extratos vegetais (BERNAL et al., 2011).

Os compostos fenólicos simples e flavonóides apresentam uma vasta gama de


atividades antioxidantes in vitro (RAZALI et al., 2012; VARELA-SANTOS et al., 2012;
SAHA et al., 2013), efeitos protetores contra doenças graves, tais como câncer e doenças
cardiovasculares, além de suas ações como antialérgicos, anti-inflamatórios, antimicrobianos,
antitrombótica, vasodilatadora e prevenção de danos na pele (BENAVENTE-GARCÍA et al.,
2000; HSU, 2005; MIDDLETON JUNIOR; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000;
PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2001; SAMMAN et al., 2001; SVOBODOVA; PSOTOVA;
WALTEROVA, 2003).

O Brasil é o país que detém a maior biodiversidade do mundo, incluindo cinco biomas
principais: a floresta amazônica, o cerrado, a região de mata atlântica, a caatinga e o
semiárido, contando com mais de 56 mil espécies catalogadas, com 22% da biodiversidade do
planeta (GIORGETTI; NEGRI; RODRIGUES, 2007; SIMÕES et al., 2008; SANTOS, 2011).

A caracterização físico-química de frutos e a quantificação dos seus componentes


bioativos são importantes para a compreensão do seu valor nutritivo e para aumentar a
qualidade e valor do produto final. Entre os compostos presentes em alimentos que têm
propriedades funcionais, substâncias com capacidade antioxidante têm recebido uma atenção
significativa porque protegem o corpo humano contra o estresse oxidativo, prevenção de um
número de doenças crônicas degenerativas (CANUTO et al, 2010; YAHIA, 2010).
Antioxidantes naturais presentes em alimentos têm atraído interesse devido à sua segurança e
Natália de Freitas Oliveira Página 86

potenciais efeitos nutricionais e terapêuticos (RUFINO et al., 2009). As frutas são uma fonte
de compostos antioxidantes, tais como fenólicos, vitaminas, carotenoides e minerais, os quais
contribuem para os seus efeitos quimiopreventivos (ALMEIDA et al., 2011).

Oxidação lipídica

No final do século XIX, foi demonstrado por Duclaux que o oxigênio atmosférico era
o maior causador da oxidação de um ácido graxo livre. Na mesma época Wright observou que
índios americanos de Ohio conservavam a gordura de urso usando a casca de omeiro, esta
após 30 anos foi patenteada como antioxidante. Já no início do século XX, Tsujimoto em um
de seus estudos comprovou que triglicerídeos altamente insaturados poderiam provocar
odores em óleos de peixe, ou seja, o ranço. (BAILEY, 1996; DUCLAUX, 1886;
TSUJIMOTO, 1916; WANASUNDARA; SHAHIDI, 2005).

Embora o oxigênio seja o principal causador da oxidação lipídica, há outros fatores


externos que podem desencadear a reação, como a exposição aos raios UV e elevadas
temperaturas, que podem produzir reações indesejáveis, como odor e sabor de ranço,
descoloração e outras formas de deterioração, causando a redução no valor nutricional de
gorduras, pela diminuição de ácidos graxos essenciais e a destruição de vitaminas
lipossolúveis (HAS et al., 2000; KANNER, 1994).

Em alimentos, como óleos vegetais, a estabilidade oxidativa é mantida com o uso de


antioxidantes sintéticos para o controle de radicais livres, pró-oxidantes e intermediários da
oxidação, sendo o BHT e o BHA os antioxidantes sintéticos mais utilizados na indústria de
óleos e alimentos em geral (MARIUTTI; BRAGAGNOLO, 2007). Atualmente a inocuidade
dos produtos sintéticos vêm sendo questionada, o que impulsiona a busca por compostos com
esta função a partir de fontes naturais, particularmente aquelas de origem vegetal (SÁNCHEZ
et al., 2010).

Chapman et al. (1994) relatam que a estabilidade de óleos, como o óleo de canola, é
limitada principalmente pela presença de ácido linolénico, clorofila e seus produtos de
decomposição e outros componentes de elevada reatividade química, tais como ácidos graxos
livres altamente insaturados, geralmente formados durante o refino. O refino de óleos vegetais
pode variar para cada tipo de oleaginosa, devido as suas distintas concentrações graxas. Novas
metodologias vêm sendo aplicadas para se obter um óleo mais estável e com a preservação de
suas características mais importantes, mas estas ainda não foram aplicadas a todos os óleos
Natália de Freitas Oliveira Página 87

comerciais e as que estão em prática não foram demonstradas explicitamente para a


comunidade cientifica (GUNSTONE, 2002).

Rossel (1983; 1986) relata que a análise sensorial é o método mais confiável para
avaliar o estado oxidativo de lipídios alimentares. Mas, por ser um procedimento caro e
demorado, outras metodologias foram estudadas para este fim. A estabilidade de óleo foi
então estudada por métodos analíticos em condições aceleradas, estas em elevadas
temperaturas, pois a temperatura ambiente seria um processo longo e não uma análise
rotineira. Dentre os diferentes métodos de testes acelerados, o teste forno Schaal é o mais
empregado. As técnicas de análise química e instrumental são utilizadas para avaliar o estado
oxidativo do óleo armazenado, podendo detectar produtos primários ou secundários de
oxidação lipídica, que em comparação com a análise sensorial descritiva há uma correlação
significativa.

Gunstone (2002) afirma que a estabilidade de lipídeos à oxidação pode ser avaliada
por uma variedade de métodos em diferentes condições, mas a temperatura é o fator mais
importante a considerar na determinação da estabilidade oxidativa, já que a taxa de oxidação é
diretamente relacionada com o aumento da temperatura. Por conseguinte, a vida de prateleira
de um óleo diminui logaritmicamente com o aumento da temperatura. No entanto, os
mecanismos de oxidação e decomposição do peróxido variam de forma distinta à exposição a
temperaturas elevadas. Assim, para prever a estabilidade oxidativa dos óleos, a condição de
ensaio deve ser tão próxima quanto possível das de armazenagem do óleo.

Abuzaytoun e Shahidi (2006) avaliaram a estabilidade oxidativa de óleos da semente


de linhaça e maconha com casca e sem casca, expostos à testes de degradação, como a
luminosidade e temperaturas. Em ambos os testes, observaram que os óleos da semente com
casca foram mais estáveis que os sem, concluindo que a presença da casca aumentou a
concentração de antioxidantes naturais como os carotenoides, e que óleos que continham a
maior concentração de clorofila, no caso a linhaça, tinha maior suscetibilidade a oxidação
induzida pela luz. Os óleos com maior concentração de α-tocoferol ajudaram a inibir a
oxidação em ambos os testes.

Warner, Frankel e Mounts (1989) avaliaram a estabilidade oxidativa dos óleos de


canola, girassol e soja na ausência de luz e com temperaturas variando de 25, 60, 80 e 100 °C
e sob luz fluorescente em temperatura de 30 °C. As amostras foram avaliadas sensorialmente,
Natália de Freitas Oliveira Página 88

submetidas às análises de voláteis e de índice de peróxido e de determinação do período de


indução. Foram observadas diferenças nos resultados da avaliação sensorial e da estabilidade
dos óleos, dependendo do tipo de análise utilizada e das condições a que foram submetidas as
amostras, mas constatou-se que a temperatura foi a que mais influenciou na degradação.

Malcolmson et al. (1994) estudaram a estabilidade pelo método de Schaal, para o óleo
de canola (temperatura de 60 e 65 °C, no escuro), nos quais o período de indução para a
avaliação sensorial foi de 2 a 4 dias para óleo de boa qualidade inicial. O mesmo óleo de
canola estocado a 24 °C, em garrafas de vidro e no escuro, permaneceu sem alterações
sensoriais por 16 semanas. Extrapolando os resultados, os autores consideraram que o óleo de
canola com estabilidade de 2 a 4 dias, no teste de Schaal a 60-65 °C, poderá ser aceitável por
pelo menos 16 semanas, quando estocado em temperatura ambiente e sem a necessidade de
adição de antioxidantes para o controle da estabilidade.

Antioxidantes naturais x Antioxidantes sintéticos

O uso dos antioxidantes sintéticos teve início nos anos 40 e, com o aumento do
interesse sobre as suas diversas utilizações, foram surgindo estudos com a finalidade de se
diversificar e descobrir novos constituintes com a função antioxidante.

Ramalho e Jorge (2006) relatam que por possuírem uma estrutura fenólica, os
antioxidantes sintéticos permitem a doação de um próton a um radical livre, regenerando a
molécula e interrompendo o mecanismo de oxidação por radicais livres. Por conseguinte, os
derivados fenólicos transformam-se em radicais livres e podem se estabilizar sem promover
ou propagar reações de oxidação.

Com base em avaliações e abordagens industriais feitas por Mettelbach e Schober


(2003) e Shahidi, Janitha e Wanasundara (1992) estima-se que dentre os diversos
antioxidantes sintéticos, os mais utilizados na indústria são polifenóis como 3,5-di-t-butil-4-
hidroxitolueno (BHT), 2,3-terc-butil- 4-metil-metoxifenol (BHA), 3,4,5-ácido
triidroxibenzóico-propil galato (PG) e terc-butil-hidroquinona (TBHQ). Os antioxidantes
sintéticos mais usados para a conservação de óleos vegetais são o BHA, BHT e o TBHQ.

Para que um antioxidante seja aceitável para aplicação em alimentos é desejável as


seguintes propriedades: eficácia em baixas concentrações (0,001 a 0,02%); ausência de
alterações na cor, no odor, no sabor e em outras características do alimento; compatibilidade
Natália de Freitas Oliveira Página 89

com o alimento; estabilidade nas condições de processo e armazenamento, e o composto e


seus produtos de oxidação não podem ser tóxicos (RAMALHO; JORGE, 2006).

Entretanto, a inocuidade destes aditivos continua sendo questionada, uma vez que
alguns estudos têm apontado possíveis efeitos mutagênicos e carcinogênicos (BIRCH et al.,
2001). Em estudos feitos por Yildirim et al. (2001), Zheng e Wang (2001), Melo e Guerra
(2002) e Simão (1985), outros autores afirmam que os antioxidantes como BHA, BHT e
TBHQ possuem potencial de carcinogênese, bem como a comprovação de diversos outros
males como: aumento do peso do fígado e significativa proliferação do retículo
endoplasmático. Almeida-Doria e Regitano-D'arc (2000) e Cruces-Blanco et al. (1999)
estudaram o uso dos antioxidantes sintéticos BHA e BHT em animais e relataram que: o BHA
pode induzir a atividade hepática, aumento do fígado, redução do crescimento e formação de
carcinoma; o BHT foi tóxico para o fígado, rins e pulmões, entre outros efeitos.

O uso dos antioxidantes sintéticos é limitado em muitos países. No Japão, por


exemplo, desde 1958 o BHT é proibido, seguido pela Austrália, Romênia, Suécia e EUA. Já o
BHA é proibido no Japão e na União Européia. No Brasil, o Ministério da Saúde, através da
Resolução da diretoria colegiada- RDC Nº 64, de 16 de setembro de 2008, estabelece como
concentração máxima permitida a de 0,02g. 100g-1 para BHA, BHT, TBHQ e PG (ANVISA,
2011).

Os primeiros estudos sobre antioxidantes naturais ocorreram na década de 50 com


Chipault et al. (1952), que investigaram a atividade antioxidante de várias especiarias. Desde
então, diversas pesquisas sobre a ação antioxidante de compostos naturais surgiram.
Degáspari e Waszczynskyj (2004) afirmam que, a partir do início dos anos 80, o interesse e
estudos para encontrar antioxidantes naturais de diferentes partes da planta, para uso em
fitoterápicos e também como aditivos em produtos alimentícios ou uso farmacêutico, foi
intensificado e difundido mundialmente. Desde esta década estudos sobre a toxicidade dos
antioxidantes sintéticos começaram também a ser publicados. Assim, houve a intensa procura
por materiais vegetais brutos para a identificação de novos antioxidantes, que possam atuar
sozinhos ou sinergicamente com outros aditivos, como alternativa para prevenir a
deterioração oxidativa de alimentos e limitar o uso dos antioxidantes sintéticos (DURAN;
PADILLA, 1993; GOULART et al., 2009; ITO et al., 1983).
Natália de Freitas Oliveira Página 90

Os antioxidantes naturais protegem os óleos vegetais contra a ação de radicais livres


que iniciam e perpetuam a peroxidação lipídica, que consiste na principal forma de
degradação dos óleos vegetais (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011). Além disso, segundo
Aruoma (1998) e Lai, Chou e Chao (2001), os antioxidantes naturais possuem a capacidade
de agir como nutracêuticos e proporcionar, ainda, benefícios adicionais à saúde dos
consumidores. Desta forma, a indústria de alimentos vem considerando a possibilidade de
empregar antioxidante natural em uma gama de produtos (DEVATKAL; NAVEENA, 2010).

Apesar de Oliveira et al. (2009) constatar existir um alto custo de produção


(principalmente em relação à extração e purificação) e menor eficiência dos antioxidantes
naturais (em alguns casos), há também uma grande vantagem, pois, à medida que as indústrias
alimentícias produzem subprodutos ou rejeitam outras partes da planta, estes poderiam ter um
destino muito mais benéfico, favorecendo ao homem e ao meio ambiente.

Ajila et al. (2007) estudaram compostos bioativos e o potencial antioxidante de


extratos provenientes da casca de manga e relataram uma alta atividade antioxidante deste
material em diferentes sistemas.

A estabilidade dos óleos de girassol e soja também foram estudadas por Mohdali et al.
(2010) utilizando como antioxidantes naturais as cascas de batata e polpa de beterraba em
comparação com o antioxidante sintético. Foram investigados seus extratos metanólicos. Os
óleos com os antioxidantes foram submetidos às condições de oxidação acelerada durante 72
horas, a 70°C. A formação de dienos e trienos aumentou gradualmente com o aumento do
tempo, e a estabilidade relativa aos antioxidantes foi: TBHQ > cascas de batata > BHT =
polpa de beterraba > BHA. Os resultados de diferentes parâmetros antioxidantes
demonstraram que as cascas de batata e a polpa de beterraba são fontes potentes de
antioxidantes naturais, que podem ser exploradas para evitar a oxidação de óleos vegetais.

Mohdaly et al. (2011) utilizaram extratos metanólicos desengordurados de gergelim


como antioxidantes em óleos de soja e girassol e compararam com antioxidantes sintéticos em
testes de estabilidade oxidativa acelerada por temperatura no Schaal oven test. Ao final do
estudo, eles concluíram que o extrato de gergelim na concentração de 200 ppm tem eficácia
comparável à estabilização com os antioxidantes BHT e BHA no seu limite legal, mas menos
eficaz do que o TBHQ (antioxidante sintético). Eles também observaram que o extrato de
Natália de Freitas Oliveira Página 91

gergelim tem um forte efeito antioxidante durante os passos iniciais e finais de oxidação a
70°C durante 72 h.

Iqbal e Bhanger (2005) avaliaram a eficácia do extrato de alho na estabilização do óleo


de girassol, durante o armazenamento acelerado. Os extratos de alho foram preparados em
diferentes solventes; o extrato metanólico destacou-se com maior atividade antioxidante,
sendo este aplicado no óleo de girassol, submetido a aquecimento a 185°C com avaliação em
intervalos diferentes (0-80 min), comparados ao BHA e BHT, que também foram avaliados
como padrões, além do controle. Assim, o estudo apontou que para os parâmetros de ganho de
peso, índice de atividade antioxidante, ácidos graxos livres (AGL), índice de peróxido (IP),
formação de dienos conjugados (DC), trienos conjugados (TC) e substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS), o extrato de alho pode estabilizar o óleo de girassol até uma extensão
maior do que antioxidantes sintéticos comumente utilizados, impedindo a deterioração
térmica do óleo, melhorando a sua estabilidade hidrolítica, inibindo conjugação de ligação
dupla e ainda reduzindo as perdas de ácidos graxos poli-insaturados

A estabilidade oxidativa do óleo de gergelim foi avaliada por Abou-Gharbia et al.


(1996), que demonstram a redução da estabilidade após o descasque de sementes,
especialmente para os óleos obtidos a partir de sementes cruas e torradas. Eles constataram
que a casca da semente possui antioxidantes naturais, que foram responsáveis por uma melhor
estabilidade em comparação com o óleo de sementes sem casca. Observou-se, ainda, que 1 dia
de armazenamento, sob condições Schaal forno a 65°C, é equivalente a um mês de
armazenamento à temperatura ambiente (25°C).

Naczk e Shahidi (2004) e Cheok et al. (2012), afirmam que, em sua grande maioria, os
extratos naturais são mais efetivos que alguns antioxidantes sintéticos. Em determinadas
espécies de plantas são encontrados compostos que apresentam poder antioxidante, atribuído
principalmente a compostos fenólicos. Estes compostos constituem um amplo e complexo
grupo de fitoquímicos, cuja solubilidade é governada pela polaridade do solvente extrator,
grau de polimerização da molécula, e interação com outros constituintes presentes na matriz.
Além disso, a eficiência do processo de extração é influenciada por outras variáveis, como:
tempo, temperatura de extração e concentração do solvente extrator, entre outras.

Neste contexto, surgem os subprodutos agroindustriais, que por apresentarem


quantidade relevante de compostos fenólicos, após o processamento, podem ser vistos como
Natália de Freitas Oliveira Página 92

fontes interessantes de antioxidantes naturais, como relatado por Moure et al. (2001),
Lapornik et al. (2005), Caetano et al. (2009), Nascimento, Araújo e Melo (2010), Babbar et al.
(2011), dentre outros.

Aproveitamento de subprodutos industriais como fontes antioxidantes

A exploração de subprodutos orgânicos (farelos, cascas, bagaços e sementes de frutas)


provenientes de vários setores da agricultura e da agroindústria vem crescendo à medida que
estes são gerados, consequentemente, criando soluções para problemas ambientais devido à
utilização deste lixo orgânico, embora grande parte já seja reaproveitada como ração animal.
Todavia, em muitos casos, os subprodutos são considerados custo operacional para as
empresas, dessa forma grande quantidade é descartado de maneira indevida (LOUSADA JR
et al., 2005; MELO et al, 2011).

Scherer, Rybka e Godoy (2008) apontam que as cascas e sementes são de extrema
importância para as funções fisiológicas, devido a sua composição de substâncias como os
compostos antioxidantes, fenólicos, vitamina C e carotenoides que podem ser encontrados em
maior concentração nestas partes dos vegetais. Além disto Wolfe, Wu e Liu (2003) e Moon e
Shibamoto (2009) afirmam que muitos destes compostos apresentam propriedades biológicas,
antimicrobiana, antialergênicas, antiaterogênicas, anti-inflamatórias, antitrombóticas, que os
tornam possíveis agentes cardioprotetores.

Diversos pesquisadores estudaram os subprodutos (cascas) de arroz, amêndoas, trigo e


pistache. Eles afirmaram que estes são fontes significativas de antioxidantes, corroborados
pela presença de compostos fenólicos (BRYNGELSSON et al., 2002; GOLI; BARZEGA;
SAHARI, 2005; RAMARARHNAM, 1995; TAKEOKA; DAO, 2002; WATANABE;
OHSHITA; TSUHIDA, 1997). Outros subprodutos gerados pela indústria alimentícia e no
uso doméstico, como cascas, fibras de frutas e vegetais, são importantes fontes de
antioxidantes naturais.

Peschel et al. (2006), estudando cascas de maçã e pêssego, verificaram que na pele
destas frutas os teores de compostos fenólicos foram duas vezes superiores àqueles
observados na polpa, demonstrando que uma riqueza em compostos bioativos estão sendo
desprezados pela sociedade e indústria.
Natália de Freitas Oliveira Página 93

Yu et al. (2005) estudaram o tegumento do amendoim e constataram uma fonte rica de


nutracêuticos e compostos bioativos, tais como os compostos fenólicos.

Diversos potenciais de antioxidantes naturais provenientes de subprodutos foram


testados como fontes de baixo custo, como: bagaço de oliva (ALIAKBARIAN; CASAZZA;
PEREGO, 2011; SHEABAR; NEEMAN, 1988), bagaço e casca de maçã (DIÑEIRO
GARCÍA; VALLES; LOBO, 2009; MAHAWAR; SINGH; JALGAONKAR, 2012; REIS;
RAY; ABU-GHANNAM, 2012), sementes e bagaço de uva (DENG; PENNER; ZHAO,
2011; TORRES; BOBET, 2001; YILMAZ; OZVURAL; VURAL, 2011), sementes e cascas
de frutas cítricas (BOCCO et al., 1998; GIL et al., 2002; GORINSTEIN et al., 2001),
sementes e pele de tomate (GEORGE et al., 2004; TOOR; SAVAGE, 2005), subproduto da
produção de polpa de cenoura (CHEN; TANG, 1998), entre outros.

Sementes e nozes podem ser consideradas fontes de compostos antioxidantes, como


demonstrado em estudos prévios para a canola (KRYGIER; SOSULSKI; HPGGE, 1982;
WANASUNDARA; AMAROWICZ; SHAHIDI, 1994), o gergelim (SHAHIDI et al., 2006), a
linhaça (OOMAH; KENASCHUK; MAZZA, 1995), a semente de girassol (KUBICKA;
JEDRYCHOWSKI; AMAROWICZ, 1999), pecãs, amêndoas, avelãs e macadâmias (YANG,
2009; YANG; LIU; HALIM, 2009), entre outras.

Moure et al. (2001) afirmam que além da aplicação como ingrediente funcional em
alimentos e nutracêuticos, os subprodutos ricos em antioxidantes podem ser usados para
aumentar a durabilidade de alimentos, prevenindo a peroxidação lipídica e protegendo contra
o dano oxidativo, como exemplo o aumento da estabilidade de óleos vegetais frente às reações
de oxidação, como já citados ao longo do estado da arte.

Tegumento da castanha de cajú (Anacardium occidentale)

Donkoh et al. (2012), com o objetivo de incorporar o tegumento (TCC) na dieta de


suínos, em substituição ao milho e ao farelo de trigo, determinou a sua composição mineral e
constatou que o TCC continha mais proteínas, fibras, cálcio e magnésio, composição do
extrato de etéreo, fósforo, e potássio, que em outras fontes para alimentação animal.

A composição do tegumento foi estudada por diversos autores, como: Ashidate et al.
(2005), Calderon-Montano et al. (2011), Ivanova et al. (2005), Kwon et al. (2010), Laughton
et al. (1991), Quettier-Deleu et al. (2000), Sadik, Sies e Schewe (2003) e Wojdylo,
Natália de Freitas Oliveira Página 94

Oszmianski e Czemerys (2007), que identificaram variados constituintes químicos no TCC,


destacando-se os pertencentes as seguintes classes: terpenos, flavonóides, terpenóides
(presentes em óleos essenciais), catequinas, epicatequinas, taninos e esteróis. Os compostos
fenólicos estão relacionados, por vários autores, como os principais responsáveis pela
atividade farmacológica do TCC.

No tegumento foram selecionados para estudo as diversas fontes fenólicas, das quais
foram isoladas a (+)-catequina e (-)-epicatequinas (SANKARA SUBRAMANIAN; JOSEPH;
NAIR, 1969). Além disto, suas atividades farmacológicas têm sido testadas e uma das classes
de compostos bioativos que tem despertado maior interesse são os lipídios fenólicos,
sobretudo por suas propriedades antioxidantes (KUBO et al., 2006; KAMATH; RAJINI,
2007).

Em um outro estudo, Shahidi, Alasalvar e Liyana-Pathirana (2007b) analisaram os


rendimentos do teor de compostos fenólicos solúveis e conjugados nos extratos etanólicos do
tegumento bruto, quando submetidos à baixas e altas temperaturas. Os maiores rendimentos
dos extratos fenólicos foram de 44,2 ± 1,4 g/100 g de farinha desengordurada e seu teor de
fenólicos totais foi de 347,99 ± 6,88 g/g de farinha desengordurada, no qual o TCC foi
submetido a temperatura de 130 ° C durante 33 min.

Estes resultados são semelhantes ao estudo feito no tegumento de avelã e derivados


por Shahidi, Alasalvar e Liyana-Pathirana (2007a) e Yu et al. (2006), onde a torrefação (175
° C/5 min) aumentou os compostos fenólicos totais do tegumento do amendoim em 40% em
relação ao tegumento bruto. Os autores concluiram que o tratamento térmico aumenta a
concentração de compostos fenólicos no tegumento e que seus resultados estão de acordo com
estudos semelhantes realizados utilizando amendoim e avelãs (LOCATELLI et al., 2010; YU
et al., 2006).

Aguilar et al. (2012) estudaram o uso dos extratos das folhas e do tegumento da
castanha de cajú em diversos solventes e observaram uma elevada atividade antifúngica, que
também foi estudada por Konan et al. (2007), John e Shahidi (2010) e Aguilar et al. (2012).

Os níveis de α- e γ-tocoferóis no TCC também foram avaliados e estes variaram de


10,1 e 10,6 mg / kg de MS, respectivamente. Tocoferóis são referidos por constituirem uma
parte essencial das membranas biológicas, apresentando um papel protetor contra a
Natália de Freitas Oliveira Página 95

peroxidação lipídica da membrana, lipoproteínas e gorduras (TROX et al., 2011 ). No TCC


também foi encontrada a tiamina (3,0 mg / kg de MS).

Atualmente, a função e aplicação mais estudada do TCC é a sua atividade


antioxidante. Autores como Shahidi e Chandrasekara (2011 b) avaliaram a atividade
antioxidante do extrato fenólico do tegumento através de diversas metodologias, variando a
temperatura de secagem. Nesses estudos, concluiram que os extratos tinham um elevado
potencial antioxidante, sendo este comparado com um antioxidante sintético (BHA).

Chaves et al. (2008) investigaram o potencial dos extratos etanólicos do tegumento da


castanha para sequestrar o radical DPPH. Os resultados obtidos, expressos por meio da
porcentagem de atividade antioxidante, foram analisados nas concentrações de 25 a 250
µg/mL, no qual o tegumento teve variações de 12-40% de inibição.

Kamath e Rajini (2007) avaliaram a atividade antioxidante do tegumento da castanha


de cajú por diferentes métodos para análise de antioxidantes. Para o método do ABTS, a
atividade antioxidante foi medida através da descoloração das amostras com a concentração
+
do radical ABTS , comparando o extrato do tegumento e um antioxidante sintético, BHA
(2,3-terc-butil- 4-metil-metoxifenol). Seu potencial foi também medido pelos métodos:
sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2), sequestro do radical hidroxil-deoxirribose, LDL
e FRAP. A partir dos dados obtidos nos diferentes ensaios, ficou evidente que a ordem de
eficácia do TCC é: ABTS > superóxido > desoxirribose > LDL > FRAP. Eles Concluiram que
o extrato do tegumento é um antioxidante mais potente que o redutor férrico.

Rodrigues Filho (2010) estudou a ação de antioxidantes naturais, cardanol e eugenol


hidrogenados, extraídos da castanha de cajú e do cravo da índia. Nos estudos, eles foram
adicionados ao biodiesel de algodão frente a ensaios de estabilidade oxidativa, comparando os
resultados com o antioxidante sintético BHT. O estudo mostrou a seguinte ordem de atividade
inibitória: eugenol hidrogenado > cardanol hidrogenado > BHT, mostrando resultados
satisfatórios quanto à atividade inibitória dos processos oxidativos dos antioxidantes naturais.

Através de estudos já relatados, observou-se que o tegumento possui uma elevada


quantidade de compostos funcionais, mas sua composição ainda não pode ser descrita em sua
totalidade, pois alguns de seus constituintes naturais ainda não foram quimicamente estudados
e grande quantidade de compostos, já isolados e com estrutura química determinada, ainda
Natália de Freitas Oliveira Página 96

não têm a atividade biológica ou funcionalidade determinada, seja quanto às suas


potencialidades de uso de cunho terapêutico ou industrial.
Natália de Freitas Oliveira Página 97

Capítulo 4

Metodologia
Natália de Freitas Oliveira Página 98

4. METODOLOGIA
Neste capítulo, serão descritos os materiais, os reagentes e as metodologias utilizadas
para o isolamento, caracterização e análise dos compostos obtidos, bem como as técnicas
desenvolvidas para a realização desta tese.
Esta metodologia foi dividida em duas etapas: a primeira foi a classificação e o
isolamento das classes de compostos existentes no Tegumento da Castanha do Caju (TCC);
na segunda etapa óleos vegetais brutos foram refinados e avaliada sua estabilidade oxidativa
no processo de oxidação acelerada com e sem a adição de antioxidantes extraídos do TCC
(fenólicos), conforme o fluxograma 4.1.
FLUXOGRAMA 4.1 – Esquema de trabalho.

Abordagem
fitoquímica Compostos
1 Etapa TCC fenólicos
Isolamento e
caracterização Compostos
de classe de lipofílicos
Alcalóides
Tese

compostos Compostos
nitrogenados Sais de
amônio

Influência dos Antioxidantes


Oxidação
Testes de Óleo antioxidantes do TCC
2 Etapa Óleo Bruto acelerada
refino refinado no processo e
(OA) BHA
OA

Fonte: Autora.

4.1. Materiais

O tegumento de A.occidentale foi coletado em janeiro/fevereiro de 2012, na Unidade


de Beneficiamento de Castanha de Cajú, no município de Macaíba, que está localizado na
mesorregião leste do estado do Rio Grande do Norte e a 14 km de sua capital Natal,
compondo sua região metropolitana. A sede do município possui coordenadas 05°51’28” de
latitude sul e 35°21’14” de longitude oeste, conforme a Figura 4.1.
Natália de Freitas Oliveira Página 99

FIGURA 4.1 – Divisão geográfica da produção de castanha de caju no Rio Grande do Norte.

Macaíba

Fonte IBGE, 2015.

Os óleos de canola e girassol brutos foram cedidos e pré-caracterizados pela Triângulo


Alimentos S/A.

4.2.Produção da farinha do Tegumento da Castanha de Cajú (TCC)

As cascas da castanha e tegumentos foram selecionadas, isolando resquícios de


castanha e algum outro material vegetal que não sejam os utilizados neste trabalho. Feito isso,
o material selecionado foi pesado e levado para a próxima etapa.

Os subprodutos do beneficiamento foram secos em estufa a 50°C por 72h. A cada 24


horas de tempo de secagem em estufa as amostras eram retiradas e moídas em um moinho de
facas, onde em seguida eram novamente colocadas em estufa para um novo período de
secagem, repetindo-se assim até completar 72 horas de secagem em estufa. Após o ciclo de
moagem e secagem, o material foi peneirado em peneiras da série Tyler de 20 mesh e seu
material passante foi mantido sob refrigeração.

4.3. Abordagem fitoquímica preliminar do TCC

Os extratos foram submetidos à uma investigação dos constituintes químicos por


classe metabólica. Os metabólitos testados foram: fenóis e taninos, antocianinas,
antocianidinas e flavonóides, leucoantocianidinas, catequinas e flavonas, flavonóis,
Natália de Freitas Oliveira Página 100

flavononas, flavononóis e xantonas, esteróides e tripernóides, saponinas, ácidos fixos fortes,


resinas, alcalóides, bases quartenárias, quinonas, antranóis, cumarina, agliconas flavonóides,
agliconas esteróides e tripernóides e glicerina. Estes testes foram realizados de acordo com as
condições estabelecidas e metodologia descrita por Matos (2009).

4.3.1. Obtenção dos extratos do TCC


Para o início das análises foram elaborados os extratos do TCC (após a moagem), com
a finalidade de fazer o levantamento dos metabólitos secundários presentes, sendo um deles
hidrofílico (mistura binária etanol-água 70%) e o outro lipofílico (clorofórmio).
Para a obtenção dos extratos, 50g do TCC foram submetidas à extração via percolação
com 1L de etanol 70% e, após 48 horas de contato, resultou no extrato hidroalcoólico. O
mesmo foi feito em 50g de TCC e 1L de clorofórmio para a produção do extrato lipofílico,
que em seguida foi filtrado e armazenado à 4°C até sua utilização.
4.3.1.1. Caracterização do extrato hidroalcóolico do TCC

O extrato hidroalcóolico foi submetido à uma série de tratamentos com a finalidade de


identificar qualitativamente cada classe de metabólitos, utilizando a sequência descrita nos
fluxogramas 4.2 e 4.3.

FLUXOGRAMA 4.2- Marcha para a caracterização dos constituintes químicos presentes no


extrato hidroalcóolico.

Extrato Hidroalcóolico do TCC(1L)

Potencial Alíquotas Hidrólise


Catequinas concentradas à Extrato hidrofílico
Hidrogeniônico Fluxograma 4.3
secura

NH4OH pH 11
Fenóis e Taninos Étrer - Clorofórmio
Ácidos fixos Teor de Resinas
fortes extrativos
Antocianinas,
Antocianidinas e Solúvel em Solução
Flavonóides éter- aquosa
clorofórmio
Leucoantocianidinas, Extrato seco
Catequinas e Na2SO4 HCl pH 5
Flavonas HCl 0,1M
CHCl3
Flavonóis, Flavonas,
Flavanonois e Bases
Xantonas Quartenárias
Solúveis em Solução
Insolúveis solução Éter-
Clorofórmio Aquosa
Clorofórmio

Saponinas
Esteróides e Alcalóides
Triterpenóides
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Natália de Freitas Oliveira Página 102

FLUXOGRAMA 4.3 - Hidrólise ácida do extrato hidroalcóolico do TCC e seus tratamentos.

Extrato hidroalcóolico do TCC

HCl 6M
Refluxo
Éter

Solúveis em água e
insolúveis em éter Solúveis em éter

HNaCO3 2,5%
Rejeita Éter

Solúveis em Éter Solúveis em Água

NaOH 2%

Éter
Solução aquosa
Solução etérea
alcalina

HCl conc. pH3-4


Éter
Agliconas esteróides
e Triterpenóides
Solúveis em Água Solúveis em Éter

Fase Orgânica Fase aquosa Ácida


Ácidos fixos fortes

Rejeita

Alíquota levada a
Quinonas secura

Agliconas
Antratóis
flavonóides

4.3.1.2.Caracterização do extrato clorofórmico do TCC


Natália de Freitas Oliveira Página 103

O extrato lipofílico obtido por percolação em clorofórmio foi submetido a diversos


tratamentos com a finalidade de extrair e identificar qualitativamente metabólitos
existentes na amostra. Assim, o extrato foi tratado conforme os fluxogramas 4.4 e 4.5.
FLUXOGRAMA 4.4 – Marcha para a caracterização dos constituintes químicos
presentes no extrato lipofílico do TCC.

Extrato Lipofílico do TCC (1L)


HCl 0,1N
H2O

Extrato privado
Solúveis em Água
das bases
NH4OH
NaHCO3 2%
Éter-
H2O clorofórmio

Solúveis em Água Solução orgânica Solúvel em Água Solução etérea


Hcl
NaOH 2%
Éter HCl 1N
H2O
H2O

Solúveis em eter Solúveis em água Solúvel em água Solução orgânica Solúvel em água Solução etérea

Hcl conc pH2-5 Rejeita


Éter

Ácidos fixos fortes Rejeita Hidrólise alcalina


Neutraliza para teste
de bases
quartenárias

Solúvel em água Solúveis em éter

Antocianinas,
antocianidinas e Antanóis
Rejeita
flavonóides
Flavonóis, Cumarina
flavononas,
flavononois e
xantonas Fénois e Taninos
Leucotocianinnas,
catequinas e
flavonas quinonas
Natália de Freitas Oliveira Página 104

FLUXOGRAMA 4.5: Hidrólise alcalina do extrato clorof´rmico do TCC e seus tratamentos.

Extrato clorofórmico do TCC


(100mL)
CH3OH
NaOH 70%

Extrato Saponificado

H2O
Éter

Solúvel em éter Solúvel em água

CHCl3 HCl pH 2-3


Éter

Esteróides e Solúvel em éter Solível em água


triterpenóides

Etanol
Antocianinas, Ácidos fixos fortes
antocianidinas e
flavonóides
Fénois e taninos Glicerina
Flavonóis, flavononas,
flavononois e
xantonas
Leucotocianinnas,
catequinas e flavonas

4.4. Testes fitoquímicos


Natália de Freitas Oliveira Página 105

Os extratos foram submetidos a diversos tratamentos e em cada etapa destes


tratamentos há a extração de metabólitos existentes no TCC, que foram confirmados por
testes qualitativos ou reservados para testes posteriores.

4.4.1. Abordagem fitoquímica para o extrato hidroalcóolico do TCC


4.4.1.1. Determinação do rendimento dos extratos

Em um Becker tarado foi adicionado 10 mL do extrato e levado a banho-maria até a


secura. Em seguida o recipiente foi colocado em um dessecador por 24 h e pesado.

Os teores percentuais dos extratos foram calculados com a diferença do material


pesado e o peso da planta seca.

4.4.1.2. Teste para fenóis e taninos

O teste para detectar a presença de fenóis e taninos no TCC foi realizado com 3 mL do
extrato em um tubo de ensaio, no qual adicionou-se uma solução alcoólica de FeCl3 e agitou-
se. Ao final da reação foi realizada a comparação dessa solução com um teste em branco, isto
é, usando apenas água e cloreto férrico.

A coloração variável entre azul e vermelho indica a presença de fenóis. Já a presença


de precipitado escuro de tonalidade azul indica a presença de taninos hidrolisáveis, e
precipitado verde, a presença de taninos condensados ou catequínicos.

4.4.1.3. Testes para antocianinas, antocianidinas e flavonóides


Para a detecção desses constituintes utilizou-se três tubos de ensaio, cada um com 3
mL do extrato, e acrescentou-se diferentes soluções: HCl diluído 1M (pH=3), NH4OH
(pH=9) e NH4OH (pH=11).
O aparecimento das cores de acordo com a tabela 4.1 indica a presença de vários
constituintes.

TABELA 4.1 - Representação das cores características, em determinado pH, para a


identificação das constituintes antocianinas, antocianidinas e flavonóides.
Natália de Freitas Oliveira Página 106

Cor em meio
Constituintes
Ácido (pH 3) Alcalino (pH 8,5) Alcalino (pH 11)
Antocianinas e
Vermelha Lilás Azul-púrpura
Antocianidinas
Flavonas, Flavonóis
- - Amarela
e Xantonas
Chalconas e
Auronas Vermelha - Vermelho Púrpura

Flavanonóis - - Vermelho laranja

4.4.1.4. Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas

Para a identificação desses metabólitos secundários foram adicionados 2 mL do


extrato em dois tubos de ensaio, nos quais o primeiro foi acidificado com HCl (pH=2), já o
segundo foi alcalinizado com NH4OH (pH 11).

A modificação na cor, comparando com os tubos correspondentes usados no teste do


item 4.4.1.2, indica a presença dos constituintes como especificados na tabela 4.2.

TABELA 4.2 - Representação das cores características, em determinado pH, para a


identificação dos constituintes leucoantocianidinas, catequinas e flavononas.
Cor em meio
Constituintes
Ácido Alcalino
Leucoantocianidinas Vermelho -
Catequinas Amarelo -
Flavonas - Vermelho laranja

4.4.1.5. Testes para flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas

Para possível detecção dos constituintes propostos foi adicionado uma pequena fita de
Magnésio e 0,5 mL de HCl conc. em um tubo contendo 2 mL do extrato. Após o término da
reação, indicada pelo fim da efervescência, o recipiente foi comparado com o teste acidulado
anterior.

O aparecimento ou intensificação de cor vermelha é indicativo da presença de


flavanonas, flavonóis, flavanonóis e/ou xantonas, livres ou seus heterosídios.

4.4.1.6. Teste de confirmação de catequinas


Natália de Freitas Oliveira Página 107

Um palito de fósforo comum foi umedecido em uma de suas faces com o extrato a ser
testado e deixado em repouso para a evaporação do solvente. Em seguida o palito foi
reumedecido com HCl conc. e levado à uma chama de álcool por 2-3min. Foi observado a
variação da coloração do palito.

O surgimento de uma coloração vermelha ou pardo-avermelhada confirma a presença


de catequinas.

4.4.1.7. Testes para esteróides e triterpenóides

Foram adicionados 4 mL de clorofórmio no Becker que continha o subproduto seco do


extrato e agitado suavemente até a completa dissolução. A solução foi filtrada em um funil
com sulfato de sódio anidro e em seguida acrescentou-se 1 mL de anidrido acético e três gotas
de H2SO4 concentrado.

O aparecimento da coloração azul seguida de verde permanente indica a presença de


esteróides livres. Já a coloração vermelha indica triterpenóides pentacíclicos livres.

4.4.1.8.Testes para saponinas

Para este teste colocou-se o subproduto insolúvel em clorofórmio, separado nas etapas
anteriores, para ser redissolvido em água destilada e, em seguida, submeteu-se a intensa
agitação, em vortex.

A formação de espuma persistente e abundante indica a presença de saponinas.

Teste confirmatório para saponinas

Para confirmar a presença de saponinas no extrato, adicionou-se 2 mL de HCl


concentrado no tubo preparado no teste anterior e colocou-se em banho-maria por
aproximadamente uma hora. Após ser resfriado a temperatura ambiente, foi adicionado
hidróxido de amônio até neutralizar a solução.

A presença de precipitado e não formação de espuma confirma a presença de


saponinas.

4.4.1.9.Teste para ácidos fixos fortes


Natália de Freitas Oliveira Página 108

Ao subproduto seco do extrato hidroalcólico foi adicionado 0,5mL de etanol e 1 mL


de NH4OH concentrado em um becker. O material foi aquecido, filtrado e mantido em banho-
maria até a secura. O extrato seco foi levado a estufa a 100-105°C por 10 min para assegurar
a evaporação da amônia. Em seguida, foi redissolvido em água, filtrado e dividido em dois
tubos. Em um dos tubos foi adicionado 1 mL de NaOH 1M e rapidamente fechado com uma
tira de papel umedecida com o reagente de Nesler e o outro foi usado como comparativo. O
aparecimento da coloração marrom no papel com NaOH indica a presença de ácidos fixos
fortes.

4.4.1.10. Teste para resinas

Para identificar se as resinas são constituintes presentes no extrato, foi utilizado o


subproduto sólido resultante da concentração do extrato, que foi redissolvido na menor
quantidade possível de etanol, filtrado e diluído com água destilada até triplicar o volume.

A presença de um precipitado floculoso indica a presença de resinas.

4.4.1.11. Teste para alcalóides

Para esse teste uma quantidade do extrato foi basificada com NH4OH até pH11 e as
bases orgânicas extraídas com três lavagens com éter-clorofórmio (3:1) em funil de separação.
Para retirar possíveis bases quaternárias presentes, a parte aquosa da solução foi separada e a
solução éter-clorofórmio foi dividida e tratada com HCl diluído (0,1 M). A solução aquosa
ácida foi então colocada em três tubos de ensaio, cada tubo recebeu a adição de três gotas de
um dos reagentes de precipitação de alcalóides: Hager, Mayer e Dragendorff.

A formação de precipitado floculoso em pelo menos dois dos tubos é indicativo da


presença de alcalóides.

4.4.1.12. Teste para bases quartenárias

A solução aquosa separada do item anterior 4.4.1.11 foi acidulada, filtrada e dividida
em três tubos de ensaio e adicionadas de três gotas dos reagentes de Hager, Mayer e
Dragendorff em diferentes tubos.

A formação de precipitado floculoso é indicativo da presença de bases quartenárias.

4.4.1.13. Hidrólise ácida para o extrato hidroalcóolico


Natália de Freitas Oliveira Página 109

O subproduto aquoso reservado no item 4.4.1.11 foi reunido com a solução do teste
4.4.1.9 e acrescentado HCl conc. até ser obtido uma solução 6M. A mistura foi aquecida em
refluxo por aproximadamente 4h. Após resfriamento, esta foi lavada em funil de separação
com três porções de éter etílico e as soluções etéreas foram reunidas e reservadas para testes
futuros.

4.4.1.14. Teste para ácidos fixos fortes em extratos hidrolisados

A extração dos ácidos fortes foi feita a partir da solução etérea reservada no item
4.4.1.11, que foi extraída com NaHCO3 2,5%, três lavagens sucessivas de 12-24 h de contato
em cada lavagem. As soluções etéreas foram reservadas, a solução alcalina foi acidulada e os
ácidos foram reextraidos com três lavagens sucessivas com éter, mantendo o contato de cada
lavagem por 1h em média. A solução ácida foi descartada e a etérea foi testada com o
reagente de Nesler, conforme o item 4.4.1.9.

4.4.1.15. Preparo do extrato para os testes: quinonas, antranóis e agliconas flavonóides

A extração foi realizada a partir da solução etérea reservada no item 4.3.1.14, que foi
lavada com NaOH 2% em três etapas. A solução etérea resultante foi reservada por conter
constituintes neutros, as soluções aquosas foram reunidas e aciduladas com HCl conc. até pH
3-4 e os ácidos fracos e fenóis extraídos após três lavagens sucessivas com éter.

Teste para quinonas

Em um tubo de ensaio contendo 5 mL da solução etérea resultante do item 4.4.1.15,


foram adicionados 2 mL de NH4OH 6M e levado para agitação em vortex até a formação de
uma mistura binária.

O aparecimento de uma coloração vermelha na fase aquosa alcalina indica a presença


de quinonas, em especial as antroquinonas hidroxiladas.

Teste para antranóis

Caso o teste anterior para quinonas tenha sido negativo, é adicionado ao mesmo tubo 1
mL de H2O2, agita-se e espera-se a formação de duas fases.

A formação de uma cor vermelha intensa na fase aquosa indica a presença de antranóis
ou heterosídios.
Natália de Freitas Oliveira Página 110

Teste para agliconas

O extrato etéreo do item 4.4.1.15 foi levado a secura em banho-maria e redissolvido


com 15 mL de etanol. Esta solução foi dividida em sete tubos de ensaio e aplicados os testes
dos itens 4.4.1.3 a 4.4.1.6.

Resultados positivos evidenciam a presença de agliconas flavonoides e seus


heterosídios.

4.4.2. Abordagem fitoquímica para o extrato clorofórmico do TCC


4.4.2.1. Determinação dos extrativos (esta determinação foi feita seguindo a
metodologia apresentada no item 4.4.1.1)
4.4.2.2. Separação de bases orgânicas

Uma porção do extrato foi colocada em um funil de separação e adicionado HCl 0,1N
em três porções sucessivas, seguida de lavagem final com água destilada. As frações
orgânicas foram reunidas e reservadas, já as frações aquosas foram alcalinizadas com NH 4OH
e as bases orgânicas extraídas após as três lavagens com éter-clorofórmio (3+1). As soluções
aquosas foram reservadas e as etéreas filtradas e divididas em duas porções. Em uma das
porções anteriormente dividida foram adicionados HCl 1N em três lavagens para a separação
da fase aquosa ácida.

4.4.2.3. Teste para presença de alcalóides

Uma alíquota da solução aquosa resultante do item 4.4.2.2 foi dividida em três tubos
de ensaio e adicionados três gotas de um dos reagentes de precipitação de alcalóides: Hager,
Mayer e Dragendorff.

A formação de precipitado floculoso é indicativo da presença de alcalóides.

4.4.2.4. Teste para bases quartenárias

A fase aquosa reservada no item 4.4.2.2 foi acidulada com ácido acético até pH 4-5 e
adicionado 0,5mL do reagente de Hager.

A formação de precipitado indica a presença de bases quartenárias ou alcalóides


anfóteros.
Natália de Freitas Oliveira Página 111

4.4.2.5. Separação de ácidos fortes

O extrato etéreo obtido no item 4.4.2.2 foi tratado em um funil de separação com
NaHCO3 2%. Após três lavagens sucessivas, foi feita uma lavagem final com água destilada.
As soluções orgânicas foram reunidas e reservadas, já as soluções aquosas prosseguiram para
tratamento. Nestas foram adicionadas HCl concentrado até atingir pH 1 e a extração dos
ácidos livres foi feita com éter etílico e reservada.

4.4.2.6. Teste para ácidos fixos fortes

Uma parte da fração etérea resultante do item 4.4.2.5 foi concentrada até a secura e
submetida ao mesmo teste descrito no item 4.4.1.9.

4.4.2.7. Separação dos ácidos fixos fracos e fenóis

Uma alíquota do extrato orgânico privada das bases, reservado no item 4.4.2.2, foi
colocado em um funil de separação e os ácidos fracos e fenóis foram extraídos por lavagens
sucessivas de NaOH 2%, cujas fases orgânicas foram reunidas e reservadas para testes
posteriores e as fases aquosas acidificadas com HCl concentrado até pH 2-3 e extraída com
éter etílico. A fase etérea foi reservada para testes posteriores.

4.4.2.8.Teste para constituintes fenólicos em meio alcoólico

A fase orgânica reservada no item anterior foi dividida e uma parte concentrada em
banho-maria até a secura e redissolvida em etanol. Em seguida, foram aplicados os testes
conforme os itens 4.4.1.3 a 4.4.1.6.

4.4.2.9.Teste para constituintes fenólicos em meio aquoso

A solução etérea obtida no item 4.4.2.8 foi aplicada nos testes descritos nos itens
4.4.1.9 e 4.4.1.10.

4.4.2.10. Teste para constituintes neutros


Natália de Freitas Oliveira Página 112

A solução orgânica reservada no item 4.4.2.5 foi tratada com Na2SO4, filtrada e
dividida em duas porções, as quais foram direcionadas para a hidrólise alcalina e a separação
de ácidos existentes.

4.4.2.11. Hidrólise alcalina

Uma das porções do teste anterior (4.4.2.10) foi concentrada, pesada e dissolvida em
10 mL de metanol e NaOH 70% em quantidades equivalentes (mL/g). A mistura foi aquecida
sob constante agitação de modo que a saponificação fosse completa.

4.4.2.12. Separação da fração insaponificável

Ao extrato saponificado resultante do item 4.4.2.11 foram adicionados 100 mL de


água destilada e levado a aquecimento sob agitação até sua completa homogeneização. Em
um funil de separação, foi acrescentado o material homogeneizado e éter; observou-se a
formação de duas fases, que foram separadas. O processo se repetiu por mais duas vezes
sucessivas. As frações aquosas reunidas foram reservadas e a solução etérea foi lavada com
água e seca com Na2SO4. O material foi concentrado e dividido em três porções.

4.4.2.13. Teste para esteróides e triterpenóides após a hidrólise alcalina

O subproduto insaponificável resultante da hidrólise foi redissolvido em clorofórmio e


o teste foi realizado de acordo com o descrito no item 4.4.1.8.

4.4.2.14. Separação de ácidos do extrato saponificado

A solução aquosa do item 4.4.2.10 foi acidulada até pH 2-3. Após o resfriamento da
solução, foi adicionado éter etílico. A solução aquosa foi concentrada e reservada para estudos
posteriores, já a etérea foi lavada com água e tratada com Na2SO4, filtrada e dividida em
quatro porções, estas frações foram concentradas em banho-maria.

4.4.2.15. Teste para fenóis

Uma fração da solução etérea do item 4.4.2.12 foi dissolvida com 3 mL de etanol
70%, filtrada e dividida em tubos de ensaio. Em seguida, foram aplicados os testes conforme
aos itens 4.4.1.3 a 4.4.1.6.

4.4.2.16. Teste para ácidos fixos fortes


Natália de Freitas Oliveira Página 113

Outra fração resultante da solução etérea do item 4.4.2.12 foi dissolvida com 0,5mL de
etanol, acrescentado 1 mL de NH4OH concentrado e o teste foi prosseguido de acordo com o
item 4.4.1.10.

4.4.3. Rendimento e classificação dos componentes químicos finais da abordagem


fitoquímica
As frações com melhor rendimento foram submetidas a vários testes de classe de
constituintes anteriormente citados e verificados quanto ao seu isolamento em Cromatografia
em Camada Delgada (CCD). Foram utilizados diversos sistemas de eluentes e reveladores.

Para este procedimento foram utilizadas como fase estacionária placas elaboradas com
sílica gel 60G, adquirida da Vetec, e diversos eluentes como fase móvel, variando o tipo e a
proporção conforme o comportamento da fração analisada, sendo eles: acetato de etila, água,
ciclohexano, clorofórmio, diclorometano, dietilenolamina, hexano, hidróxido de amônio,
metanol, TBA (n-Butanol- Ác. Acético-Água), tolueno.

Para revelar as classes dos compostos foram utilizados reveladores universais, como
vapores de iodo e H2SO4-CH3OH (1:1), e reveladores específicos como: anisaldeído sulfúrico,
cloreto férrico 3%, Dragendorff nitrogenado, Dragendorff modificado, ninhidrina e outros.

4.5. Separação dos constituintes do TCC

Após determinação do perfil fitoquímico, verificou-se a presença de três grandes


grupos de metabolitos: compostos fenólicos, compostos lipofílicos e os compostos
nitrogenados. Estes grupos foram estudados separadamente, procurando-se o melhor método
de isolamento e caracterização dos constituintes existentes.

4.5.1. Compostos fenólicos


4.5.1.1.Extração específica para compostos fenólicos

O processo de extração se deu de acordo com as metodologias adaptadas de Simões


(2007). O autor mostra dois processos de extração: Metanol: H2O e Acetona: H2O. A extração
Acetona: H2O tem um maior rendimento na extração em relação a Metanol: H2O, mas contém
uma estabilidade inferior. Já a solução Metanol: H2O obtém um produto mais selecionado,
facilitando, assim, os métodos qualitativos, enquanto para uma extração quantitativa se utiliza
Acetona: H2O.
Natália de Freitas Oliveira Página 114

Extração com Acetona 50%

A extração se deu por percolação, onde 25g do tegumento foram transferidos para um
erlenmeyer, e adicionados 500 mL de acetona 50% em água. Deixou-se em repouso durante
48 horas e, após vigorosa homogeneização em ultrassom por 15 min, o material foi filtrado
usando papel de filtro qualitativo.

Extração com metanol 70%

Em um erlenmeyer com 500 mL de MeOH 70% foi adicionado 25g do tegumento e


deixado em repouso por 48 h, e em seguida levou-se para ultrassom por 15 min. Observou-se
a formação de uma névoa entre a parte solúvel em solução metanólica e o precipitado, então
se optou por uma nova extração.

4.5.1.2.Análises para caracterização dos extratos

As amostras resultantes foram concentradas em banho-maria e testadas


qualitativamente para a presença de fenóis, taninos, antocianinas, antocianidinas, flavonóides,
leucotocianidinas, catequinas, flavonas, flavonóis, flavononóis e xantonas, de acordo com
Matos (2009).

4.5.2. Compostos lipofílicos


4.5.2.1.Extração especifica para compostos lipofílicos (Esteróides e triterpenóides)

Uma amostra com 50g do tegumento foi colocada em contato com 500 mL de
clorofórmio em um recipiente fechado por 24 h. Após este período, o extrato foi filtrado e
concentrado à vácuo em rotaevaporador até a completa eliminação do solvente.

4.5.2.2.Separação e purificação dos compostos lipofílicos (Esteróides e triterpenóides)

No processo de separação e purificação dos componentes de extratos e frações foram


utilizadas colunas cromatográficas. O extrato concentrado foi submetido a uma coluna de
vidro tendo como fase estacionária sílica gel (0,2 – 0,5mm) da Merck, sua eluição se deu por
diversos solventes, no qual a polaridade era aumentada gradativamente a depender dos
resultados observados em CCD.

4.5.2.3. Testes de Liebermann - Burchard e Salkowski


Natália de Freitas Oliveira Página 115

A amostra seca foi diluída no solvente originário a um volume de 2 mL e em seguida


dividida em duas porções. Em cada um dos tubos realizaram-se as reações de Liebermann-
Burchard e Salkowski.

 Liebermann - Burchard: 1 mL de CHCl3, 1 mL de anidrido acético e 3 gotas de


H2SO4conc. (MATOS, 2009).
- Coloração azul evanescente seguido de verde permanente é indicativa de esteroides livres.
- Coloração parda até vermelha indica triterpenóides pentacíclicos livres.

 Salkowski: 1 mL de H2SO4 conc.


- Coloração amarela a roxo-sangue indica a presença de núcleo esteroidal.
- Coloração azul a verde indica a presença de triterpenos.

4.5.2.4. Extração do LCC

O LCC é composto por doze compostos diferentes, dependendo da forma como é


obtido industrialmente. Na literatura existem diversas formas e solventes usados para extração
do LCC, optou-se por dois métodos: extração a frio e a quente por soxhlet, usando etanol e
hexano.

As amostras da casca de castanha de cajú (CCC) (Figura 4.2) foram moídas em


moinho de facas em três bateladas.

FIGURA 4.2 - Casca da castanha in natura e após a moagem.

Fonte: Autora.

Extração do LCC à frio


Natália de Freitas Oliveira Página 116

Uma amostra de 106,04g de casca da castanha de cajú moída foi adicionada em um


recipiente com 1L da mistura de n-hexano: EtOH (1:1), mantido a Tamb por 7 dias com
agitação frequente. Em seguida o extrato foi filtrado e concentrado em rotaevaporador, a
matéria sólida resultante foi novamente colocada em contato com um novo solvente EtOH
70% (500 mL) e deixada por mais 7 dias, filtrada e concentrada em rotaevaporador.

Extração do LCC à quente com sohxlet

Uma amostra de 105,03g de casca da castanha de cajú moída foi adicionada em uma
cápsula de papel de filtro com algodão e n-hexano em soxhlet (Figura 4.3 (a)), mantidos sob
temperatura constante por 24 h. Em seguida o extrato foi filtrado e concentrado em
rotaevaporador (Figura 4.3 (b)). A matéria sólida resultante, de peso 80,17g, foi novamente
colocada em contato com um novo solvente EtOH em soxhlet e deixada por mais 24 h,
filtrada e concentrada em rotaevaporador.

FIGURA 4.3 – Sohxlet (a) e Rotoevaporador (b).

Fonte: Silva, 2012.

As substâncias puras e distintas ao LCC foram recromatografadas em uma micro-


coluna tipo flash com sílica gel e as frações purificadas resultantes das microcolunas e da
coluna principal observadas pelos testes citados anteriormente, foram levadas para análises
em IV.
Natália de Freitas Oliveira Página 117

4.5.3. Compostos nitrogenados


4.5.3.1.Isolamento específico para alcalóides

Existem vários métodos de isolamento de alcalóides, sendo que o mais utilizado é


aquele que utiliza ácidos minerais, por apresentarem caráter básico. Na presença de ácido,
estes são convertidos em sais, facilitando o seu processo de extração e isolamento
(Fluxograma 4.6). Para o uso do método de extração de alcalóides em meio alcalino, é
necessário um desengorduramento prévio do material vegetal com solventes apolares, com a
finalidade de retirar substancias que possam interferir nas extrações através da formação de
emulsões. O fluxograma 4.6 mostra um tratamento da torta desengordurada com hidróxido de
amônio e ácido clorídrico, resultando em três frações finais (SIMÕES, 2007; COSTA 2000;
SILVA, 2007).
Natália de Freitas Oliveira Página 118

FLUXOGRAMA 4.6 - Extração e isolamento de alcalóides em meio ácido.

Torta desengordurada (37 gramas)

Alcóol 70% / 24h


Banho ultrassônico por 1hora
Concentração em rotaevaporador

Extrato hidroalcoólico

- Alcalinização NH4OH 6N
- Extração com Acetato de etila

Fase alcalina Fase Orgânica

- HCl diluído

Fase aquosa (Alcalóides) Fase Orgânica

- Alcalinização NH4OH 6N
- Adição de acetato de etila
Cromatografia em coluna (Coluna 2)

Fase aquosa alcalina Fase orgânica (Ac. Etila)

- Concentração em rotoevaporador
Cromatografia em coluna (Coluna 3)

Alcalóides finais
Natália de Freitas Oliveira Página 119

Todas as amostras finais foram concentradas e as mais promissoras foram levadas para
testes de alcalóides, sais de amônio e bases quaternárias. Além disso, as amostras também
foram submetidas a análise cromatografica, e duas frações do isolamento de alcalóides foram
reservadas para análises em IV, por estarem praticamente puras e apresentarem uma
quantidade significativa de material.

4.5.3.2. Extração específica de sais de amônio

Foram testadas diversas formas de extrair sais do TCC, mas nenhuma metodologia,
após testes confirmatórios e análises cromatográficas, estava correspondendo às expectativas.
Buscou-se uma adaptação de Costa (2000), na qual foi feita uma varredura por meio de
extratos polares e apolares e dois tratamentos distintos, ácido e alcalino. Foram usados 50g de
matéria seca e 500mL do solvente (lipofílico ou hidrofílico).

As amostras finais foram concentradas em banho rotativo a 60°C até a secura. Os sais
obtidos e amostras secas foram recristalizados e avaliados por CCD, testes qualitativos e IV.

4.6. Espectrofotometria na região de ultravioleta visível (UV)

A determinação do espectro de absorção foi realizada após diversas diluições das


amostras resultantes em seus respectivos solventes. Em seguida foi feita a varredura em
espectro na faixa de comprimento de onda de 200 a 700 nm.

4.7. Espectroscopia na região do infravermelho (IV)

Os espectros na região do infravermelho (IV) foram registrados em espectrofotômetro


(Spectrum 65 FT-IR Spectrometer, Perkin Elmer) com um amostrador universal acoplado
(Universal ATR sampling Acessory, Perkin Elmer). A faixa de análise foi de 650 a 4000 cm-1.
As frequências de absorção foram medidas em unidades de número de ondas (cm -1). Utilizou-
se pastilha de KBr contendo aproximadamente 1% de amostra. Foram realizadas 12
varreduras para cada amostra.
Natália de Freitas Oliveira Página 120

4.8. Avaliação da potencialidade do TCC como inibidor de oxidação em óleos vegetais


4.8.1. Preparo dos extratos do tegumento

O tegumento foi submetido a duas metodologias de extração, considerando-se o


desengorduramento e a variação de temperatura, obtendo-se quatro tipos de extratos:

 Extrato metanólico a frio (MF);


 Extrato metanólico a quente (MQ);
 Extrato metanólico desengordurado a frio (MDF);
 Extrato metanólico desengordurado a quente (MDQ).

Cem gramas de amostra foram inicialmente extraídos com hexano (três vezes com um
total de 1,5 L de hexano) à temperatura ambiente. O subproduto desengordurado foi lavado
com água destilada para remover açúcares solúveis e proteínas. Dez gramas do subproduto
resultante foram extraídos com metanol. O extrato foi filtrado, o solvente removido em um
evaporador rotativo abaixo de 40 ° C, pesados e armazenados a 4 °C para posterior utilização.

4.8.2. Seleção dos óleos

A seleção de óleos de ensaio baseou-se na presença de composição variável de ácidos


graxos poliinsaturados. Foram selecionados o óleo de girassol (OG), que inclui elevado teor
de ácido linoleico (18:02 n -6), e o óleo de canola (OC), que é rico em ácido linolênico-α
(18:03 n -3), além de ácido linoleico. Teste de forno Schaal (FENNEMA, 1976) foi realizado
para avaliar o efeito dos antioxidantes contra a oxidação durante o armazenamento oxidativo
acelerado de óleos.

4.8.2.1.Refino dos óleos em escala laboratorial


Degomagem

O processo de degomagem foi adaptado da metodologia descrita por Moretto e Fett


(1989), a qual se baseia na afinidade dos fosfolipídios pela água, formando micelas diretas ao
entrar em contato, facilitando, assim, o processo de separação do meio aquoso por
centrifugação (SEGERS; VAN DER SANDE, 1990; OCHOA et al., 2001). Foi adicionado ao
óleo filtrado 3-5% de água e mantidos sob agitação por 30 min com o óleo previamente
aquecido entre 65-80°C. Em seguida o óleo foi colocado em um funil de decantação para a
separação da fase aquosa do óleo e levado a centrifugação para finalizar o processo.
Natália de Freitas Oliveira Página 121

Neutralização

O método consiste em neutralizar os ácidos graxos livres com um álcali (hidróxido de


sódio) e assim diminuir o teor de ácidos graxos livres presentes no óleo e outras impurezas.
Ao óleo degomado foram adicionadas soluções de NaOH (5 a 30 °Be) variando de 10 a
30%v/v para os óleos de girassol e canola e mantidos sob agitação constante por 30 minutos.
Em seguida, as soluções foram aquecidas a 65-80°C, para quebrar a emulsão formada.
Posteriormente, o óleo neutralizado foi centrifugado e filtrado a fim de separar as fases óleo-
sabão (borra) e lavado com água aquecida a 90°C. Por fim, o óleo foi submetido à filtragem
com Na2SO4 anidro e armazenado em frasco âmbar até as futuras análises.

4.8.3. Testes em forno Schaal

Os extratos da película da castanha de cajú foram adicionados a OC e OG (livre de


qualquer antioxidante) na concentração de 200 ppm, com base no peso do óleo em uma série
de garrafas de vidro livres de contato com o ar e luminosidade, para examinar sua atividade
antioxidante. BHA a 200 ppm também foi aplicado para comparação. As amostras de óleo
enriquecido em antioxidantes foram submetidas à oxidação acelerada no escuro, em estufa a
70 ° C durante 72 h. As amostras (16 g) foram removidas periodicamente a cada 0, 4, 8, 12,
24, 48 e 72 h para análise. Imediatamente após o período de armazenamento, as amostras
foram mantidas sob refrigeração até o início das análises, estas feitas em quadruplicatas,
divididas em duas bateladas da simulação oxidativa.

4.8.4. Procedimentos analíticos

4.8.4.1. Índice de acidez (IA)

A determinação do índice de acidez foi realizada de acordo com a metodologia do


Instituto Adolfo Lutz (2008), em triplicata, com 1,0g de óleo em cada erlenmeyer de 250 mL,
aos quais foram adicionados 25 mL de solução éter-álcool na proporção 2:1, previamente
neutralizada com solução 0,1 mol/L de NaOH. Em seguida, foram adicionadas duas gotas de
fenolftaleína e tituladas com solução 0,1 mol/L de NaOH até completa neutralização.
Natália de Freitas Oliveira Página 122

O índice de acidez é obtido através das equações (1, 2 ou 3):

𝑉×𝑓×100
𝐼𝐴 = Acidez em solução molar (%) ou (1)
𝑃

𝑉×𝑓×5,61
𝐼𝐴 = Índice de acidez ou (2)
𝑃

𝑉×𝑓×𝑀×28,2
𝐼𝐴 = Acidez em ácido oleico. (3)
𝑃

Onde, IA = índice de acidez; V = volume (mL) da solução de NaOH gasto na titulação; f =


concentração da solução de NaOH, 5,61 = fator de correção da solução de NaOH; P = massa
em g da amostra; M = molaridade do ácido oleico.

4.8.4.2. Índice de iodo (II)

O índice de iodo de um óleo ou gordura é a medida do seu grau de insaturação e


expresso em termos do número de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra (%
iodo absorvido). O método de Wijs é aplicável a todos os óleos e gorduras normais que não
contenham ligações duplas conjugadas.

Pesou-se 0,25 g do óleo em um Erlenmeyer de 500 mL com tampa. Adicionou-se 10


mL de tetracloreto de carbono e 25 mL de solução de Wijs. O frasco foi tampado e agitado
suavemente para uma perfeita homogeneização. Em um ambiente sob abrigo da luz e a
temperatura ambiente, os erlenmeyers foram deixados em repouso por 30 minutos. Após este
intervalo de tempo, foi acrescentado 10 mL da solução de iodeto de potássio a 15% e 100 mL
de água recentemente fervida e fria e, em seguida, titulado com solução de tiossulfato de
sódio (0,1 ou 0,01M) até o surgimento de uma fraca coloração amarela, que após apresentada
é adicionado 1 a 2 mL de solução indicadora de amido 1%, surgindo assim uma coloração
azul, e a titulação é continuada até a completa descoloração. O branco foi preparado nas
mesmas condições e titulado, de acordo com IAL (2008).

O índice de iodo foi obtido através da equação (4):

(𝑉𝐵 −𝑉𝐴 )×𝑀×12,88


𝐼𝐼 = (4)
𝑃

Onde: VB = no de mL gasto na titulação do branco, VA = no de mL gasto na titulação da


amostra, M = Molaridade do tiossulfato, P = n° de g da amostra.
Natália de Freitas Oliveira Página 123

4.8.4.3. Índice de peróxido (IP)

Este método determina todas às substancias, em termos de miliequivalentes de


peróxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potássio nas condições do teste.
Estas substâncias são geralmente consideradas como peróxidos ou outros produtos similares
resultantes da oxidação da gordura. O teste foi aplicado de acordo com a metodologia de
Heeler (1932) com adaptações. Foi pesado 1g de óleo e adicionado 30mL da solução ácido
acético-clorofórmio 3:2 e agitado até a dissolução da amostra. Adicionou-se 1 mL da solução
saturada de KI e deixou-se em repouso ao abrigo da luz por exatamente um minuto.
Acrescentou-se em seguida 10 mL HCL 1N e titulou-se com solução de tiossulfato de sódio
0,1 ou 0,01N, com constante agitação até que a coloração amarela tenha quase desaparecido.
Adicionou-se 1 mL de solução indicadora de amido e continuou-se a titulação até o completo
desaparecimento da coloração azul. O branco foi preparado nas mesmas condições e titulado.

O índice de peróxido foi obtido através da equação (5):

(𝐴)×𝑁×𝑓×10000
𝐼𝑃 = (5)
𝑃

Onde: A = Vol. (mL) da solução de tiossulfato de sódio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulação da
amostra, N = normalidade da solução de tiossulfato de sódio, f = fator da solução de
tiossulfato de sódio, P = Peso (g) da amostra.

4.8.5. Determinação do coeficiente de extinção específica por absorção na região de


ultravioleta visível

A análise espectrofotométrica na região do ultravioleta mostra a qualidade de um óleo,


seu estado de conservação e alterações causadas no seu processamento. A absorção em 232 e
270nm, comprimentos de onda especificado no método, é devida à presença de sistemas
contendo dienos e trienos conjugados, respectivamente, que são formados por oxidação e/ou
refino do óleo. A análise foi realizada de acordo com o método descrito pela IUPAC (1979),
utilizando-se Espectrofotômetro Ultravioleta Visível (UV-VIS), marca Espectrônic (Modelo
Gênesis-2), e as medidas da absorbância efetuadas no comprimento de onda de 232 e 270 nm.
Para tal, colocou-se cerca de 0,25 g de óleo em balão volumétrico de 25 mL, completou-se o
volume do balão com ciclohexano e homogeneizou-se (solução A). Transferiu-se 5 mL desta
solução e diluíu-se a 25 mL com o ciclohexano em balão volumétrico (solução B). Para a
leitura utilizou-se célula de quartzo de 1 cm e ciclohexano como branco.
Natália de Freitas Oliveira Página 124

O índice da extinção específica foi obtida através da equação (6):

𝑨𝝀
𝑲𝝀 = (6)
𝒄×𝒍

Kλ = extinção especifica no comprimento de onda λ

Aλ = absorbância medida no comprimento de onda λ

c =concentração da solução em g/100 mL

l = caminho ótico da cubeta (cm).

4.8.6. Atividade antioxidante pelo método β caroteno/ ac.linoleico

A atividade antioxidante total de extratos foi medida de acordo com o método de


Velioglu et al. (1998) e Lu e Foo (2000). Um mililitro de solução de β-caroteno (0,2 mg / mL
de clorofórmio) foi pipetada para um balão de fundo redondo (50 mL) contendo 0,02 mL de
ácido linoleico e 0,2 mL de Tween 20. A mistura foi evaporada a 40 ° C durante 10 minutos
por meio de um evaporador rotativo para remoção do clorofórmio. Após evaporação, a
mistura foi imediatamente diluída com 100 mL de água destilada, que foi adicionada
lentamente à mistura com agitação vigorosa para formar uma emulsão.

Alíquotas de 5 mL da emulsão foram transferidas para tubos de ensaio contendo


diferentes amostras de 0,2 mL em etanol a 70% a 1mg/mL. Os tubos foram agitados e
colocados em banho a 45 °C por 2 h. A absorbância das amostras foi medida a 470 nm
utilizando espectrofotômetro no tempo inicial (t=0) foi medido contra um branco, consistindo
numa emulsão sem β-caroteno. Padrões na mesma concentração das amostras foram
utilizados como comparação; 0,2 mL de etanol a 70% em 5 mL da emulsão referida foi
utilizada como controle. A medição foi efetuada em intervalos de 15 min até 120 min. Todas
as determinações foram realizadas em triplicata.

Atividade antioxidante (AA) foi calculada, utilizando a equação (7):

(𝐴 −𝐴 )
𝐴𝐴 = (1 − (𝐴𝑂0 −𝐴𝑜𝑡 )) × 100 (7)
0 𝑡

Onde AoO e AtO são os valores de absorbância medidos no tempo de incubação inicial
das amostras e do controle, respectivamente, enquanto Ao e At são os valores de absorbância
medidos nas amostras e do controle a t = 120 min.
Natália de Freitas Oliveira Página 125

4.8.7. Compostos fenólicos totais (CFT)

A determinação foi conduzida de acordo com Correia (2004). Uma alíquota de 1 mL dos
extratos foi transferida para tubos de ensaio, aos quais se adicionou, na sequência, 1 mL de
solução etanol 95%, 5 mL de água destilada e 0,5 mL de reagente Folin-Ciocalteau 1N. De
imediato, ocorreu a homogeneização. Transcorridos cinco minutos, foi adicionado 1 mL de
solução de carbonato de sódio 5% (p/v), seguindo-se nova homogeneização.

Os tubos de ensaio foram mantidos em câmara escura por 60 minutos e


homogeneizados. As amostras tiveram suas absorbâncias medidas no comprimento de onda
de 625 nm e comparadas à amostra padrão (branco), constituído por solução etanólica a 95%.
A curva de calibração foi construída a partir de diferentes concentrações de ácido gálico, a
fim de converter as absorbâncias em miligramas equivalente de ácido gálico por grama de
peso fresco da amostra (mg GAEQ /g amostra).

4.8.8. Método ASTM D7545 (PetroOXY)

As análises para determinação da estabilidade oxidativa dos óleos vegetais foram


realizadas no equipamento PetroOXY da Petrotest 413 (Figura 4.4). Adicionou-se 5,0 mL da
amostra a temperatura ambiente e pressurizou-se com atmosfera de oxigênio a 101,5 Psi
(aproximadamente a 700 kPa). Após a adição da amostra elevou-se a temperatura até 110 ºC e
uma pressão máxima que varia de acordo com a natureza da amostra. O período de indução
oxidativa é dado como o tempo necessário para que a amostra absorva 10% da pressão de
oxigênio disponibilizada para o teste.
Natália de Freitas Oliveira Página 126

FIGURA 4.4 - Apresentação do funcionamento esquemático do PetroOXY.

Fonte MOREIRA, 2012.

O percentual de proteção foi calculado de acordo com a equação (8)

(𝐸𝑂𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 −𝐸𝑂𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 )
% 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒çã𝑜 = × 100 (8)
𝐸𝑂𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒

Onde EO são os valores da estabilidade oxidativa obtidos pelo PetroOxy (min).

4.9.Análise estatística

Todas as análises foram realizadas em triplicata e os dados relatados como média ±


desvio padrão (SD). A análise estatística dos resultados sobre a homogeneidade dos grupos
para as variáveis investigadas foi realizada aplicando-se a Análise de Variância (ANOVA)
(p<0,05). As diferenças entre as médias aritméticas dos grupos foram comparadas pelo teste
Tukey de múltipla comparação com nível de significância de 5%.

Foi calculado o coeficiente de correlação entre os métodos CFT, Atividade


antioxidante, Oxidação em PetroOxy, tempo de oxidação, Índice de peróxido, Índice de
acidez, com intuito de verificar possíveis correlações entre os mesmos.
Natália de Freitas Oliveira Página 127

Capítulo 5

Resultados e discussão
Natália de Freitas Oliveira Página 128

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O presente capítulo foi dividido em duas partes, a primeira apresenta e discute a


obtenção e caracterização de alguns dos metabólitos secundários existentes no Tegumento
da Castanha de cajú (TCC). A segunda etapa trata dos resultados experimentais obtidos com
os compostos fenólicos extraídos do Tegumento da Castanha do Cajú.

5.1.Caracterização fitoquímica do Tegumento da Castanha de cajú (TCC)

As análises fitoquímicas foram realizadas com o objetivo de elucidar os constituintes


químicos presentes na espécie vegetal A. occidentale. Quando não se dispõe de estudos
químicos completos sobre a espécie de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode indicar
os grupos de metabólitos secundários relevantes das mesmas (NAKASHIMA, 1993;
FALKENBERG, SANTOS; SIMÕES, 1999).

Os ensaios de identificação dos constituintes químicos presentes no TCC foram


realizados de acordo com a metodologia descrita por Matos (2009). Os extratos hidrofílico e
clorofórmico foram avaliados fitoquimicamente com a finalidade de fazer o levantamento dos
metabólitos secundários presentes. Estes extratos mostraram um rendimento médio de 44,6 e
82,6% respectivamente, mostrados na tabela 5.1. Tem-se que o tegumento apresenta mais
compostos apolares que polares em massa seca.

TABELA 5.1 - Rendimento dos constituintes dos extratos hidroalcoólico e clorofórmico.


Rendimento da
Volume da Concentração do extrato inicial Massa seca
Extrato massa seca
amostra (mL) (g/mL) (g)
(%)
Hidrofílico 10 0,05 0,2228 44,6
Clorofórmico 10 0,05 0,4126 82,6

A abordagem fitoquímica realizada com os extratos hidroalcóolico e clorofórmico do


tegumento indicou a presença de várias classes de metabólitos secundários, como: ácidos
fixos fortes, ácidos fixos fracos, ácidos graxos, alcalóides, antranóis, bases quartenárias,
catequinas, esteroides, fenóis, flavononas, flavonóis, quinonas, resinas, saponinas, taninos
catéquicos, taninos pirogáticos e triterpenóides, conforme mostrado na tabela 5.2. Ao se
comparar a abordagem feita neste trabalho e em diferentes estudos encontrados na literatura,
tem-se que este trabalho abrangeu um maior número de compostos e testes, fazendo assim
uma abordagem completa e mostrando a presença de mais compostos que antes não haviam
sido detectados. Os constituintes químicos anteriormente identificados no tegumento da
Natália de Freitas Oliveira Página 129

castanha de cajú correspondiam as seguintes classes: catequinas, epicatequinas, esteróis,


fenólicos, flavonóides, óleos voláteis, taninos, terpenóides e xantonas (CHAVES et al., 2008;
KANAN et al., 2009; KUNARE; SETHURMAN, 2003; MATHEW; CARTY; PALENIK,
1970; PILLAI, 1963).

TABELA 5.2 - Resultado do Perfil fitoquímico do Tegumento da Castanha de Cajú (TCC).


Abordagem Fitoquímica
Extrato
Extrato Hidrofílico
Teste Clorofórmico
Direto Hidrolisado Direto Hidrolisado
Ácidos fixos fortes N P NC N
Ácidos fixos fracos - P P -
Ácidos graxos P P P P
Alcalóides P - P -
Antocianidinas N N N N
Antocianinas N N N N
Antranóis - P N N
Auronas N N N N
Bases quartenárias P - P -
Catequinas P N P P
Chalconas N N N N
Cumarina - - - -
Esteroides P P - N
Fenóis simples P P NC NC
Flavonas NC NC NC NC
Flavonóis NC NC P N
Flavanonas P P N N
Flavanonóis NC NC NC N
Glicerina - - - -
Heterosídeos cianogênicos NC NC N N
Leucoantocianidinas NC N N N
Quinonas - P N N
Resinas P - - -
Saponinas P - P P
Taninos catéquicos P NC P P
Taninos pirogáticos P - N NC
Triterpenóides NC N - P
Xantonas NC - NC N
P= Positivo; N= Negativo; NC=Não Conclusivo; (-) = Não realizado.

Ao analisar a tabela 5.2 tem-se a presença de ácidos fixos fortes, alcalóides,


catequinas, flavonóides, saponinas e taninos; tanto em extratos polares como apolares,
confirmando assim a presença marcante destes compostos no TCC.

Todas as amostras finais e subfrações foram concentradas e submetidas a


procedimentos de cromatografia em camada delgada (CCD) a fim de confirmar o perfil
fitoquímico, determinando as principais classes de compostos presentes, e também
Natália de Freitas Oliveira Página 130

selecionando as frações a serem ultilizadas para posterior fracionamento, bem como os


solventes a serem utilizados no processo de purificação das frações, além de terem sido
submetidas a vários outros testes, mostrados na tabela 5.3.

TABELA 5.3 – Análise qualitativa de frações da caracterização fitoquímica.


Peso da matéria Testes qualitativos
Frações
seca (g) positivos
Separação das bases orgânicas F. Aquosa
0,4353 Alcalóides
(Lavagem com HCl).
Separação das bases orgânicas F. Orgânica Alcalóides e bases
6,197
(Lavagem com HCl). quartenárias
Separação das bases orgânicas F. Orgânica
0,4281 Alcalóides
(Final).
Flavonóis, flavononas e
Separação dos ácidos fortes F. Orgânica. 7,9073
xantonas
Separação dos ácidos fixos fracos e fenóis F.
5,4599 Catequinas
Orgânica.
Separação dos ácidos fixos fracos e fenóis F.
6,6962 Taninos
Orgânica.
Separação dos ácidos do material
0,0979 Sais de amônio
saponificado F. Orgânica.
Teste para alcalóides F. Aquosa “EC”. 6,0722 Alcalóides
Teste para ácidos fixos fortes F. Orgânica 1,4215 Fenólicos

Todos os alcalóides, sais e bases quaternárias foram evidenciados em CCD por


apresentarem revelação em ninhidrina, Dragendorf e reveladores específicos para estes, a
maioria aparenta estar isolada ou em mistura de fácil separação, os quais foram reservados
para análises posteriores, que fogem do escopo deste trabalho.

5.2. Isolamento e caracterização de metabólitos do TCC

Após a abordagem fitoquímica, as análises por CCD e teste de identificação de


metabólitos secundários foi necessário aprofundar as análises e os conhecimentos dos
componentes químicos do tegumento, por observar a grande quantidade de metabólitos
lipofílicos, nitrogenados e compostos fenólicos.

5.2.1. Compostos lipofílicos

Os compostos encontrados no extrato clorofórmico despertaram interesse, além de


apresentar um rendimento de 82,6%, nas suas frações resultantes e intermediárias da
abordagem fitoquímica demonstraram que o extrato é rico em importantes metabolitos
secundários.
Natália de Freitas Oliveira Página 131
Natália de Freitas Oliveira Página 132

5.2.1.1.Cromatografia em coluna para isolamento de compostos apolares

Para avaliar a separação das substâncias apolares via cromatografia em coluna,


empregou-se a cromatografia em camada delgada, retirando uma alíquota de cada fração para
a microanálise. Esta coluna foi elaborada com o extrato clorofórmico concentrado,
denominada COLUNA 1. Iniciou-se a eluição com hexano 100%, posteriormente utilizou-se
misturas de hexano e CHCl3, aumentando gradativamente a polaridade com acetato de etila e
finalizando com MeOH-água (80%), conforme demonstra a figura 5.1. Foram coletadas 104
frações, com volume de 20 mL. As frações foram avaliadas por CCD e as frações que tiveram
perfil semelhante foram reunidas. As frações que apresentaram um perfil de substância única
e de maior rendimento foram recromatografadas e/ou enviadas para testes de terpenos e
esteroides, comparadas com o Líquido da Castanha de Cajú - LCC e as selecionas foram
levadas para análise no infravermelho.
FIGURA 5.1 – Eluições da coluna versus frações coletadas.

A fase móvel utilizada foi variada, assim como seus reveladores. O primeiro ponto de
aplicação representava a primeira fração e não foi observada nenhuma substância presente.
No segundo e no terceiro pontos de aplicação, representando a segunda e terceira frações,
respectivamente, observou-se a presença de substâncias isoladas, variando sua pureza ao
longo da variação de polaridade em 104 frações. Pode-se observar, por meio de CCD, que
algumas frações apresentam o mesmo comportamento e estão puras, estas foram reunidas e
divididas em dois grupos um reservado para outras análises e o outro para uma
recromatografia.
Natália de Freitas Oliveira Página 133

Por estas frações apresentarem caráter oleoso, foi necessário identificar a presença de
esteroides e triterpenóides, pois como foi observado na caracterização fitoquímica há uma
considerável quantidade de saponinas, mostradas na tabela 5.4.

TABELA 5.4 - Resultados dos testes de Liebermann- Burchard e Salkowski.

Frações Resultados
F5-7 Presença de esteróides
F15-17 Leve presença de esteroides
F18 Leve presença de esteroides
F26-29 Presença de esteroides
F46 Presença de esteroides
C1-3 Presença de triterpenóides
C4-9 Presença de esteroides
C10 Presença de esteroides
C13 Presença de triterpenóides
C14 Presença de triterpenóides
C15 Presença de esteroides
C20 Presença de esteroides
C26-27 Presença de esteroides
C29-30 Presença de esteroides
C34-35 Presença de esteroides
C36-41 Presença de esteroides

Antes de qualquer outra análise dos compostos apolares e a partir dos resultados da
tabela 5.4 optou-se por extrair o Líquido da Castanha de Cajú (LCC) para comparar com as
frações das colunas selecionadas para análises espectroscópicas.

O LCC é formado por doze substâncias diferentes, dependendo da forma como é


obtido industrialmente. Sua extração apresenta variações conforme a metodologia, quando
extraído por solvente a frio apresenta uma composição média de ácido anacárdico (65-82%),
cardol (14-20%), cardanol (1-9%), e traços de metilcardol, enquanto à quente contém,
principalmente, cardanol (63-95%), cardol (4-19%), material polimérico (0-21%), e traços de
metilcardol (FRANÇA, 2007). O LCC foi extraído inicialmente com hexano e EtOH,
variando sua concentração e temperatura, os resultados das extrações estão representados na
tabela 5.5.

TABELA 5.5 – Rendimento das diferentes extrações do LCC.


RENDIMENTO DO LCC
Tipo de extração Massa inicial de CCC Peso do LCC Rendimento (%)
Soxhlet n-Hexano 104,76 28,71 27,4
Soxhlet EtOH 80,17 30,01 37,43
A frio n-Hexano: EtOH 106,05 49,97 47,11
Natália de Freitas Oliveira Página 134

A frio EtOH 70% 102,24 34,56 33,8

A extração do LCC das cascas da castanha apresentou rendimentos distintos, no qual o


maior rendimento em massa se deu por extração à frio com Hex/EtOH seguida das extrações
com EtOH, indicando que grande parte dos compostos tem polaridade alta à média como
relatados anteriormente por França (2007).

As amostras da extração do LCC foram comparadas com as frações das colunas


cromatográficas e com o ácido oleico. As frações que obtiveram comportamento semelhante
observado por CCD, foram as F1-3 e a C31-32 da coluna 1, o restante apresentou
comportamento totalmente distinto, evidenciando que o extrato lipofílico da película do cajú
tem vários outros compostos além dos encontrados no LCC, evidenciado pela comparação
dos espectros no IV mostrados nas figuras 5.2 e 5.3.

FIGURA 5.2 – Espectros de infravermelho das frações da cromatografia da coluna 1.

100

90

80

70
T (%)

60

50

F5-7
Polaridade

40
F19-21
F26-29
30
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Comprimento de onda (cm-1)

Ao analisar os espectros no infravermelho das frações da coluna cromatográfica de


compostos apolares do TCC, mostrados na figura 5.2, tem-se que as frações analisadas acima
são praticamente idênticas, e que ao aumentar a polaridade há a intensificação das bandas e o
aparecimento do estiramento OH em 3470cm-1, comparando-os ao Cardonol mostrado na
Natália de Freitas Oliveira Página 135

figura 5.3, tem-se que os compostos se assemelham, mas têm comportamentos carbonílicos
diferentes e bandas em planos distintos, vide tabela 5.6.
FIGURA 5.3 - Espetros do LCC natural (A), ácido anacárdico (B), cardonol (C), LCC
técnico (D).

(A)
(A)

(B)

(C)

(D)

Fonte: Adaptado de Rodrigues (2006).

TABELA 5.6 - Atribuição das absorções na região do IV dos espectros apresentados nas
figuras 5.2 e 5.3.
Natália de Freitas Oliveira Página 136

Fonte: *Resultados adaptados de dados obtidos por França (2007) e Rodrigues (2006).

Os resultados mostrados na tabela 5.6 sugerem e confirmam o que já foi observado


anteriormente por CCD, que além de ácido anacardico e cardonol, há vários compostos
apolares e/ou anfifílicos existentes no extrato TCC (Tabela 5.4).

As frações (F11-13 e C17-19), apresentam por CCD uma única mancha, porém com
alongamentos que podem indicar impurezas. As amostras foram recromatografadas em uma
micro-coluna tipo flash com sílica e as frações purificadas resultantes das micro-colunas e da
coluna principal foram analisadas por diversos testes já citados. A análise em CCD das
frações recromatografadas apresentaram igual comportamento da fração mãe e as frações
eluídas com clorofórmio em ambas as colunas foi a que deu início a extração dos compostos
existentes.

Coluna 1.1

A coluna intitulada 1.1 foi feita com as frações reunidas F11-F13 obtidas da coluna 1
para uma nova CC de sílica gel. Iniciou-se a eluição com hexano 100%, posteriormente
utilizou misturas de hexano e CHCl3 aumentando gradativamente a polaridade, conforme a
figura 5.4. Foram coletadas 43 frações com volumes variados de 5-20mL.

FIGURA 5.4 - Eluições da coluna 1.1versus frações coletadas.

As frações analisadas por CCD revelam que não houve arraste de compostos presentes
na coluna 1.1 (F11-13), entre as frações G4 e G33 e as que apresentaram uma única mancha
Natália de Freitas Oliveira Página 137

em CCD foram levadas para análise em IV, no qual observou-se a presença de


hidrocarbonetos de cadeia longa e a confirmação do seu isolamento, conforme demonstrado
na figura 5.5 e tabela 5.7

FIGURA 5.5 – Espectros


100
de IV das frações
escolhidas 90 da
coluna 1.1.
80
Transmitância (%)

70

60

50

40 G2-3
G34-37
30
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
-1
Comprimento de onda (Cm )

Os espectros da coluna 1.1 demonstram que não há grupo carbonila nas frações
estudadas, observada pela ausência de picos entre 1600-1850cm-1. A absorção em 1047 e
1088cm-1 é compatível com o grupo alquil-éter. A existência de carbono saturado ( –H) em
2958, 2925 e 2859cm-1 (LOPES; FASCIO, 2004; SILVERSTEIN et al., 2007; MCMURRY,
2008). Identificou-se ainda os grupos alquil-amina e/ou aril-alquil-amina (C–N), a 1215 cm-1
na fração G34-37, indicando a presença de amina.

Coluna 1.2

A coluna intitulada 1.2 foi elaborada a partir das frações reunidas C17-19 resultantes
da coluna 1 para uma nova CC de sílica gel. As eluições tiveram como solvente inicial o
hexano, posteriormente foram adicionadas misturas de hexano e CHCl3 aumentando
gradativamente a polaridade até ser finalizado com acetato de etila, conforme a figura 5.6.
Foram coletadas 63 frações com volumes variados de 5-20mL.
Natália de Freitas Oliveira Página 138
Natália de Freitas Oliveira Página 139

FIGURA 5.6 – Eluições da coluna 1.2 versus frações coletadas

Todas as frações foram analisadas por CCD, usando diferentes reveladores e fases
móveis. Observou-se que não houve arraste de compostos prioritários na coluna até a fração
43, e as amostras que apresentaram uma única mancha foram analisadas através dos espectros
no infravermelho conforme demonstrado na figura 5.7.
FIGURA 5.7 - Espectros de IV das frações escolhidas da coluna 1.2.
100

90

80
Transmitância (%)

70

60

50 T44-48
T50
T53-54
40
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
-1
Comprimento de onda (Cm )

A figura 5.7 permite afirmar que as frações da coluna correspondem a uma mesma
substância. As amostras são compostas por um pico de alta intensidade a 1272 cm-1,
Natália de Freitas Oliveira Página 140

indicando a presença do grupo aril-alquil-amina. Aliado a isso, a 3323 cm-1 é observado


estiramento do tipo N–H (aminas primárias e secundárias), e uma provável presença de
insaturações com os picos de (1380 cm-1) e de (2973 cm-1 e 2880 cm-1). É importante destacar
também correspondendo sos picos aproximados, 1450 cm-1 (deformação assimétrica de CH3)
e 1378 cm-1 (deformação simétrica de CH3), indicativos da presença de metila às estruturas
orgânicas (MCMURRY, 2008; SILVERSTEIN et al., 2007).

TABELA 5.7 – Atribuição das absorções na região do IV dos espectros apresentados


nas figuras 5.6 e 5.7
Frequência (cm-1)
Atribuição
G2-3 G34-37 T44-47 T50 T53-54
Estiramento N-H (banda larga)/
- - 3323 3322 3323
Estiramento O-H (banda larga)
2958/2923 2958/2925 2973 2973 2973 Estiramento CH2 e CH3
2874/2860 2859 2880 2877 2878 Estiramento CH2 e CH3
Deformação assimétrica do CH2 e
1459 1459 1450 1450 1450
CH3
1378 1378 1378 1380 1380 Deformação simétrica do CH2 e CH3
- - 1273 - - Estiramento C-N (aril-alquil-amina)
- 1215 - - - Estiramento C-N (aril-alquil-amina)
- - 1088 1088 1087 Estiramento C-O (aril-alquil-éter)
- - 1047 1047 1047 Estiramento C-O (aril-alquil-éter)
- - 880 880 880 Deformação angular de aromáticos
758/724 757 756 - - Deformação angular de aromáticos
621/600 670/600 620 620/600 620/600 Deformação angular de aromáticos
582/574 585/574 588 583 584 Deformação angular de aromáticos
568/555 567 569/552 - 567/552 Deformação angular de aromáticos

Ao analisar as figuras 5.6 e 5.7, e a tabela 5.7 pode-se concluir que as amostras
recromatografadas pertencem a funções distintas, justificando sua separação por meio de
cromatografia.
Natália de Freitas Oliveira Página 141

5.3. Compostos nitrogenados e derivados


5.3.1. Isolamento de alcalóides

Na avaliação quanto a presença de alcalóides, a amostra da planta seca demonstrou


positividade para os testes qualitativos, ocorrendo o aparecimento de precipitado vermelho-
alaranjado para o reagente de Dragendorff, e de precipitado esbranquiçado para o de Mayer,
já anteriormente falados na abordagem fitoquímica. O reagente de Dragendorff constitui uma
solução de K (BiI4) em ácido diluído e forma precipitados laranja avermelhados quando em
contato com alcalóides e compostos nitrogenados. Como se trata de uma reação não
específica para alcalóides, resultados falso-positivos são comuns, devendo o material ser
submetido a uma extração ácido-base para a confirmação da presença e extração dos
alcalóides. Dessa forma, após a extração com etanol, seguida de extração ácido-base, as
frações resultantes e suas subfrações do processo foram submetidas a cromatografia de
camada delgada e revelada com reagente de Dragendorff, apresentando manchas alaranjadas.
Estes testes positivos foram avaliados quanto ao seu rendimento, e os que demonstraram
apresentar compostos de fácil isolamento foram levados para recromatografia.

Coluna cromatográfica 2
Nesta cromatografia foi utilizada uma coluna tipo flash no qual utilizou-se a Fase
orgânica do TCC, obtida do isolamento de alcalóides (Lavado com HCl) com 2,98g e sílica
50g, tendo como volume amostral 10 mL e as fases móveis em diversas variações conforme a
figura 5.8, variando de hexano, clorofórmio, acetato de etila à metanol. Foram coletadas 80
frações.

FIGURA 5.8 - Eluição da coluna 2 versus frações coletadas.

Hexano

Clorofórmio

Acetato de etila

Metanol
Natália de Freitas Oliveira Página 142

Após a última lavagem com metanol observou-se que ainda tinha material no topo da
coluna, então optou-se por fazer uma extração com solventes alcalinos conforme o
fluxograma 5.1, adaptado de Simões (2007).

FLUXOGRAMA 5.1 - Tratamento da sílica residual da coluna 2.

Material + Sílica
- NH4OH/24h
- Filtragem

Extrato alcalino Material sólido

Teste para - MeOH


alcalóides - H 2O
Extrato concentrado - NaCl diluido
reservado para futuras
análises Fase aquosa (pH 5) Fase orgânica

Acetato de etila Lavagem com H2O

Fase orgânica (pH 6) Fase aquosa + ppt (pH 9) Fase orgânica (pH 7) Fase aquosa (pH 8-9)

n-Butanol Acetato de etila

Fase orgânica (pH9) Fase aquosa + ppt Fase orgânica (pH8-9) Fase aquosa (pH 8-9)

As amostras finais foram concentradas, analisadas por CCD e as que apresentaram


estar isoladas, e com coloração ao se usar reveladores específicos para compostos
nitrogenados foram levadas para testes de alcalóides, sais de amônio e bases quaternárias. As
amostras que não tiveram resultados positivos foram descartadas e as restantes foram
reservadas para futuras análises.

Extração e isolamento de alcalóides - Cromatografia em coluna 3

Nesta etapa foi utilizada uma coluna com 75g de alumina e Fase aquosa final do TCC,
obtida do isolamento de alcalóides (vide Fluxograma 5.1) com 2,53g, tendo como volume
amostral 20mL e as fases móveis em diversas variações, conforme a figura 5.9, com eluições
feitas por hexano, clorofórmio, metanol e água. Foram coletadas 113 frações.
Natália de Freitas Oliveira Página 143

FIGURA 5.9 - Eluição da coluna 3 versus amostras coletadas.

Após a última lavagem com metanol observou-se que ainda tinha material no topo da
coluna, então se optou-se por fazer uma extração com solventes alcalinos, conforme mostrado
no fluxograma 5.2
Natália de Freitas Oliveira Página 144

FLUXOGRAMA 5.2 - Tratamento da alumina residual da coluna 3.

Material + Alumina
- HCl 6N
- Filtragem
- Partição

Solúvel em HCl + Alumina


solúvel em HCl (pH 1)
+ material
- n-Butanol (2 lavagens)

Extrato concentrado Solúvel em n-Butanol Insolúvel


reservado para futuras (pH 1) (Alumina+Material)
análises - Na2CO3 (6N) lib
CO2
- Na2CO3 (1,4N)
Solúvel em Insolúvel em
Na2CO3 Na2CO3

n-Butanol Alumina
descartada

Emulsão Fase aquosa Fase orgânica


- n-Butanol
- NaCl

Fase coloração
Fase incolor
rosada

As frações resultantes dos fluxogramas 5.1 e 5.2 foram concentradas e avaliadas


qualitativamente nos testes para alcalóides descritos anteriormente e em CCD com variações
de reveladores e eluentes universais e específicos para compostos nitrogenados. No
fluxograma 5.2 foram reservadas três frações que apresentaram testes positivos e bom
desenvolvimento em CCD (F. org. 2; F. Aquosa Alcalina Final; Alcalóides finais). A fração
final do isolamento de alcalóides foi levada para análise em IV, conforme a figura 5.10. Já no
fluxograma 5.1, observa-se que o tratamento ácido-base para a fração F. Aq. Alc. 1 não
obteve o rendimento desejado e que suas frações resultantes foram consideradas
insignificantes em termos de massa e análise por CCD para que se continuasse suas análises.
Natália de Freitas Oliveira Página 145

FIGURA 5.10 – Espectros de infravermelho para as frações isoladas.

110

100

90
Transmitância (%)

80

70

60 Coluna 2
Coluna 3
Alcaloides finais
50
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1
Comprimento de onda (Cm )

Ao avaliar os espectros das amostras resultantes (Figura 5.10) observa-se que estas são
distintas e apresentam características peculiares, como demonstrados na tabela 5.8
Natália de Freitas Oliveira Página 146

TABELA 5.8 – Atribuição das absorções no IV das frações da coluna 2, coluna 3 e


alcalóides finais da figura 5.10.
Frequência (cm-1)
Coluna Coluna Alcalóides Atribuição
2 3 finais
3380 3200 3110 Estiramento O-H (banda larga)/ Estiramento N-H
(banda larga)
- - 3020 Estiramento C-H/Deformação axial C-H aromáticos
2940 2940 - Estiramento C-H
2860 - 2800 Estiramento C-H
2525 - 2000 Harmônicas ou bandas e combinação
- - 1750 Estiramento C=N
1650 1600 - Estiramento C=C
1450 - 1440 Deformação assimétrica CH2
- 1370 1390 Deformação assimétrica CH3
- 1270 - Estiramento C-N (aril-alquil-amina)
- 1220 - Estiramento C-N (aril-alquil-amina)
1100 1110 1100 Estiramento C-O (aril-alquil-éter)
- 1045 - Estiramento C-O (aril-alquil-éter)
- 985 - Deformação angular de aromáticos
- 845 - Deformação angular de aromáticos
- 775 700 Deformação angular de aromáticos

Através da análise de espectrometria no infravermelho, observou-se que há a presença


de bandas características do grupo NH2 na região 3380 a 3110cm-1 com deformações axiais
simétricas e assimétricas, em todas as amostras observadas. A existência de picos entre as
regiões de 1370 a 1270 e de 1040 a 1150 cm-1 são atribuídas as deformações axiais C-N e ao
estiramento simétrico respectivamente, confirmando a presença de aminas e nitrogênio
intermolecular em todas as amostras reservadas e a presença de aromático na amostra da
coluna 3 (SCHULZ; BARANSKA, 2009; SILVERSTEIN et al., 2007; MCMURRY, 2008;
RODRIGUES, 2006). Ao se comparar a amostra da coluna 3 com os alcalóides em forma de
sais, seus espectros se assemelham bastante com os alginatos, sendo possível que a amostra
cromatografada na coluna 3 seja o sal alginato de amônio. Segundo Segato (2007), os
espectros no IV dos alginatos apresentam uma banda larga na região de 3400 cm-1, resultante
da deformação axial dos grupos OH, presentes na cadeia polimérica, mas no caso do alginato
de amônio esta banda aparece parcialmente acoplada com uma banda larga e intensa em
3191,9 cm-1, resultante da deformação axial da ligação N-H, associado a formação dos grupos
carboxilato, representados pelo deslocamento da banda em 1737,7 cm-1 do ácido para 1600 -
1620 cm-1 nos espectros dos alginatos, igual ao observado nas amostras das colunas 2 e 3.
Natália de Freitas Oliveira Página 147

As frações concentradas e cromatografadas, Coluna 2 e Coluna 3 tiveram sistemas de


eluentes distintos, observados pela diferença de polaridade dos compostos. Na coluna 2 foi
usado um sistema de solvente com clorofórmio e acetato de etila, conforme exposto na figura
5.8, com uma lavagem final usando metanol. As 80 frações obtidas foram analisadas por CCD
em diferentes sistemas de reveladores e eluentes, concentradas e reunidas a partir de sua
análise, e assim foram reservadas 6 frações. Ao final da coluna observou-se que havia muito
material retido na sílica e foi elaborado um tratamento para esta, descrito no fluxograma 5.2.
As amostras obtidas deste tratamento foram avaliadas qualitativamente em testes de
alcalóides, bases quaternárias e sais de amônio, sendo estes últimos o único teste positivo, e o
material concentrado e reservado para futuros estudos que fogem do escopo deste trabalho.
Na coluna 3 usou-se um sistema de solvente mais polar com hexano, clorofórmio, metanol e
água, monstrado na figura 5.9. Todas as 113 frações obtidas foram avaliadas por CCD com
diferentes sistemas de reveladores e eluentes até se obter resultados que levem a reunir os
compostos iguais e reservar 10 amostras para futuras análises. Ao final da coluna também
ficou retido muito material, sendo este tratado de acordo com o fluxograma 5.8 e suas
amostras resultantes avaliadas qualitativamente para alcalóides, bases quaternárias e sais de
amônio, resultando em nenhum teste positivo. Não sendo o foco de estudo deste trabalho
identificar formas estruturais e sim caracterizar o tegumento, as amostras de alcalóides foram
reservadas para trabalhos futuros.

5.3.2. Isolamento de sais de amônio

O processo de isolamento de sais de amônio se deu por várias tentativas e


metodologias até chegar as demonstradas neste trabalho, nas quais as melhores estão
apresentadas nos fluxogramas 5.3 e 5.4, que além de variar a metodologia (tratamento ácido e
tratamento básico) também variou-se os extratos hidrofílicos (polares) e lipofílico (apolares).
Como resultado destes métodos foram obtidas 12 amostras distintas, variando, de acordo com
Costa (2000), de alcalóides, açúcares, bases terciárias e quaternárias, sais e sais de amônio.
Natália de Freitas Oliveira Página 148

Tratamento ácido:

FLUXOGRAMA 5.3 – Tratamento ácido para o isolamento de sais de amônio

Extrato

HCl 2N (2X)

Solução ácida
NH4OH
(pH10)

Fase orgânica Solução +


solúvel precipitado
- HCl conc.
- Concentração
Filtração à vácuo
em banho

Bases quartenárias
Precipitado Solúvel

Acetato de etila

Fase orgânica Fase aquosa

HCl 6N Bases terciárias

Alcalóides
Natália de Freitas Oliveira Página 149

Tratamento alcalino:

FLUXOGRAMA 5.4 – Tratamento alcalino para o isolamento de sais de amônio.

Extrato
- NH4OH 6N
- Éter

Solução básica

- NH4OH (pH10)

Fase aquosa Fase orgânica

- HCl 6N (2X)

Sais e açúcares

Fase orgânica Fase aquosa

- NH4OH
- Éter

Fase aquosa Fase orgânica

Sais de amônio Alcalóides

As amostras foram concentradas e somente os sais foram conduzidos para as análises


seguintes, reduzindo para 6 amostras finais, as quais foram avaliadas qualitativamente quanto
a presença de amônio, sais de amônio, cloretos de amônio, bases fortes e alcalóides,
resultando em 2 amostras com incidência de sais de amônio e 4 com a presença do íon amônio
em sua estrutura, conforme demonstrado na tabela 5.9.
Natália de Freitas Oliveira Página 150

TABELA 5.9 – Testes qualitativos da extração de sais de amônio.


Classificação feita
Extrato CodigoIV Fração Fluxograma Testes positivos
por Costa (2000)
Sal ácido (pH3), teste
Fase
levemente positivo para sais
Hidrofílico H1 aquosa 5.3 Bases terciárias
de amônia, ausência de
final
cloretos.
Sal neutro (pH6/7),
Fase
levemente positivo para sais
Hidrofílico H2 aquosa 5.4 Sais de amônio
de amônia, ausência de
final
cloretos.
Sal neutro (pH6/7),
Fase
levemente positivo para sais
Hidrofílico H3 orgânica 5.4 Alcalóides
de amônia, ausência de
final
cloretos.
Sal neutro (pH6/7),
Fase
fortemente positivo para sais
Lipofílico L1 aquosa 5.3 Bases terciárias
de amônia, ausência de
final
cloretos.
Sal neutro (pH6/7),
Fase
fortemente positivo para sais
Lipofílico L2 aquosa 5.4 Sais de amônio
de amônia, ausência de
final
cloretos.
Fase Sal neutro (pH6/7), ausência
Lipofílico L3 orgânica 5.4 de cloretos, teste positivo Alcalóides
final para alcalóides.

Os resultados obtidos nos testes qualitativos e apresentados na tabela 5.9 com as


análises por infravermelho (Figura 5.11) permitem constatar que os sais de amônio obtidos no
extrato hidrofílico e lipofílicos são semelhantes, variando apenas sua intensidade, no qual
pode-se dizer, de acordo com Costa (2000), que as bases terciárias na extração de sais de
amônio estão presentes quase que inteiramente no extrato lipofílico, evidenciado pela baixa
intensidade no IV em H1, na figura 5.12, e que tem a existência de outros alcalóides além dos
sais de amônio, comparando H3 e L3 nos espectros de infravermelho da figura 5.11, e ainda
que os sais de amônio existentes no tegumento estão em maior quantidade no extrato
lipofílico e são formados por bases terciárias.

Na figura 5.11 e tabela 5.10 pode-se observar as variações dos extratos e métodos de
obtenção dos sais.
Natália de Freitas Oliveira Página 151

FIGURA 5.11 – Espectros de infravermelho da extração de sais.

100

80

60
T(%)

40
H1
H2
H3
20
L1
L2
L3
0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1
Comprimento de onda (Cm )

TABELA 5.9 - Atribuição dos dados de IV da figura 5.11.


Frequência (cm-1)
Atribuição
H1 H2 H3 L1 L2 L3
3395 3450 Estiramento O-H (banda larga)
3120 3120 3120 3120 3120 Estiramento N-H (banda larga)
3040 3030 3050 3020 3010 3010 Estiramento C-H (aromáticos)
2920 Estiramento CH2 e CH3 ou NH3+
2860 2800 2850/2790 2790 2850 2800 Estiramento CH2 e CH3
2720/2680 Estiramento N-H (Sais de aminas)
2490 Estiramento N-H (Sais de aminas)
2310 Estiramento N-H (Sais de aminas)
2240/2200 Estiramento N-H (Sais de aminas)
2180 2140 2140 Estiramento N-H (Sais de aminas)
2050 2000 1990 2000 Estiramento N-H (Sais de aminas)
1730 1750 1710 1770 1775 1720 Estiramento C=N ou
1650 1620/1560 1660 Estiramento C=C
1460 1420 1400 1420 1450 Deformação assimétrica CH2
1400 1390 1380/1350 1390 1390 1390 Deformação assimétrica CH3
1230 1230 1270/1200 Estiramento C-N (aril-alquil-amina)
1130 Estiramento C-O (aril-alquil-éter)
1070 1070 1090 1090 Estiramento C-O (aril-alquil-éter)

Ao analisar a figura 5.11 e a tabela 5.9 tem-se que H2, L1, L2 e L3 são análogos,
apresentando bandas atribuídas às ligações N–H~ 3100 cm-1. Relativo a classe de substâncias
em questão, temos que há a presença de ligações do estiramento C–H identificadas em 3000-
Natália de Freitas Oliveira Página 152

2800 cm-1, geralmente indicam a existência de cadeias alifáticas. As bandas observadas entre
1750-1700 cm-1 foram atribuídas às ligações C=O e/ou – N=C. As vibrações entre 1300-1200
cm-1 estão associadas à ligação C–N. Geralmente vibrações observadas entre 1120-1045 cm-1
também podem ser atribuídos a grupos C–NH–C. Em geral, as amostras apresentaram os
mesmos grupos funcionais, diferindo apenas em relação ao espectro de H2.

A amostra H3, segundo Costa (2000) definico como alcalóides, apresenta o seu
espectro na região do infravermelho picos em 3450 cm-1 referentes ao estiramento N−H, suas
bandas de variação entre 3000-2800 cm-1 geralmente indicam a existência de cadeias
alifáticas. Sais de amônio secundários geralmente são identificados pelas diversas bandas
encontradass entre 2700-2000 e as bandas pouco intensas da ligação entre 2250- 2100 cm-1
podem ser indicativos de C≡C e C≡N sobrepostos por bandas mais intensas.

5.4.Compostos fenólicos

O processo de extração foi direcionado para taninos, e foi feito por dois tipos de
extração, metanólica e em acetona, de acordo com o fluxograma 5.5 e com as metodologias
adaptadas de Simões (2007). Nas extrações tanto em metanol como em acetona, ao final das
48 h de contato do extrato com o material, observou-se a formação de uma névoa entre a parte
solúvel em metanol e o precipitado e que a exaustão não tinha ocorrido na extração com
acetona e optou-se por um novo tratamento descrito no fluxograma 5.5.
Natália de Freitas Oliveira Página 153

FLUXOGRAMA 5.5 - Extração e isolamento de taninos em solvente polar/apolar.

Tegumento da castanha de cajú (25g)

500 mL MeOH 70%/ Acetona

Solúvel Precipitado (Ppt) + névoa

Acetato de Etila
(2 x 20mL)

Solúvel Ac. Etila Névoa + Ppt

n - butanol
(2 x 20mL)

Solúvel n-butanol Nevoa + Ppt


MeOH Quente
(2 x 20mL)

Solúvel em MeOH
quente

Com esse tratamento obteve-se 8 amostras que foram concentradas em rotaevaporador


e banho, cujos rendimentos estão descritos na tabela 5.11.

TABELA 5.11 – Rendimento das frações da extração de taninos obtidas do


fluxograma 5.5.
Percentual
Extração Fração Rendimento (g)
residual (%)
Acetona Solúvel em Acetona 4,66 18,63
Acetona Solúvel em Ac. etila 4,51 22,18
Acetona Solúvel em n-Butanol 12,7 80,23
Acetona Solúvel em MeOH (quente) 0,32 10,26
Metanol Solúvel em MeOH 10,57 42,27
Metanol Solúvel em Ac. etila 1,81 12,51
Metanol Solúvel em n-Butanol 2,06 16,32
Metanol Solúvel em MeOH (quente) 2,17 20,57

Fazendo um comparativo dos sistemas de extração tem-se que o metanol teve maior
rendimento inicial, acompanhado da fração polar n-butanol após a retirada de compostos
apolares na extração com acetona. Todas as amostras resultantes foram concentradas em
banho e testadas qualitativamente para a presença de fenóis, taninos, antocianinas,
antocianidinas, flavonóides, leucotocianidinas, catequinas, flavonas, flavonóis, flavononois e
xantonas. A tabela 5.12 demonstra os resultados para os testes de compostos fenólicos com a
Natália de Freitas Oliveira Página 154

finalidade de se observar não só a extração de taninos, mas também de outros compostos da


mesma classe.

TABELA 5.12 – Testes qualitativos para compostos fenólicos das extrações de taninos.
Extração Amostra Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste5
Presença de taninos Possível
Solúvel em
Acetona condensados ou Flavonóis presença de -- --
Acetona catéquicos catequinas
Solúvel em Ac.
Acetona -- -- Flavanonas - -
Etila
Possível presença
Solúvel em n- fenóis e taninos
Acetona condensados ou
- -- - -
Butanol
catéquicos
Solúvel em MeOH Taninos condensados
Acetona ou catéquicos
Flavonóis - - -
(quente)
Presença de taninos
Metanol Solúvel em MeOH condensados ou Flavonóis Flavanonas Positivo Positivo
catéquicos
Solúvel em Ac.
Metanol -- -- -- -- --
etila
Possível
Possível presença de Possível
Solúvel em n- Resultado presença
Metanol taninos condensados
confuso
presença de
de
--
Butanol ou catéquicos flavanonas
flavanonas
Possível
Solúvel em MeOH Possível presença de Resultado
Metanol fenóis confuso
presença de -- --
(quente) flavanonas
Teste 1: teste para fenóis e taninos. Teste 2: teste para antocianinas, antocianidinas e flavonoides. Teste 3: teste
para leucotocianidinas, catequinas e flavonas. Teste 4: teste para flavonas, flavonóis, flavononois e xantonas.
Teste 5: teste para confirmação de catequinas.

Comparando os resultados da tabela 5.12, relativo ao solvente extrativo tem-se que a


extração com metanol obteve todos os testes positivos para compostos fenólicos, seguida da
extração com n-butanol e acetona. Conclui-se que o extrato metanólico na extração de
compostos fenólicos apresenta maior rendimento, melhor identificação e facilidade de
extração, sendo o melhor solvente para a extração de compostos fenólicos do tegumento.

Ao final da caracterização e isolamento dos compostos mais proeminentes do


tegumento da castanha de cajú, optou-se por usar os compostos fenólicos, por serem de fácil
extração, caracterização e terem um melhor rendimento, em uma aplicação de interesse
comercial e tecnológico para avaliar seu potencial frente à outros produtos sintéticos no
mercado e a substituição deste por um produto natural.
Natália de Freitas Oliveira Página 155

5.5. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO TEGUMENTO DA CASTANHA DE CAJÚ


(ANACARDIUM OCCIDENTALE) COMO INIBIDOR DE OXIDAÇÃO EM
ÓLEOS VEGETAIS.
5.5.1. Caracterização dos antioxidantes naturais

Os extratos do TCC foram avaliados quanto a sua solubilidade, avaliação por UV e IV,
atividade antioxidante e teor de compostos fenólicos.

Caracterização física

As solubilidades dos extratos elaborados foram avaliadas em diversas soluções e óleos


para facilitar as futuras análises e aplicações, como uma das metodologias de escolha dos
óleos usados para avaliação do potencial antioxidante, conforme a tabela 5.13.

TABELA 5. 13 – Solubilidade dos extratos do TCC.


Amostra Solúveis Pouco solúvel
Éter, etanol, metanol, CHCl3, hexano, acetato de
MF octano, heptano, metanol: etila e metanol:
(Extrato metanólico à frio) água (90 e 80%), óleo de CHCl3(90%).
canola, óleo de girassol.
Octano, heptano, metanol: Éter, CHCl3, hexano,
MDF
água (90 e 80%), metanol: acetato de etila, metanol:
(Extrato metanólico
CHCl3, óleo de canola e CHCl3(90%).
desengordurado à frio)
óleo de girassol.
Etanol, octano, metanol: CHCl3, éter, acetato de
MQ
água (90 e 80%), óleo de etila, metanol:
(Extrato metanólico à quente)
canola, óleo de girassol. CHCl3(90%).
Etanol, metanol, heptano, Éter, CHCl3, hexano,
MDQ
metanol: água (90 e 80%), octano, acetato de etila,
(Extrato metanólico
óleo de canola, óleo de metanol: CHCl3(90%).
desengordurado à quente)
girassol.

Com base nos resultados da tabela 5.13 observa-se que, dos óleos que foram pré-
selecionados, o extrato do TCC somente foi solúvel no óleo de canola e girassol em todas as
condições de extração testadas.

Os compostos fenólicos possuem uma faixa de absorbância em UV-vis é uma das


formas de observar a incidência de compostos fenólicos é a varredura UV. Os dados da figura
Natália de Freitas Oliveira Página 156

5.12 coincidem com a literatura, que indica a presença da molécula fenólica através dos picos
com absorção em 210-240 e 270-287 (SILVERSTEIN, 2006).

FIGURA 5.12 - Varredura no UV-vis dos extratos metanólicos em diferentes


concentrações.

3
Absortividade

MDF (0,01g/mL)
2 MDF (0,001g/mL)
MF (0,01g/mL)
MF (0,001g/mL)
MQ (0,01g/mL)
1 MQ (0,001g/mL)
MDQ (0,01g/mL)
MDQ (0,001g/mL)

0
100 200 300 400 500 600 700 800
Absorbância (nm)

A análise no infravermelho foi usada como auxiliar na elucidação de estruturas


químicas. A figura 5.13 mostra a transmitância de cada um dos extratos utilizados e observa-
se que todos contêm basicamente os mesmos grupos funcionais, mas com intensidades
diferentes.

FIGURA 5.13 –
100 Infravermelho
dos extratos do
90
TCC.
80

70
T(%)

60

50
MF
MDF
40
MQ
MDQ
30
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1
Comprimento de onda (Cm )
Natália de Freitas Oliveira Página 157

Observa-se que em todos os extratos há a evidencia de uma composição polimérica


com a hidroxila, a associação a compostos carboxílicos de cadeias longas e a presença de
aromáticos (C=C), assim, mais uma vez, comprova-se a presença de compostos fenólicos e
que os extratos desengordurados obtiveram maior intensidade, como era de se esperar, pois a
maioria dos compostos fenólicos são polares.

Composição fenólica

A composição fenólica pode também ser quantificada por meio da quelação ao Folin-
Cicauteau, este podendo ser quantificado em relação ao ácido gálico. Os resultados obtidos
são apresentados na tabela 5.14.

TABELA 5.14 – Análise de compostos fenólicos totais dos extratos.


Extratos EAG (mg/gextrato) EAG (gextrato/ mg/mL ác.gálico)
MF 297,084±0,44 12,424
MDF 321,255±0,11 12,885
MQ 310,290±0,14 12,272
MDQ 327,035±0,30 13,163
Resultados expressos como média ± desvio padrão (p<0,05).

Ao observar os valores obtidos e apresentados na tabela 5.14 nota-se que os extratos


desengordurados obtiveram maior concentração de compostos fenólicos e que a extração à
quente foi a mais eficiente. Lim et al. (2004), ao diversificar as extrações em diferentes
solventes e métodos que variaram a temperatura, mostrou que para a extração de compostos
fenólicos em tegumento do amendoim o extrato metanólico e elevadas temperaturas
forneceram maiores resultados em Compostos Fenólicos Totais (CFT).

O metanol como solvente aumentou consideravelmente a extração de compostos


fenólicos em ralação a outros estudos do tegumento da castanha de cajú, observando ainda
pela tabela 5.13 que o desengorduramento, assim como o tipo de extração (quente/frio),
Natália de Freitas Oliveira Página 158

influenciou sua concentração, resultados esses confirmados na literatura por Mazzeto et al.
(2009), Kamath e Rajini (2007) e Chandrasekara e Shahidi (2011).
Natália de Freitas Oliveira Página 159

Atividade antioxidante

A atividade antioxidante (AA%) pode ser medida por diversos métodos e a


descoloração do β-caroteno tem sido amplamente utilizada nessa medição em extratos
vegetais (MADHUJITH; AMAROWICZ; SHAHIDI, 2007; SHAHIDI; ALASALVAR;
LIYANA-PATHIRANA, 2007; WIJERATHNE; AMAROWICZ; SHAHIDI, 2006).

Obteve-se as AA% dos extratos por ensaio em comparação ao β- caroteno, relativo ao


tempo de análise, cujos resultados estão representados na figura 5.14. Observou-se uma queda
exponencial na oxidação do ácido linoleico, onde os extratos metanólicos à quente foram mais
efetivos do que aqueles provenientes da extração à frio. Ao se avaliar o percentual de inibição
tem-se a seguinte ordem MQ>MDQ>MDF>MF, respectivamente (95,86; 94,68; 95,63;
94,13), mas estatisticamente não há diferenças significativas entre os extratos (p= 0,0006%;
p<0,05%) (Tabela 5.15).

FIGURA 5.14 – Atividade antioxidante dos extratos relativo ao tempo.

0,8
Atividade antioxidante ( b- caroteno)

0,7

0,6

0,5 MF
MDF
0,4 MQ
MDQ
0,3 Controle

0,2

0,1

0,0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (min)

Pérez-Jiménez e Saura-Calixto (2006) descrevem que as diferenças na atividade


antioxidante, quando são utilizados diferentes solventes extratores, podem ser maiores se a
amostra analisada for um alimento, visto que representa uma matriz complexa de diferentes
Natália de Freitas Oliveira Página 160

componentes, que podem estabelecer, entre si e com os solventes, inúmeras e diferentes


interações.
Tabela 5.15 – Percentual de inibição antioxidante em β-caroteno/Ac. Linolêico.
Extrato AA (%)
MF 94,13±0,015
MDF 94,62±0,047
MQ 95,86±0,005
MDQ 94,68±0,008
Resultados expressos como média ± desvio padrão (p<0,05).

Estatisticamente a correlação entre a quantidade de compostos fenólicos e a atividade


antioxidante foi positiva, mas não apresentou valores expressivos. No caso de óleos, há um
fato a ser questionado, pois a propriedade antioxidante dos extratos tende a ser dependente da
solubilidade no composto, no caso ácido linoleico. Em uma emulsão em óleo, como é o caso
da análise, os antioxidantes hidrofílicos são mais efetivos do que os hidrofóbicos, uma vez
que atuam na interface óleo-água (FRANKEL; HUANG, 1994; PORTER, 1993). Entretanto,
ao considerar a solubilidade, tem-se que questionar que os antioxidantes hidrofóbicos inibem
a oxidação na fase lipídica das emulsões, na qual os compostos fenólicos encontram-se em
equilibrio com a água, emulsificante (Tween 20), micelas e fase lipídica, aumentando sua
propriedade hidrofílica, com consequente aumento da inibição da oxidação lipídica (SAIJA et
al., 1995).

No trabalho realizado é possível que os compostos fenólicos do extrato metanólico


tenham atingido este equilíbrio, enquanto que os dos extratos metanólicos desengordurados
tenham permanecido prioritariamente na fase lipídica do sistema, justificando, assim, as ações
antioxidantes serem consideradas estatisticamente semelhantes e a baixa correlação com a
quantificação fenólica. Ressalta-se que a atividade antioxidante de vegetais não é
especificamente resultante de uma única classe de composto fitoquímico, mas do efeito
sinergético de todos os compostos, embora haja uma maior relação de certos compostos com a
atividade antioxidante.

5.6. Eficiência do refino de óleos vegetais em escala laboratorial

Vários processos de refino dos óleos brutos de canola e girassol foram testados,
variando as concentrações, volumes, temperatura e tempo. A variação destas constantes
físicas e químicas foram acompanhadas durante todo o processo do refino em escala
laboratorial e, devido às suas respostas quanto as suas características químicas e físicas
Natália de Freitas Oliveira Página 161

visíveis e observadas por meio de análises especificas, definiu-se o processo de refino mais
adequado para os óleos estudados.

Ao acompanhar o processo de tratamento dos óleos de canola e girassol, observou-se


que à medida em que se eliminava as impurezas na degomagem, tais como os fosfolipídios ou
fosfatídeos (gomas e lecitinas), açúcares, resinas, fragmentos de proteínas, insolúveis em óleo
e solúveis em água não houve variações significativas confirmadas pelos índices de acidez,
iodo ou peróxido.

Após o segundo tratamento (neutralização) observou-se que ao neutralizar os ácidos


graxos livres e eliminar o glicerol, carboidratos, resinas e metais em forma de sabões, houve
um acentuado declínio dos índices de acidez, iodo e peróxido, deixando os óleos neutralizados
com as mesmas características dos óleos industrializados.

Os óleos de canola e girassol, apresentados na tabela 5.16, mostram, através dos


resultados das análises químicas das diferentes etapas de refino estudadas, que o tratamento
elaborado se mostrou satisfatório e o processo de refino atingiu os resultados esperados em
comparação aos óleos industrializados.

TABELA 5.16 - Caracterização química dos óleos de canola e girassol em diferentes estágios.
Índice de acidez Índice de iodo Índice de peróxido
Óleos
(%ac.oleico) (meq/10Kg da amostra)
Canola Industrializado 0,905±0,157 154±nd 2,030±0,112
Canola bruto 5,457±0,052 258±nd 1,996±0,056
Canola degomado 5,577±0,138 256±0,001 2,029±0,057
Canola neutralizado 0,814±0,001 154±0,001 2,063±0,096
Girassol industrializado 0,935±0,138 102±nd 0,229±0,057
Girassol bruto 1,356±0,001 51±0,001 0,098±nd
Girassol degomado 1,326±0,052 154±0,001 0,098±nd
Girassol neutralizado 0,813±0,001 103±0,001 0,098±nd
Resultados expressos como média ± desvio padrão (p<0,05).
De acordo com os resultados obtidos é possível observar que as amostras analisadas
estão dentro dos parâmetros de identidade especificados pela legislação brasileira (BRASIL,
2006). Após o refino, o índice de peróxido no óleo de canola não teve variações significativas
e o óleo de girassol apresentou valores entre 0,098 e 0,229 mEq/Kg. Porém ambos os óleos
Natália de Freitas Oliveira Página 162

tiveram seus indices bem inferiores aos valores máximos admitidos que, segundo a ANVISA
(1999), não deve ultrapassar o valor de 10 meq/1000g de amostra.
Os óleos apresentaram valores para o índice de acidez variados entre 0,8 e 5,5%
podendo ser considerado de ótima qualidade. Os óleos neutralizados podem ser classificados
comercialmente como óleo do tipo 1. Conforme Santos et al. (2001), o óleo com acidez
inferior a 1% é classificado, comercialmente, como óleo industrial do tipo 1 e, quando o óleo
apresentar no máximo 3% de acidez livre, é reconhecido como do tipo 3.
Assim, após vários testes, tem-se que a metodologia testada para o refino dos óleos
brutos de canola e girassol demonstraram resultados satisfatórios e dentro dos padrões para
óleos vegetais comestíveis.

5.7. Efeitos dos diferentes antioxidantes derivados do TCC nos óleos de canola e
girassol sob a estabilidade oxidativa

A oxidação lipídica é um fenômeno espontâneo e inevitável, com uma implicação direta


no valor comercial quer das matérias graxas, quer de todos os produtos que a partir deles são
formulados (SILVA; BORGES; FERREIRA, 1998). A estabilidade de um óleo é determinada
por meio de testes da oxidação acelerada sob temperaturas elevadas, pois para seu
acompanhamento em condições naturais é necessário um período muito longo. Após os óleos
serem padronizados e refinados, foram submetidos a um envelhecimento de 72h com e sem
antioxidantes. Os testes foram acompanhados por análises a cada intervalo preestabelecido e
avaliadas as eficácias antioxidantes dos extratos em OC e OG nas análises de IA, IP,
absortividades UV e estabilidade em PetroOxy, no qual foram determinadas como índice de
oxidação lipídica, por ser o indicativo mais usado para expressá-la (MEHLENBACHER,
1960; VANHANEN; SAVAGE, 2006). Os estudos foram realizados a 70 °C em estufa,
temperatura considerada ideal, pois à temperaturas mais elevadas os peróxidos irão se
decompor rapidamente (DUH; YEN, 1997; MARIOD; FATHY; ISMAIL, 2010).

Os antioxidantes testados foram MF, MDF, MQ e MDQ, comparados com o BHA,


cujos os resultados serão apresentados e discutidos a seguir.
Natália de Freitas Oliveira Página 163

5.7.1. Índice de acidez (IA)

Os resultados da determinação do índice de acidez para as amostras dos óleos de


girassol e canola com e sem antioxidantes naturais derivados do TCC e sintético (BHA) são
mostradas na tabela 5.17 e figuras 5.15(a) e (b). Os valores apresentados na tabela 5.17
representam os valores médios de quatro análises por amostra.
Tabela 5.17 - Índice de acidez dos óleos de girassol e canola com e sem a ação de antioxidantes
Natália de Freitas Oliveira Página 164

FIGURA 5.15 - Índice de acidez dos óleos de canola (OC) (a) e de girassol (OG) (b) nos
diferentes tempos de oxidação e antioxidantes.
1,0 (a) 1,0 (b)

0,9
Índice de ácidez (% ác.oleico)

Índice de ácidez (%ác.oleico)


0,8 0,8

0,7

MQ
0,6 0,6
MF
MDQ
0,5
MDF
BHA
0ppm
0,4 0,4
a b c d e f g a b c d e f g
0 4 8 12 24 48 72 0 4 8 12 24 48 72
Tempo (h) Tempo (h)

Ao analisar os dados da tabela 5.16 e das figuras 5.15 (a) e (b), nota-se que o aumento
da acidez titulável foi gradual em relação ao tempo. Os dados apresentados na Tabela 5.16
mostram claramente que o IA do OC armazenado foi afetado pela adição dos extratos
metanólicos do TCC. A acidez do óleo de canola se comportou de forma variada e muito
acelerada, estes aumentos abruptos são consequência da formação de produtos de reações
decorrentes da oxidação dos lipídios, que geram compostos que aumentam a acidez do meio,
acrescidos com ácidos fenólicos existentes no TCC e à produção de ácido orgânico (AL-
BACHIR, 2004; ALVES et al, 2009; FUSE et al., 1997; YUAN et al., 2006). Mas, mesmo
assim, os antioxidantes provenientes do TCC levaram os óleos de canola e girassol à baixos
índices de acidez em relação aos óleos sem antioxidantes. No óleo de girassol chegou a ser
menor ou igual ao BHA (0,814 % ác. Oleico) após 72h, vide figura 5.15 (b), MF e MDQ
(0,813 e 0,752 % ác. Oleico, respectivamente) mostrando uma maior estabilidade e variações
não significativas durante os testes de oxidação acelerada. Já para o óleo de canola, o BHA foi
o que mais reduziu a acidez titulável, após 72h de experimento, seguido do MDQ e MDF,
destacando-se por se mostrar estável durante todo o ensaio oxidativo. A Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (BRASIL, 1999) estabelece uma acidez máxima de 2% para óleos e
gorduras vegetais não refinados. Os valores máximos nos dois ensaios e em todos os
antioxidantes utilizados apresentaram valores inferiores ao exigido pela legislação, indicando
que os antioxidantes preservaram a integridade dos triglicerídeos.
Natália de Freitas Oliveira Página 165

5.7.2. Índice de peróxido (IP)

O hidroperóxido é o produto primário da oxidação de lipídeos; por conseguinte, a


determinação do valor de peróxido pode ser utilizada como um índice para a fase inicial de
oxidação de lipídeos. De modo geral, pode-se afirmar que o óleo de baixa qualidade terá um
período de indução mais curto. Neste estudo, o método do tiocianato de ferro foi utilizado
para medir a alteração do hidroperóxido nos óleos de canola e girassol e a ação de
antioxidantes naturais extraídos do TCC e compará-los ao antioxidante sintético (BHA), em
relação aos óleos sem antioxidantes, durante o período de 72h em estufa à 70°C. Os
resultados da influência dos antioxidantes são apresentados na figura 5.16.

FIGURA 5.16 - Índice de peróxido dos óleos de girassol (a) e canola (b) versus os tempos de
oxidação acelerada utilizando diferentes antioxidantes.

4,0
4,0

3,5
(a)
3,5
(mEq/Kg)
Peróxido (mEq/Kg)

3,0
3,0
Legenda:
2,5 MQ
2,5
MF
de Peróxido

2,0 MDQ
2,0
MDF
1,5
1,5
BHA
Índice de

0ppm
Índice

1,0
1,0

0,5
0,5

0,0
0,0
0 4 8 12 (h)
Tempo
Tempo (h) 24 48 72

4,0

3,5
(b)
Índice de Peróxido (mEq/Kg)

3,0
Legenda:
MQ
2,5
MF
MDQ
2,0
MDF
1,5
BHA
0ppm
1,0

0,5

0,0
0 4 8 12 24 48 72
Tempo (h)
0 4 8 12 24 48 72
Natália de Freitas Oliveira Página 166

Foi observado um aumento contínuo no IP com o tempo de armazenamento para todas


as amostras de óleo (Figura. 5.16 a e b), ficando mais visível após 24 h de oxidação acelerada.
Todos os extratos mostraram uma atividade antioxidante maior em comparação com a
amostra de controle após 0, 4, 8, 12, 24, 48 e 72h (P <0,05), ou seja, inibindo a formação de
hidroperóxidos.
Ao observar a Figura 5.16 (a) nota-se que o antioxidante natural MDF em óleo de
girassol manteve o índice de peróxido constante a 1,973 mEQ/10Kg de 4h a 72h da oxidação,
diferentemente do BHA que variou o IP e teve após 72h de oxidação acelerada um valor de
2,959mEQ/10Kg de peróxidos e hidroperóxidos formados, mostrando a eficácia deste
antioxidante natural frente ao antioxidante industrial, com ação inibitória de 30%.
Nos testes oxidativos feitos com óleo de canola, figura 5.16 (b), observou-se que o
mesmo antioxidante natural MDF (2,491mEq/10Kg) se destacou entre os demais e em relação
ao BHA, e ao final da oxidação este teve uma ação inibitória 16,5% maior que o BHA
(3,034mEq/10Kg) e 35% mais eficiente na inibição da formação de peróxidos em relação à
amostra sem antioxidante (3,846 mEq/10Kg).

O óleo de girassol se mostrou mais estável em relação ao óleo de canola e com menor
formação de hidroperóxidos, após as 72h de oxidação acelerada em estufa a 70°C,
visivelmente notado no gráfico da figura 5.16. Depois que o período de indução é alcançado,
o nível de hidroperóxidos aumenta rapidamente, indicando o início do processo de oxidação
global, observado claramente na amostra sem antioxidante e que os antioxidantes naturais
retardaram esta etapa de término da oxidação e que no óleo de girassol ela é mais marcante.
Isto ocorre devido ao óleo de girassol conter antioxidantes próprios como o sesamol,
sesamolina e tocoferol, formados após as condições de temperaturas implantadas no estudo
(YEN, 2012).
Os teores máximos de IP para os óleos de canola e girassol com os antioxidantes
derivados do TCC foram 3,503 e 3,493mEq/10Kg, que são muito menores do que os de óleo
de girassol estabilizado com extrato de gengibre (HE et al., 1999), óleo de canola (SHAHIDI;
JANITHA; WANASUNDARA, 1992) e óleo de canola estabilizados por alguns antioxidantes
naturais (BANDONIENE et al., 2000). Estes dados sugerem a superioridade de extratos do
tegumento da castanha de cajú em relação ao antioxidante sintético estudado, devido à sua
eficácia por longo prazo e estabilidade (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1997).
No gráfico da figura 5.17, tem-se a análise de superfície de resposta dos índices de
peróxido e acidez em relação ao tempo de oxidação acelerada em forno Schaal e nele pode-se
Natália de Freitas Oliveira Página 167

observar que o óleo de canola apresenta os menores índices até as primeiras quarenta horas de
envelhecimento, confirmando sua maior estabilidade em relação ao óleo de girassol, já citada.
FIGURA 5.17 - Gráfico de superfície do IP versus IA e o tempo de oxidação acelerada
dos óleos de canola (a) e girassol (b).

(a)

(b)

Ainda na figura 5.17, observa-se que o óleo de girassol tem um aumento gradual dos
índices de acidez e peróxido correlacionados e que sua maior aceleração do envelhecimento
se deu por volta de 40h de análise em forno schall.

5.7.3. Dienos (DC) e trienos (TC) conjugados


Natália de Freitas Oliveira Página 168

Geralmente, a determinação da absortividade a 232nm e a 270nm são indicativos do


estado de oxidação do óleo, revelando a presença de seus compostos secundários. No
processo oxidativo dos ácidos graxos poliinsaturados há a formação de hidroperóxidos e o
deslocamento das duplas ligações, com consequente formação de dienos conjugados
(DC), que absorvem a 232 nm, refletindo assim no grau de formação de produtos primários da
oxidação (GUTIERREZ; REGITANO-D ARCE; RAUEN-MIGUEL, 1997; JADHAV, 1996).
As cetonas e as cetonas insaturadas são consideradas como produtos secundários da oxidação,
apresentam um máximo de absorção a 270nm. Assim, é possível acompanhar e separar
estágios de evolução oxidativa com base na relação E 270nm/E232nm: quanto maior o valor da
absorbância a 232 nm, mais elevado será o conteúdo em peróxidos, correspondendo, portanto,
ao início do processo de oxidação; já quanto maior for o valor de absorbância a 270nm, maior
será o teor de produtos secundários presentes (SRINIVASAN; XIONG; DECKER, 1996). O
aumento no conteúdo do DC e do TC é proporcional à absorção de oxigênio. À medida em
que os níveis de DC e TC aumentam o oxigênio dissolvido nos óleos aumenta
proporcionalmente e menor será a estabilidade oxidativa dos óleos (BUSHA et al., 2007;
CHATHA et al., 2006; IQBAL; BHANGER, 2007).

A figura 5.18 (a, b, c e d) mostra a formação de dienos conjugados (DC) e trienos


(TC), nos óleos de canola e girassol, respectivamente, com e sem antioxidante sob o processo
de oxidação acelerada em função do tempo de armazenamento.
O conteúdo de DC e TC continuou a aumentar em função do aumento do tempo de
armazenamento. Um padrão regular de aumento foi observado em todas as amostras. No
entanto, a taxa de aumento foi variável quanto ao antioxidante e ao óleo em análise. Nota-se
na figura 5.18 que os valores dos coeficientes de extinção a 232 nm foram menores que os
determinados a 270 nm, isso se deve à reação de formação de dienos conjugados, iniciadores
e propagadores da reação de oxidação de óleos e gorduras, para posterior etapa de finalização
com a formação de trienos conjugados, os quais são analisados a 270 nm.
Natália de Freitas Oliveira Página 169

FIGURA 5.18 – Formação de dienos (232 nm) e trienos (270nm) conjugados, extinção
específica versus o antioxidante e o tempo de oxidação acelerada nos óleos de canola (a) e (b)
e girassol (c) e (d).
10
4
(a) (b)
9
Absortividade a 232nm (Óleo de canola)

Absortividade a 270nm (Óleo de canola)


8
3
7 MQ
MF
6
MDQ
5 2
MDF
BHA
4 0ppm
3
1
2

0 0
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h) Tempo (h)


10 4

9
Absortividade a 232nm (Óleo de girassol)

Absortividade a 270nm (Óleo de girassol)

8
3
7

5 2

4
MQ
3 MF
1 MDQ
2
MDF
BHA
1 (c) (d) 0ppm
0 0
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72
Tempo (h) Tempo (h) Observa-
se ainda na figura 5.18 que a amostra controle (0ppm) apresentou maior presença de dienos
conjugados, verificado através dos maiores valores de absorção específica no UV a 232 nm
em óleo de girassol em função do tempo e em quase todos os tempos do óleo de canola, onde
houve uma sinergia com o antioxidante e o extrato MF que apresentou uma elevada presença
de dienos conjugados. O óleo de canola demonstrou maior estabilidade na formação de dienos
e trienos. Todos os óleos tiveram menores valores de trienos, demonstrando que o processo de
refino elaborado para os óleos eliminou uma boa quantidade de substâncias indesejáveis na
estabilidade dos óleos vegetais e que o baixo percentual da extinção específica para os trienos
conjugados demonstram que os óleos não chegaram na fase de terminação da auto-oxidação,
como já relatado anteriormente por meio de outras análises, pois não houve a intensa
Natália de Freitas Oliveira Página 170

formação de produtos secundários e terciários da oxidação, como aldeídos e cetonas


insaturadas.
O óleo de girassol apresentou maiores valores de DC e TC. A presença de elevados
teores de DC pode ser relacionada com as maiores quantidades de ácidos graxos poli-
insaturados (AGP) (LIU; WHITE, 1992) no óleo de girassol, que no óleo de canola. Trienos
conjugados podem ser produtos da desidratação de hidroperóxidos de dienos conjugados,
assim explicando os valores mais elevados do óleo de girassol frente ao de canola
(FISHWICK; SWOBODA, 1977).
As amostras contendo o antioxidante sintético BHA apresentaram comportamento
intermediário em todos os tempos e óleos. Por outro lado, as amostras contendo os
antioxidantes MDQ>MDF>MQ foram as que tiveram menores valores de absorbância no UV
a 232 e 270 nm, devido a menor presença de compostos secundários, o que lhes confere maior
eficiência quanto à inibição da oxidação, indicando potencial antioxidante dos componentes
dos extratos metanólicos do tegumento da castanha de cajú (LIU; WHITE, 1992).

A determinação do DC e TC é uma boa medida do estado oxidativo de óleos (YOON;


KIM, 1994) e, portanto, um bom indicador da eficácia dos antioxidantes testados. A absorção
a 232 nm e 270 nm foi correlacionada com os índices de acidez e de peróxido, devido à
formação de compostos primários e secundários de oxidação, no qual o óleo de canola e de
girassol apresentaram correlações positivas e boa concordância com o do IP e IA (Tabela
5.18).

TABELA 5.18 – Correlações entre os índices de acidez e de peróxido dos óleos de


canola e girassol com DC e TC.
Óleos
Interações
Canola Girassol
I.Acidez X DC 0,74 0,72
I.Acidez X TC 0,26 0,24
I.Peróxido X DC 0,72 0,60
I.Peróxido X TC 0,29 0,40

Ao avaliar as concordâncias nos dados de IA e IP, apresentados constatou-se a falta de


produtos finais da oxidação, obtidos pela decomposição de hidroperóxidos, que estariam
evidenciados em uma elevada correlação do IP e os TC, o que não ocorreu nos óleos de
Natália de Freitas Oliveira Página 171

canola e girassol, confirmando que o tratamento e os antioxidantes utilizados elevaram a


estabilidade dos óleos, prolongando os estágios de degradação oxidativa dos óleos.

5.7.4. Método ASTM D7545 (PetroOXY)

Nestas análises foram avaliados todos os pontos da oxidação acelerada proporcionada


em forno Schaal com e sem antioxidantes, no qual foi avaliado se após indução à oxidação o
óleo ainda teria a proteção do antioxidante, para isto utilizou-se o PetroOXY.

Na figura 5.19 observa-se a atividade antioxidante de cada extrato que pôde ser
estudada pelo seu fator de proteção de cada óleo vegetal com e sem a dosagem do extrato, no
estado anterior e após a oxidação acelerada.

FIGURA 5.19 – Fator de proteção (%) dos antioxidantes naturais em relação aos óleos
de canola (a) e girassol (b) sem antioxidante.
35
20

30 18

16
25
Fator de proteção (%)

Fator de proteção (%)

14

20 12

10
15
MQ
8
MF
10 6 MDQ
MDF
4
5
2

0 0
0a 4a 8a 12a 24a 48a 72a 0b 4b 8b 12b 24b 48b 72b
Tempo (h) Tempo (h)

Entre os óleos estudados o óleo de canola apresentou uma melhor estabilidade termo-
oxidativa, quando comparado ao de girassol. Observa-se que os extratos avaliados nesse
estudo apresentaram atividade antioxidante em praticamente todas as corridas, em particular
para o óleo de canola nos tempos de 12-24h da oxidação acelerada, no qual a atividade pode
ser melhor evidenciada. Em relação ao óleo de girassol, o melhor desempenho do antioxidante
após os testes em forno schaal foi para 4h de oxidação acelerada. Após 72h de ensaios
experimentais, notou-se que os óleos enriquecidos com os extratos MDQ e MDF depois de
uma nova oxidação acelerada em PetroOXY ainda se mantinham ativos no óleo de canola,
Natália de Freitas Oliveira Página 172

enquanto para o óleo de girassol somente o MF ainda não tinha sido totalmente consumido e
se mantinha em atividade.

Em geral, os resultados explicitados nesta tese sob perspectiva da atividade


antioxidante em cada extrato, apresentaram melhor desempenho dopado com óleo de canola.

Podemos destacar que quanto a estabilidade oxidativa dos óleos vegetais, o óleo de
canola apresentou maior estabilidade frente ao óleo de girassol, independente da ação dos
antioxidantes utilizados. Uma possível explicação pode estar relacionada ao número de
insaturações dos componentes dos óleos, pois a susceptibilidade da molécula à degradação
térmica e oxidativa está diretamente relacionada a quantidade de insaturações, pode-se
destacar os ácidos linoléico (C18:2) e linolênico (C18:3) como os de maior influencia na
degradação, devido as suas duplas ligações. O óleo de canola apresenta em sua composição
15-30% de C18:2, enquanto o óleo de girassol possui 55-75% de C18:2, fazendo com que o
óleo de canola apresente uma menor tendência a oxidação, conforme observado pelos maiores
fatores de proteção mostrados na figura 5.20 e tabela 5.18.

Em comparação aos antioxidantes, observou-se uma maior sinergia dos antioxidantes


naturais com o óleo de canola. Extratos desengordurados como o MDQ e MDF obtiveram
melhores respostas na estabilidade oxidativa, sendo estes mais polares e com maior
quantidade de compostos fenólicos em sua composição.

Como já ressaltado anteriormente, a atividade antioxidante não depende somente do


composto fitoquímico, mas também da sinergia dos compostos presentes em todo o meio.
Porter et al. (1989) e Frankel (1996) comentam em seus estudos que a presença de compostos
fenólicos hidrofílicos em óleos e sua elevada atividade antioxidante podem ser explicados
pelo chamado "paradoxo polar", no qual os antioxidantes polares em sistemas ricos em
lipídios, ou seja, em meios apolares, são mais eficazes que antioxidantes apolares e vice-
versa. Isso pois os compostos fenólicos são polares, e em interfaces ar-óleo (uma baixa
quantidade de ar) têm uma função mais protetora contra a oxidação, interrompendo a
cadeia de propagação, do que o antioxidante lipofilico, tais como tocoferóis, que
permanecem em solução no óleo (HUAN; OU; PRIOR 2005; ROGINSKY; LISSI, 2005;
SHAHIDI; JANITHA; WANASUNDRA, 1992).

Outros fatores como a termodinâmica das fases em PetroOxy dos antioxidantes podem
afetar o resultado final da estabilidade no equipamento, como o caso em que o antioxidante
Natália de Freitas Oliveira Página 173

pode entrar em equilíbrio com a fase vapor durante a análise na cápsula e, assim, afetar os
resultados das amostras, pois segundo Bendini et al. (2007) os antioxidantes naturais
apresentam propriedades complexas, que entre as interfaces ar-óleo e óleo-água podem
interferir significativamente nas atividades de diferentes sistemas lipídicos.

Baseados em estudos na literatura em que os extratos contendo antioxidantes


naturais têm melhores rendimentos em concentrações bem maiores que a estudada na
figura 5.19 (200ppm), Cordeiro et al. (2013), Reda et al. (2010) e Taghvaei et al. (2014),
entre outros, usaram em seus estudos a concentração de 5000ppm de extratos com
antioxidantes naturais, pois os extratos são uma mistura de compostos em que a classe
principal estudada se encontra em maior quantidade, e obtiveram bons rendimentos.
Segundo a resolução RDC n.23/2005 da ANVISA, a concentração máxima de
antioxidantes sintéticos em óleos vegetais para a indústria alimentícia é de 200 ppm.
Visando uma possível aplicação industrial para óleos vegetais, foram realizados
experimentos utilizando uma concentração máxima de 5000 ppm dos extratos sintetizados,
fazendo um comparativo ao BHA (200) ppm (Tabela 5.19).

TABELA 5.19 –Fatores de proteção dos antioxidantes naturais (5000ppm) e do BHA


(200ppm) nos óleos de canola e girassol em diferentes tempos de oxidação acelerada.
Óleo de canola Óleo de girassol
Antioxidantes – Fator de proteção (%)
Tempo (h)
MQ MF MDQ MDF BHA MQ MF MDQ MDF BHA

0 275,2 357,2 698,8 639,9 202,6 204,5 166,7 462,7 315,6 422,6
4 132,3 343,7 306 123,6 175,3 135,9 147,9 219,5 213,5 477
8 111,8 151,2 141,2 -- 128,9 130,2 118,1 218,2 98,3 401,6
12 305,6 638,9 423,7 715,98 234,9 154,8 96,5 106,1 81,3 395,8
24 808,5 608,5 458 325,9 269,8 115,3 95,9 106 97,9 412,6
48 300,9 404,8 244,8 401,1 277,7 -- -- -- -- 355,3
72 -- -- 301,7 217,7 221,5 -- -- -- -- 248,7
-- Não avaliado devido a falta de material.

Observa-se na tabela 5.19, que para todos os pontos estudados do óleo de canola, com
exceção do ponto em 8h de oxidação acelerada em forno schaal, os extratos apresentaram
melhor atividade antioxidante que o BHA. Esta atividade também pode ser observada após
72h da dupla oxidação acelerada (Forno Schaal+PetroOxy). A baixa estabilidade do óleo de
girassol confirma os resultados discutidos nos parágrafos anteriores, uma vez que ao contrario
Natália de Freitas Oliveira Página 174

do óleo de canola, sua maior proteção se deu em 4h de oxidação acelerada, levantando a


hipótese anteriormente descrita sobre a sua degradação e ida ao estágio de propagação nas
análises de peroxidação e formação de dienos e trienos.

Capítulo 6

Conclusões
Natália de Freitas Oliveira Página 175

6. CONCLUSÕES

Caracterização do tegumento

O estudo fitoquímico dos constituintes do tegumento da castanha de cajú realizado nos


extratos lipofílicos e hidrofílicos indicaram a presença dos metabolitos: ácidos fixos fortes,
ácidos fixos fracos, ácidos graxos, alcalóides, antranóis, bases quartenárias, catequinas,
esteroides, fenóis, flavononas, flavonóis, quinonas, resinas, saponinas, taninos catéquicos,
taninos pirogáticos e triterpenóides, detectando constituintes ainda não revelados em outros
estudos.

A caracterização e isolamento de compostos do extrato apolar, alcalóides, sais de


amônio e compostos fenólicos, foram confirmados por meio de análises qualitativas
especificas, CCD e estudo no IV. Os resultados permitem concluir que no TCC há uma
expressiva quantidade de compostos fenólicos.

Refino em escala de bancada dos óleos de canola e girassol

Neste trabalho desenvolveu-se uma nova metodologia de refino, que permite a


obtenção dos óleos de canola e girassol serem classificados como Tipo 1, de acordo com os
padrões definidos pela ANVISA.

Potencial antioxidante do TCC em óleos vegetais sob oxidação

Os extratos metanólicos do tegumento da castanha do caju, apresentaram


representativa quantidade de compostos fenólicos e atividade antioxidante.

A adição de antioxidantes naturais foi eficaz para assegurar a estabilidade oxidativa


dos óleos vegetais refinados. Os óleos foram submetidos ao envelhecimento acelerado
permite concluir que o óleo de canola é mais estável e resistente a longos períodos de
estocagem do que o óleo de girassol.

Dentre os extratos observados, pode-se concluir que o desengorduramento favoreceu a


remoção de compostos não-antioxidantes e a extração previa de ácidos graxos livres
Natália de Freitas Oliveira Página 176

aumentou a concentração dos antioxidantes do tegumento da castanha de cajú. Os extratos


MDF e MDQ foram os que forneceram melhores resultados de IA, IP, DC e TC em relação
aos óleos semantioxidante e comparados ao antioxidante sintético BHA, inibindo a oxidação.

A oxidação acelerada dos óleos já oxidados foi feita no PetroOxy, onde se avaliou se
após cada período estudado em estufa ainda estaria propenso a oxidação e se os antioxidantes
estariam ativos mesmo após este tempo conclui-se que: o óleo de canola foi o que apresentou
o melhor resultado de estabilidade oxidativa sem a adição de antioxidantes e os extratos MDF
e MDQ continuaram como os melhores inibidores de oxidação nos dois óleos estudados.

A melhor concentração verificada para aditivação dos óleos vegetais com


antioxidantes naturais é de 0,5% ou 5000ppm. Ao comparar a atividade do BHA com os
antioxidantes naturais, estes aplicados aos óleos de canola e girassol, conclui-se que o
antioxidante sintético (BHA) foi mais eficiente no óleo de girassol e os antioxidantes naturais
no óleo de canola.

Frente a estes resultados, pode-se concluir que o subproduto do processamento da


castanha do caju (TCC) pode ser apontado como fonte de antioxidantes naturais, com
perspectiva de ser empregado no desenvolvimento de novos produtos podendo ser aplicados
em óleos vegetais para deter a oxidação lipídica.
Natália de Freitas Oliveira Página 177

Capítulo 7

Referências Bibliográficas
Natália de Freitas Oliveira Página 178

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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