Determinación de clorofila requiere de un primer paso de filtración de la muestra en el que

separaremos el material particulado que contiene la clorofila

Filtración de la muestra

Material Necesario. - Membranas filtrantes de nitro celulosa de 47 mm de diámetro y 045 micras

de tamaño de poro, embudo magnético, Matraz kitasato, rampa de filtración, bomba de vacio,
pinzas probetas, pape de auminio y tubos de polietileno para almacenar los filtros con mterial
particulado

Procedimiento.- Se filtra un volumen de muestra conocido ene ste caso 200 ml utilizando el
sistema de filtració descrito anteriormente, (se coloca en la probeta 200 ml)

Colocar 20 ml de muestra en una probeta graduada, colocar a base del filtro magnético sobre la
parte superior del matra kitasato, colocar el filtro de nitro celulosa sobre la base del embudo y
posteriormente colocar el embudo magnético en su base, agregar los 200 ml de muestra en el
embudo mágnetico, esperar que la muestra pase a través del filtro, retirar el filtro
cuidadosamente con las filtras plegando hacia el interior para que el contenido filtrado quede
hacia dentro, colocar el filtro dentro de un tubo de polietileno, curbir cn papel aluminio, para
evitar la foto degradación, y se guarda en un congelador. -20° 1 mes, -80° más de un mes.

La finalidad de la congelación además de su conservación es romper las células y que de esta

forma se puedan liberar más fácilmente los pigmentos facilitando el proceso posterior de
extracción.

Extracción y determinación espectrofotométrica de pigmentos

Material necesario.- Acetona al 90%, centrifuga, cubetas de cuarzo de 1 cm o de 5 cm de longitud

de paso y un espectrofotómetro.

Procedimiento .- La extracción de pigmentos se realiza con acetona al 90% para ello se retira el
filtro del tubo de polietileno y se adiciona al tubo que lo contiene 6 mL de acetona al 90%, el tubo
con acetona se guarda en la oscuridad refrigerado a unos 4°C durante un tiempo no inferior a 2
horas y no superior a 24. Para separar el material particulado del extracto que contiene los
pigmentos se centrifuga el tubo a 2500 RPM durante 5 min para separar ambas partes.
Se realiza la medida de espectrofotometría a una muestra de acetona del mismo volumen de la
muestra a la misma longitudes de onda que se relizará a a muestra

Posteriormente se realizan las siguientes pruebas a 630, 647 y 664 nanometros, y una cuarta a 750
nm que tiene en cuenta la absorbancia no debido en los pigmentos, se utiliza la cubeta de 1 cm de
long. De paso.

En la siguiente pantalla se observa el resultado de la determinación espectrofotométrica de la

muestra en el que se ven los vaores de absorbancia obtenidos para cada una de las 4 longitudes de
onda (0.1002, 0.2072, 0.4214, 0.0028)

Posteriormente para el cálculo de las concentraciones de las clorofilas en mg/m3 se aplican las
siguientes fórmulas:

𝑚𝑔 ((11.85 ∗ ( 𝐴664 − 𝐴750 )) − (1.54 ∗ ( 𝐴647 − 𝐴750 )) − (0.08 ∗ ( 𝐴630 − 𝐴750 )))
𝐶𝑙 𝑎 ( ⁄𝑚3 ) = 𝑉𝑒 ∗
𝑉𝑓 ∗ 𝐿

𝑚𝑔 ((21.03 ∗ ( 𝐴647 − 𝐴750 )) − (5.43 ∗ ( 𝐴664 − 𝐴750 )) − (2.66 ∗ ( 𝐴630 − 𝐴750 )))
𝐶𝑙 𝑏 ( ⁄𝑚3 ) = 𝑉𝑒 ∗
𝑉𝑓 ∗ 𝐿

𝑚𝑔 ((24.52 ∗ ( 𝐴630 − 𝐴750 )) − (1.67 ∗ ( 𝐴664 − 𝐴750 )) − (7.60 ∗ ( 𝐴647 − 𝐴750 )))
𝐶𝑙 𝑎 ( ⁄𝑚3 ) = 𝑉𝑒 ∗
𝑉𝑓 ∗ 𝐿

Donde:

𝐴750 = 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑎 750 𝑛𝑚

𝐴664 = 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑎 664 𝑛𝑚
𝐴647 = 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑎 647 𝑛𝑚
𝐴630 = 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑎 630 𝑛𝑚
𝑉𝑒 = 𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑜𝑛𝑎 (𝑚𝐿)
𝑉𝑓 = 𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎

𝐿 = 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎

Resultados

𝑚𝑔 ((11.85 ∗ ( 0.4214 − 0.0028)) − (1.54 ∗ ( 0.2072 − 0.0028)) − (0.08 ∗ ( 0.1002 − 0.0028)))

𝐶𝑙 𝑎 ( ⁄𝑚3 ) = 6𝑚𝐿 ∗
0.2 𝐿 ∗ 1 𝑐𝑚
𝑚𝑔
𝐶𝑙 𝑎 ( ⁄𝑚3 ) = 139.14

𝑚𝑔 ((21.03 ∗ ( 0.2072 − 0.0028)) − (5.43 ∗ ( 0.4214 − 0.0028)) − (2.66 ∗ ( 0.1002 − 0.0028)))

𝐶𝑙 𝑏 ( ⁄𝑚3 ) = 6𝑚𝐿 ∗
0.2 𝐿 ∗ 1 𝑐𝑚
𝑚𝑔
𝐶𝑙 𝑏 ( ⁄𝑚3 ) = 52.99

𝑚𝑔 ((24.52 ∗ ( 0.1002 − 0.0028)) − (1.67 ∗ ( 0.4214 − 0.0028)) − (7.60 ∗ ( 0.2072 − 0.0028)))

𝐶𝑙 𝑎 ( ⁄𝑚3 ) = 6𝑚𝐿 ∗
0.2 𝐿 ∗ 1 𝑐𝑚
𝑚𝑔
𝐶𝑙 𝑐 ( ⁄𝑚3 ) = 4.07

El segundo paso consiste en la extracción del pigmento de ste material particulado para su
posterior determinación espectrofotométrica

Y por último los cálculos que nos permiten obtener las concentraciones de clorofila

Conclusión.

En este video se realizo la filtraccion y extracción de pigmentos fotosintéticos de una muestra de

agua

Determinado la concentraciónd e pigmentos

Aplicado las ecuaciones para obtener los resultados.