TALLER “LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN EL CULTIVO "IN VITRO"

DE TEJIDOS VEGETALES”

Universidad Francisco De Paula Santander

Facultad De Ciencias Agrarias y Del Ambiente

Ingeniería Biotecnológica

1. Qué es un contaminante en cultivo "in vitro" de tejidos vegetales.

Se entiende como contaminación todo aquel crecimiento microbiano en el contenedor de cultivo
de tejidos vegetales.
La contaminación en el cultivo de tejidos puede originarse de dos fuentes fundamentales: una
llevada a cabo por microorganismos en la superficie (levaduras, bacterias) o en los tejidos de los
explantes (hongos filamentosos) , o por deficiencias en la manipulación de los operadores en los
laboratorios.
2. Todos los microorganismos que pueden desarrollarse en un frasco de cultivo "in
vitro" de tejidos vegetales se consideran contaminantes? Explique su respuesta.
Si son contaminantes, pero estos microorganismos al reducir su expresión en los medios de
cultivo junto con el conocimiento e identificación pueden mejorar el enraizamiento. Las bacterias
del género Pseudomonas al usarcé en vitroplantas de papa logran estimular crecimiento de la planta
y protección hacia otras contaminantes. Algunos plásmidos de bacterias se pueden insertar en
genes de plantas (Alvarado, 1998).
3. ¿Qué problemas puede traer la contaminación microbiana en los trabajos de cultivo
de tejidos vegetales? Qué problemas principales causa a los tejidos en desarrollo?
La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la micropropagación de
especies vegetales a nivel mundial, produce cuantiosas pérdidas de material, tanto en los trabajos
de investigación como en la micropropagación comercial. Puede tener dos orígenes: a)
microorganismos que colonizan la superficie o el interior del ex plante (endófitos) y b)
microorganismos introducidos durante la manipulación en el laboratorio (Debergh y Zimmerman,
1991).
En los cultivos de tejido causa pérdidas frecuentes de material vegetal, en las zonas tropicales
alcanza altas proporciones dado que el clima y ambiente son propicios para el desarrollo y
multiplicación de microrganismos. En los tejidos de desarrollo compiten los microrganismos por
nutrientes del medio, daños directos o indirectos por la colonización de sus tejidos o la expulsión
al medio de cultivo de metabolitos tóxicos. Reduciendo la multiplicación, inhibe el enraizamiento
y muerte de la planta (cassells, 1991).
4. Establezca los conceptos y las diferencias entre un microorganismo fitopatógeno y un
vitropatógeno.
se denomina fitopatógeno a un organismo, en general microorganismo, que genera
enfermedades en las plantas a través de disturbios en el metabolismo celular. Algunos
fitopatógenos pueden causar también enfermedades al crecer y multiplicarse en el xilema y en el
floema de la planta y, por ende, bloquear el transporte de agua y de nutrientes desde la raíz hacia
las hojas o el flujo de savia desde las hojas hacia el resto de la planta.
Se considera vitropatogeno a cualquier microorganismo que genere contaminación en un
contenedor “in vitro”.

microorganismo fitopatógeno vitropatógeno

Los nematodos infectan siempre el sistema A diferencia de los hongos y levaduras,
radicular. Son biotróficos, poseen un estilete estas bacterias no producen crecimiento visible
hueco capaz de atravesar las paredes celulares; en el medio o síntomas en las plantas hasta un
muchos modifican el metabolismo de la célula tiempo después de haber sido introducidas
infectada e inducen estructuras especializadas dentro del cultivo de tejidos.
en ella para nutrirse.
La mayoría de los patógenos de plantas son La mayoría de las bacterias aisladas como
hongos de las divisiones ascomicetos, contaminantes del cultivo de tejidos son
basidiomicetos u oomicetos. especies que no se conocen como patógenos de
plantas in vivo.
Las bacterias colonizan espacios Muchas de estas bacterias son introducidas
intercelulares en distintos órganos o el xilema con el explante, mientras que otras son
rodeadas de polisacáridos superficiales, que claramente introducidas en el laboratorio
aumentan su virulencia. Muchas secretan durante el subcultivo.
toxinas que causan daños celulares, entre ellas
enzimas que degradan paredes celulares.
 La patogenia causada por virus es muy A diferencia de los hongos y levaduras,
característica en cuanto a que el patógeno se estas bacterias no producen crecimiento visible
incorpora a sí mismo en el metabolismo de la en el medio o síntomas en las plantas hasta un
célula hospedadora. Después de infectar una tiempo después de haber sido introducidas
célula vegetal viva, el virus se libera de su dentro del cultivo de tejidos.
cubierta proteica e introduce su material
genético en el interior del hospedador.

5. ¿Qué se entiende por contaminación endógena o latente? Cuáles son los grupos y
géneros de microorganismos más asociados a este tipo de contaminación? ¿Cuál es la
fuente de este tipo de contaminación? ¿Como se controla en los trabajos de cultivo
"in vitro"?
La contaminación endógena o latente es la contaminación que proviene del explante en la etapa
de establecimiento y se extiende al medio de cultivo.
Cuando se reporta contaminación endógena se hace referencia generalmente a bacterias
patógenas o no patógenas, levaduras y a organismos fastidiosos como los virus, viroides,
micoplasmas y rickettsias. En este tipo de contaminación se han aislado especies de bacterias
pertenecientes a los géneros : Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Mycobacterium,
Pseudomonas, Enterobacter, Acinetobacter, Xanthomonas, Lactobacillus, Erwinia,
Agrobacterium, Corynebacterium, entre otros. Para tratar de controlar la contaminación se realiza
una rutina de desinfección para la eliminación de los contaminantes microbianos de la superficie
de los explante por el cual se eliminan comúnmente por inmersión de estos en disoluciones
desinfectantes tales como : etanol, hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, peróxido de
hidrógeno, cloro comercial, tween, entre otros, con un rango de tiempo establecido para obtener
mayor rendimiento en la desinfección (Alvarado, 1998).

6. ¿Cuál es la contaminación exógena? ¿cuáles son las diversas fuentes de contaminantes

exógenos? Relaciones los tipos y géneros de microorganismos con la fuente de
contaminación probable y con la forma y momento en que aparecen. Explique cómo
se controlan cada uno de los casos.
 La contaminación exógena es la que proviene de otras fuentes como los equipos e instrumentos
del trabajo, el hombre, el ambiente, entre otros y se introduce al laboratorio, por el cual el
contaminante microbiano crece en el medio de cultivo alrededor del explante hasta cubrirlo
completamente (Anonymous, 2017).
Las diversas fuentes de contaminación exógenas son las siguientes:
La contaminación por el factor humano es debido a inadecuadas técnicas de asepsia, se
encuentran microorganismos como : Staphylococcus, Candida albicans, hongos filamentosos. Se
puede reducir los riesgos empleando medios de protección como gorros, tapabocas y guantes,
teniendo una adecuada técnica de asepsia.
En los equipos se pueden presentar contaminación por el mal funcionamiento de los equipos de
esterilización como la autoclave, horno, cabinas de flujo laminar y contaminación por instrumentos
es debido a la inadecuada esterilización de los instrumentos utilizados, se encuentran
microorganismos como el género Bacillus sp. Se puede reducir el riesgo de contaminación
manteniendo un chequeo periódico de la eficiencia y funcionamiento de los equipos e
instrumentos.
Se encuentra contaminación por ambiente debido a las condiciones higiénico sanitarias
deficientes e intercambio con el ambiente exterior, se encuentra microorganismos como:
Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium, Micrococcus, Bacillus,
Rhodotorula, Candida, Chryptococcus. Para los muestreos ambientales resulta de gran utilidad
establecer puntos fijos de muestreo y repetir los ensayos manteniendo ciertas regularidades (tipo
de medio de cultivo, tamaño de las placas de Petri, tiempo de exposición, entre otros.) que permitan
determinar los patrones del número de microorganismos permisibles en el ambiente de cada local
(Alvarado, 1998).
Se controla en el caso de las bacterias con altas presiones osmóticas, el PH, hormonas como
citoquininas que ejerce efecto bacteriostático sobre ellas (Anonymous, 2017).

7. Qué importancia considera usted tiene detectar a tiempo un contaminante en un

proceso de propagación masiva? Como puede ser detectado en etapas tempranas del
cultivo "in vitro"? Cuál es la importancia de poder identificar al menos el género del
contaminante?
 La detección temprana de la contaminación es esencial para prevenir las pérdidas. Para ello, se
requiere de métodos rápidos y seguros. A diferencia de los hongos filamentosos y las levaduras,
las bacterias a menudo no producen crecimiento visible sobre el medio o síntomas en las plantas
hasta mucho tiempo después de que fueron introducidas.
En todas las fases los explantes deben ser muestreados para detectar la presencia de
contaminantes bacterianos. Aunque se precisa de métodos rápidos y seguros de detección
temprana; entre los más utilizados se encuentran rozar la superficie cortada del explante sobre un
medio de cultivo bacteriológico durante los subcultivos y la transferencia de fragmentos de
material vegetal a medios de cultivos bacteriológicos. Se ha referido también la modificación de
los medios de cultivo de las plantas con la adición de componentes de medios para el cultivo de
bacterias, agua de coco y variando el pH. Además, los métodos turbidimétricos han sido utilizados
por algunos autores. (Hernández Y.I, González M. E.II 2010).
La determinación exacta de la fuente de contaminación retrospectivamente a menudo se
dificulta, ya que los microorganismos pueden ser introducidos en varios puntos del proceso
productivo. Hay vías para controlar y manejar la contaminación pero es necesario determinar el
tipo de contaminante y la fuente para poder seleccionar los mejores métodos.

8. Una vez que el material vegetal "in vitro" se encuentra contaminado, que acciones se
deben tomar? Como puede usted tratar el material vegetal contaminado y que se
requiera obligatoriamente "salvar" de la contaminación.
Si se tienen en cuenta aspectos tales como: que la contaminación en la población de plantas
cultivadas in vitro está causada por un mismo microorganismo, que este se caracterice, que se
realicen las pruebas de susceptibilidad de los contaminantes frente a los productos antimicrobianos
y se determine la Mínima Concentración Inhibitoria (MCI), la Mínima Concentración Bactericida
o la Mínima Concentración Fungicida de estos, así como que se verifique su no fitotoxicidad,
pueden ser una alternativa para solucionar este problema. En el caso de los fungicidas, entre los
que se han empleado con mejores resultados se encuentran el benomil y el carbendazim. Para
determinar la susceptibilidad de los hongos a diferentes sustancias con acción fungicida se refiere
el método de dilución en agar con discos de micelio como inóculo. (Hernández Y.I, González M.
E.II 2010).
 En la lucha por prevenir o eliminar la contaminación bacteriana en el cultivo in vitro de células
y tejidos vegetales se han ensayado y puesto en práctica diferentes alternativas. No obstante, los
métodos para eliminar los microorganismos y mantener los cultivos libres de contaminantes no
son aún satisfactorios. Se requiere de estudios que profundicen en el conocimiento de las
poblaciones de bacterias contaminantes en los ecosistemas in vitro, en sus características y
funciones para trazar estrategias de prevención y control más eficientes. (Alvarado Y., Cruz M.,
Portal N., García L., Freire M., Quiala E., Gómez R. 2003).

Bibliografía
 Alvarado, Y. Contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas. En: J. N. Pérez,
(ed.). Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de
Biotecnología de las Plantas. Santa Clara. Cuba. 1998. 81–104 p.
 Alvarado C. Y., Cruz M. M., Portal G. N., García A. L., Freire S. M., Quiala E., Gómez K.
R. (Abril - junio 2003). Estrategia de Trabajo para la Prevención y el Control de la
Contaminación Bacteriana en la Micropropagación de la Caña de Azúcar. Instituto de
Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de las Villas. Villa Clara,
Cuba. Biotecnología vegetal Vol. 3, No. 2: 77. Recuperado de:
https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/221/html.
 Anonymous. (2017). Contaminacion microbiana en el cultivo in vitro de plantas. Obtenido
de https://edoc.tips/download/teller-biotecnologia_pdf
 Cassells, AC (1991) Problem in tissue culture: culture contamination. En: Debergh, P y
Zimmerman RH (Eds) Micropropagation, pp. 31-45. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht.
 Debergh, P. y Zimmerman, R. Micropropagation Technology and Application. Ed. Kluwer
Academic Publishers. 1991, 484 p.
 Hernández Y.I, González M. E.II (2010). Efectos de la Contaminación microbiana y
oxidación fenólica en el establecimiento in vitro de frutales perennes. I Reserva Científica.
II Investigadora Auxiliar del departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal, Instituto
Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), La Habana, Cuba, CP 32700. Recuperado de:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362010000400015.