PRÁCTICA Nº 09: DETECCIÓN DE Salmonella

I. Introducción:

El género Salmonella se incluye en la familia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos

Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo tanto, las características
generales de las enterobacterias: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva,
oxidasa negativa y suelen ser móviles; representa una excepción Salmonella gallinarum,
siempre inmóvil.
La nomenclatura de Salmonella es compleja. Se han usado diferentes sistemas para
referir a este género. Teniendo en cuenta que estas bacterias tienen una muy importante
homología general de su ADN, deberían ser caracterizadas como dos únicas especies.
Esta propuesta, formulada por Le Minor y Popoff en la década de los ochenta, no ha
sido completamente aceptada. No obstante, y teniendo en cuenta la necesidad de
uniformizar la comunicación entre los distintos actores (médicos, veterinarios,
químicos, etc.), la mayoría ha optado por seguir una antigua propuesta de Kaufmann,
con las más recientes modificaciones (formuladas desde el Centro de Referencia
colaborador de la OMS, en el Instituto Pasteur); así, se divide el género en dos especies:
Salmonella enterica y Salmonella bongori, diferenciables entre sí por características
metabólicas tales como la hidrólisis del ONPG, el crecimiento en presencia de KCN y
otras.
Salmonella enterica se subdivide, a su vez, en seis subespecies: enterica (I), salamae
(II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houenae(IV), e indica (VI) que corresponden a
los antiguos subgéneros. Estas subespecies son diferenciables bioquímicamente.
Como todas las enterobacterias, el género Salmonella tiene tres tipos de antígenos:
somático (O), flagelar (H) y de envoltura, para Salmonella (Vi). Los antígenos
somáticos son termoestables y su especificidad radica en el componente polisacárido de
la endotoxina, complejo proteína- lipopolisacárido. Los antígenos O se clasifican en
mayores y menores; los mayores son los que definen un grupo antigénico. Así, el factor
antigénico 0:4 caracteriza el antiguo grupo B, hoy llamado O:4, mientras que los
antígenos menores tienen menor valor discriminativo. Por ejemplo, el antígeno O:12 lo
presenta toda Salmonella perteneciente a los grupos A, B y D. Pueden encontrarse otros
antígenos menores generados por modificaciones químicas o por conversiones fágicas.
Los antígenos capsulares o de envoltura sólo lo presentan algunos serotipos de
Salmonella (Typhi y Dublin). Los antígenos flagelares son proteicos y termolábiles.
Algunas serovariedades sólo producen un único tipo de antígeno H, siendo, en
consecuencia, monofásicos. Sin embargo otros serotipos pueden producir
alternativamente dos tipos de antígenos H, por lo que se denominan bifásicos.

II. Objetivos:

- Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de consumo humano.

- Realizar un recuento de Salmonella.
- Conocer el método de análisis y el uso de los medios de cultivo.

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 III. Materiales:

- Muestra de alimentos (en este - Agar verde brillante.

caso huevos de gallina). - Placas Petri
- Medio de enriquecimiento no - Tubos de dilución
selectivo (caldo lactosado) - Frascos
- Medio de enriquecimiento - Pipetas
selectivo (caldo selenito y caldo - Mechero Bunsen
tetrationato) - Gradillas

IV. Procedimiento:

- Como en este caso la muestra a estudiar han sido huevos crudos de gallina se
toman 5 de estos y se reparte en un frasco grande estéril (al introducirlos se los
rompe).
- Luego se le agrega 225 mL de caldo lactosado (enriquecimiento no selectivo).
- Los frascos se los envía a incubar a 37 ºC por 24 h.
- Pasado el tiempo, se preparan los tubos conteniendo 10 mL de los medios de
enriquecimiento selectivo (caldo Rapapott).
- Se inocula 1 mL de la muestra anterior a cada uno de los tubos y luego se los
separa, un par de tubos (C. Rapapott) van a incubación a 37 ºC y el otro par de
tubos van a 43 ºC y ambos por 24 h.
- Pasado el tiempo de incubación, se siembran de cada uno de los tubos en placas
con agar verde brillante. Éstas se incubarán a 37 ºC por 24 h.
- Luego, se realizarán a las colonias características, las pruebas bioquímicas
necesarias para su identificación.
Muestra: Huevos

225 mL caldo lactosado +

Enriquecimiento no 25 mL muestra
selectivo

37 ºC x 24 h.
Enriquecimiento
1 mL 1 mL selectivo

Caldo Caldo
Rapaportt Rapaportt

Incubar por 24 h.
37 ºC 42 ºC

Luego se
siembran en agar Se incuba a 37 ºC Pruebas bioquímicas
SS por 24 h

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 V. Resultados:

- De los tubos con caldo Rapaportt sembrados se los envió a incubación, cada uno
a sus temperaturas respectivas por 24 h. Pasado ese tiempo, se vio resultados:

- De los tubos obtenidos se sembró por agotamiento y estría en placas con agar
verde brillante. Se las incubó a 37 ºC por 24 h, pasado el tiempo se observó los
resultados.

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37 ºC 43 ºC
 VI. CONCLUSIÓN

 Al realizar tinción Gram a las colonias de las placas se observaron bacilos Gram
positivos, por lo que se puede afirmar que no se trata de salmonella.

 No se logró aislar Salmonella.

VII. Preguntas:

1. ¿Como se prepara el agua peptonada bufferada?

Medio de cultivo empleado para el preenriquecimiento de microorganismos a partir de
diferentes muestras.
Es ampliamente utilizado en protocolos de control higiénicos de alimentos para
búsqueda de Salmonella spp.
Formula:
Peptona De Carne 10.0
Cloruro De Sodio 5.0
Fosfato Disódico 3.5
Fosfato Monopotásico 1.5
Ph 7.2 ± 0.2

Preparación:
Disolver 20 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Mezclar
calentando hasta ebullición durante 1 minuto y distribuir en recipientes apropiados.

2. Componentes y lectura de medios de cultivo

Agar Verde Brillante
Formula* por litro de agua destilada
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona de proteosa Bacto 10,0
Lactosa 10,0
Sacarosa 10,0
Cloruro sódico 5,0
Rojo fenol 0,08
Agar 20,0
Verde brillante 12,5 mg
pH 6,9 +/- 0,2
*Ajustada o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
Microorganismos Resultados
Salmonella (distinta de S. Typhi y S. Colonias entre blancas y rojas, rodeadas de
Paratyphi) zonas rojas
S. Typhi y S. Paratyphi Crecimiento nulo, o sólo trazas de éste
Agar Salmonella - Shigella

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 Fórmula* por litro de agua purificada
Extracto de carne bovina 5,0 g
Digerido pancreático de caseína 2,5
Digerido péptico de tejido animal 2,5
Lactosa 10,0
Sales biliares 8,5
Citrato sódico 8,5
Tiosulfato sódico 8,5
Citrato férrico 1,0
Rojo neutro 0,025
Agar 13,5
Verde brillante 0,330 mg
pH 7,2 ± 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
Organismos BD Salmonella Shigella Agar
Salmonella Incoloro, generalmente con centro de colornegro

VIII. Referencias:

SALMONELLA (2003) Generalidades del género. Obtenido el 15 de febrero de

2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/salmonella.pdf
ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Aislamiento e
identificación de Salmonella. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_d
e_microlimentos.htm
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en
Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.
WIKIPEDIA: LA ENCICLOPEDIA LIBRE (2008) Salmonella. Obtenido el 15 de
febrero de 2008 en http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella
DE LA TORRE MARTINEZ, M. E. (2006). Caracterizacion molecular y fenotípica
como herramienta de marcaje epidemiológico para cepas de Salmonella de
origen pocino. Obtenido el 15 de febrero de 2008 en
http://www.tesisenxarxa.net/TDX-1013106-104441/index.html