TECNOLÓGICO NACIONAL

DE MÉXICO
Instituto Tecnológico Superior de la Región Sierra

EVALUACIÓN in vitro DE LA EFICACIA BIOLÓGICA

DE MICROORGANISMOS EFICACES PARA EL
CONTROL DE Ralstonia solanacearum Raza 2

TESIS
PROFESIONAL
(OPCIÓN I)

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE

INGENIERO AGRONOMO CON ESPECIALIDAD EN
SISTEMAS DE PRODUCCIÓN AGROPECUARIOS DEL
TRÓPICO

PRESENTA:

AMÉRICA PÉREZ GUTIÉRREZ

BAJO LA DIRECCIÓN DE:

M.C GERARDO RAMÍREZ SANDOVAL

Teapa, Tabasco Noviembre de 2018

 DEDICATORIA

Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme
el haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.
Por los triunfos y los momentos difíciles que me ha enseñado a valorarlo cada día
más en la vida. A mi madre, por ser el pilar más importante y por demostrarme
siempre su cariño y apoyo incondicional sin importar nuestras diferencias de
opiniones. A mi hermanita que siempre ha estado junto a mí y brindándome su
apoyo. A mis profesores, gracias por su tiempo, por su apoyo, así como la sabiduría
que me transmitieron en el desarrollo de mi formación profesional. A mis amigos
que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que, hasta
ahora, seguimos siendo amigos.

Dedico esta tesis a todos aquellos que me apoyaron moral y económicamente.

Dedico esta tesis a todos aquellos que no creyeron en mí, a aquellos que esperaban
mi fracaso en cada paso que daba hacia la culminación de mis estudios, a aquellos
que nunca esperaban que lograría terminar la carrera, a todos aquellos que
esperaban que me rendiría a medio camino.

ii
 AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por protegerme durante todo mi camino y darme fuerzas para
superar obstáculos y dificultades a lo largo de toda mi vida.

Agradezco también la confianza y el apoyo brindado por parte de mi madre, que sin
duda alguna en el trayecto de mi vida me ha demostrado su amor, corrigiendo mis
errores y celebrando mis triunfos.

A mis hermanos, que con sus consejos me han ayudado a afrontar los retos que se
han presentado a lo largo de mi vida.

Agradezco especialmente a mi hermanita Ana, por su apoyo incondicional en el

transcurso de mi carrera universitaria.

Agradecerle al Biólogo Gerardo Ramírez Sandoval por su valioso guía y

asesoramiento brindado, durante la elaboración de este proyecto.

Gracias al Instituto Tecnológico Superior de la Región Sierra, por haberme

permitido formarme parte de él. Gracias a todas las personas que fueron participes
de este proceso, ya sea de manera directa o indirecta, gracias a todos ustedes,
fueron ustedes los responsables de realizar su pequeño aporte, que el día de hoy
se verá reflejado en la culminación de mi paso por la Universidad. Este es un
momento muy especial que espero, perdure en el tiempo, no solo en la mente de
las personas a quienes agradecí, sino también a quienes invirtieron su tiempo para
echarle una mirada a mi proyecto de tesis; así mismo les agradezco con todo mi
ser.

iii
 INDICE GENERAL

Pág.
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1
II. OBJETIVOS ....................................................................................................... 6
2.1 Objetivo general: ........................................................................................... 6

2.2 Objetivo específico: ....................................................................................... 6

2.3 Hipótesis ....................................................................................................... 6

Ill. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................ 7

3.1 Patogenicidad ............................................................................................... 8

3.2 Mecanismos de dispersión ............................................................................ 8

lV. MATERIALES Y METODOS ........................................................................... 11

4.1 Activación de los microorganismos eficaces (ME) ...................................... 11

4.2 Toma de muestras ...................................................................................... 11

4.3 Preparación de medio de cultivo con cloruro de tetrazolio (CTZ)................ 13

4.4 Preparación de las concentraciones de M E ............................................... 13

4.5 Modificación del medio de cultivo con ME .................................................. 13

4.6 Proceso de muestras y siembra de la bacteria en medio de cultivo............ 14

4.7 Evaluación de los tratamientos ................................................................... 14

V. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................................ 16

5.1 Aislamiento e identificación de las bacterias ............................................... 16

5.2 Cuantificación de colonias bacterianas aisladas en medio de cultivo CTZ . 16

VI. CONCLUSIONES ........................................................................................... 20

VII. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 21

iv
 INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Activación de ME................................................................................... 12

Figura 2. Solución de Cloruro de tetrazolio .......................................................... 12
Figura 3. Mezcla de medio de cultivo. .................................................................. 12
Figura 4. Vaciado en caja de Petri. ...................................................................... 12
Figura 5. Medio de cultivo modificado con diferentes concentraciones de ME. ... 12
Figura 6. Cajas de Petri en incubadora ................................................................ 12
Figura 7. Frutos infectados por Moko ................................................................... 15
Figura 8. Corte de fruto enfermo .......................................................................... 15
Figura 9. Desinfección de la muestra ................................................................... 15
Figura 10. Reposo de la solución ......................................................................... 15
Figura 11. Siembra en medio de cultivo ............................................................... 15
Figura 12. Conteo de las colonias ........................................................................ 17
Figura 13. Colonias bacterianas de muestras de fruto en medio con ME al 20%. 17
Figura 14. Colonias de muestras de suelo infestado con Moko. .......................... 17
Figura 15. Colonias bacterianas en el testigo sin ME........................................... 17
Figura 16. Colonias bacterianas de muestras de cormo en el testigo sin ME. ..... 17
Figura 17. Colonias bacterianas de muestras de fruto en medio con ME al 60%..17

v
 INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Numero promedio de colonias de R. solanacearum obtenidas de diferentes

órganos de una planta de plátano y suelo infectado por Moko a los cuatro días de
la siembra en medio de cultivo CTZ sin ME. ........................................................ 16
Tabla 2. Número de colonias de R. solanacearum aisladas en medio de CTZ
modificado con diferentes concentraciones de microorganismos eficaces. ......... 18

vi
 RESUMEN

Se evaluó el efecto in vitro de microorganismos eficaces (ME) en concentraciones

de 20%, 40%, 60%, 80% y 100% para controlar el crecimiento de la bacteria
Ralstonia solanacearum en medio de cultivo de cloruro de tetrazolio (CTZ). Se
tomaron muestras de fruto, pseudotallo, cormo e hijuelo de plantas de plátano
afectadas por la enfermedad Moko o marchitez bacteriana, así como del suelo
circundante a la planta enferma. Trozos de tejido enfermo de los diferentes órganos
se remojaron en agua destilada estéril y un gramo de suelo se disolvió en agua
para la extracción de la bacteria formando soluciones concentradas del patógeno.
En un primer ensayo las diferentes soluciones bacterianas se sembraron en medio
de cultivo de cloruro de tetrazolio que permitió conformar la presencia de este
patógeno, en el que las colonias típicas de R. solanacearum fueron más
abundantes en cormo e hijuelo, que en fruto y en el suelo. En un segundo ensayo
se obtuvo una solución bacteriana concentrada de muestras de cormo y se sembró
en medio de CTZ modificado con diferentes concentraciones de ME. Después de
cuatro días se verificó la presencia y se cuantificó el número de colonias de R.
solanacearum y se encontró que la cantidad de colonias disminuyó hasta cero al
aumentar la concentración de ME en el medio de cultivo. El número de colonias fue
de 99, 74, 76, 0.6 y 0, en las concentraciones de 20%, 40%, 60%, 80% y 100%,
respectivamente, de ME en el medio de cultivo. Estos resultados son similares los
obtenidos en un estudio previo y confirman el potencial de control del los ME sobre
la bacteria patógena del Moko del plátano.

vii
 I. INTRODUCCIÓN

El plátano (Musa sp) es uno de los cultivos más importantes en la agricultura

mexicana, ocupa el segundo lugar de la producción en frutas tropicales porque es
básico en la alimentación, su precio bajo, sabor agradable, disponibilidad todo el
año, combinaciones múltiples en la preparación de alimentos, genera sensación de
saciedad, su valor nutritivo es alto y aporta potasio, hierro y vitamina K. El consumo
total y per cápita promedio del 2000 al 2010 fue 2’037,909 toneladas y 19.7 Kg,
respectivamente; la producción fue 2’114,182 toneladas, de la cual 96.4% fue para
el mercado nacional.

Los principales estados productores de plátano en México son Chiapas, Tabasco,

Veracruz, Michoacán, Nayarit, Oaxaca, Guerrero, Puebla, Colima y Jalisco, y en
conjunto en 2009 aportaron 84.6% de la producción. Esta es una fuente importante
de empleos, con aproximadamente 5,000 productores en esos estados y en
Michoacán, Oaxaca, Nayarit, Puebla y Guerrero. Estos estados ocupan 80 000 a 8
8000 jornales en la producción y el empaque y la generación aproximada de 100
000 empleos directos en el campo y 150 000 indirectos.

El cultivo de plátano es atacado por diferentes plagas y enfermedades que reducen

la calidad y la cantidad de producción, lo que provoca grandes pérdidas. Una de las
enfermedades más importantes que afectan a este cultivo es el Moko, causado por
la bacteria Ralstonia solanacearum Raza 2 la cual afecta a todas las variedades de
plátanos tripoides de los grupos AAA (bananos), AAB (plátanos), ABB (Guineos),
así como los plátanos diploides del grupo AA (dominicos o dátil). Asimismo, infecta
a otras especies de Musáceas y Solanáceas a las que les causa la muerte.

R. solanacearum raza 2 vive libremente en el suelo y agua, de manera latente con

la maleza y de forma parasitaria. Esta bacteria afecta el sistema vascular de la
planta, se distribuye en forma sistémica desde el rizoma hasta la flor masculina. La
enfermedad puede iniciarse cuando el patógeno se introduce a través de rizomas
enfermos. Las plantas desarrolladas a partir de esos propágulos pueden producir
racimos, donde los nectarios de la flor masculina contienen gran cantidad de
bacterias y al ser acarreadas por insectos son llevadas a las flores de plantas sanas.
Lo que ocasiona que infección comience de las flores hasta alcanzar el rizoma y

1
las raíces. La transmisión también se da cuando las raíces enfermas se entrecruzan
con sanas o por medio de las herramientas contaminadas que se emplean en las
labores culturales.

Epidemiologia. La temperatura optima en laboratorio para el desarrollo de R.

solanacearum raza 2 es de 35-37º C y no crece a más de 40º C. En campo, la
severidad de la enfermedad, está directamente asociada con el alto grado de
humedad del suelo, principalmente en las épocas de lluvia. La persistencia de R.
solanacearum raza 2 en suelo se debe a que la bacteria sobre vive en las
plantaciones o permanece latente en los residuos de cosecha infectados y/o en la
rizosfera de malezas hospedantes.

Los síntomas típicos de la enfermedad dependen de la edad de la planta al

momento de la infección. En hijuelos y plantas jóvenes las hojas se amarillan, luego
se necrosan y finalmente la planta muere. En plantas recién florecidas puede
presentarse o no un marchitamiento del follaje y los frutos detienen su desarrollo,
se deforman y necrosan. En plantas con racimos jóvenes los frutos desarrollan una
pudrición seca de la pulpa mientras que la cascara permanece verde; en racimos
próximos a la cosecha aparecen frutos que maduran prematuramente y se
necrosan, presentando una pudrición seca de la pulpa; en ambos casos puede o
no haber amarillamiento y necrosis del follaje. En plantas de cualquier edad
infectadas con Moko se observa una necrosis de los vasos del xilema en las vainas
de las hojas que forman el pseudotallo.

La bacteria tiene un amplio rango de hospederos, cerca de 50 familias botánicas y

más de 200 especies. En plantaciones de banano y plátano en México la bacteria
se asocia con arvenses que se encuentran en altas poblaciones contribuyendo a
su sobrevivencia y permanencia en el campo. La presencia de la enfermedad en
las zonas productoras de Tabasco ha tenido un comportamiento variable con
aumentos considerables en las pérdidas económicas (Ramírez et al., 2006).

La importancia de esta bacteria se relaciona con su amplio rango de hospederos,

fácil diseminación, alta variabilidad genética y fisiológica, y su exigente y riguroso
control en las áreas afectadas. La enfermedad demanda altos costos de control
tanto por la destrucción de plantas enfermas y asintomáticas en los focos de

2
enfermedad así como por el tiempo de la cuarentena necesaria para limitar su
presencia.

En México la distribución de esta enfermedad se reportó por primera vez en 1960

procedente de Guatemala posteriormente en Tapachula, Chiapas, y a finales de
1991 se reportó en una plantación de Tacotalpa, Tabasco.

Distribución de la enfermedad en Tabasco, en 1991se reporto plantas de plátano

afectadas por Moko bacteriano en fincas de la zona platanera de Tacotalpa,
Tabasco, señalaron que a finales de 1994 y durante 1995 se detectaron nuevos
casos de Moko en fincas de la región de la sierra de Tabasco de norte de Chiapas.
Desde su detección en 1991 en Tacotalpa, la enfermedad se disemino hacia otro
municipio de Teapa.

La presencia de esta enfermedad afecta directamente a muchos productores y

familias que dependen de este cultivo. Otra razón buscar productos inocuos para
usarlos como alternativa para el control de la bacteria Ralstonia solanacearum
causante del Moko del plátano. Además de que constituye un problema potencial
para aquellos países o áreas en los que aun no está presente debido a que afecta
a todos los estados de desarrollo de la planta, se disemina fácilmente y es un factor
determinante en la restricción comercial de la producción obtenida.

El impacto económico del Moko en el cultivo se debe a la disminución de área

productiva en las fincas y los gastos por concepto de la desinfección de la
herramienta, de vigilancia y la destrucción de plantas enfermas. El Comité Estatal
de Sanidad Vegetal estima las pérdidas causadas por Moko en $ 2,500 por foco de
infección (mínimo de cinco plantas) en la región de la Sierra de Tabasco, cantidad
que incluye la pérdida de la fruta, la eliminación de plantas enfermas y circundantes,
el costo del tratamiento, la pérdida de inversión y el costo del replante. En una finca
ha presentado hasta veinte focos de infección al mes.

No existe control químico contra esta enfermedad ni variedades comerciales con

resistencia genética al Moko. En México las acciones regulatorias contra esta
enfermedad están contenidas en la norma NOM-068-SAG/FITO-2015,
actualización de la NOM-068-FITO-2000, por la que se establece las medidas
fitosanitarias para combatir el Moko del plátano y prevenir su dispersión, que

3
incluyen la desinfección de herramientas y el suelo, así como la eliminación de
plantas enfermas usando algún desinfectante autorizado por la COFEPRIS (DOF,
2000).

En el proceso de eliminación de focos de infección se recomienda matar con

herbicida la planta enferma y aplicar algún bactericida a la herramienta y al suelo
donde se encontraba la planta. Los productos que se usan comúnmente para la
desinfección del suelo en áreas infestadas con la bacteria son sales cuaternarias
de amonio, metamsodio y en algunos casos bromuro de metilo, sin embargo, estos
productos son nocivos para la salud humana y al medioambiente y se desconoce
su eficacia real en el control del patógeno y su efecto en la prevalencia de la
enfermedad en las fincas bananeras.

Con el propósito de desarrollar tecnologías de producción inocuas y amigables con

el ambiente, es imperativo buscar alternativas para sustituir a estos productos en el
manejo integrado del Moko del plátano mediante controles biológicos como son el
uso de microorganismos eficaces (ME), los cuales son una combinación de
microorganismos benéficos de origen natural que incluye principalmente levaduras,
bacterias acidolácticas, bacterias fotosintéticas y actinomicetos, que tienen la
capacidad de suprimir las poblaciones de organismos patógenos.

Los microorganismos eficaces (ME) son una combinación de microorganismos

benéficos de origen natural que incluye principalmente levaduras, bacterias
acidolácticas y bacterias fotosintéticas, las cuales desarrollan una sinergia
metabólica que permite su aplicación en diferentes campos. Cuando entran en
contacto con materia orgánica secretan substancias benéficas como vitaminas,
ácidos orgánicos, minerales quilatados y fundamentalmente substancias
antioxidantes. Al incrementar su población se incrementa la actividad de los
microorganismos naturales balanceando los ecosistemas microbianos y
suprimiendo microorganismos patógenos.

Los ME funcionan como una medida control biológicos de patógenos que se da con
la introducción de estos microorganismos benéficos al ambiente de la planta. Los
parásitos y patógenos son destruidos o controlados con procesos naturales, como
la competitividad y antagonismo. Los microorganismos eficaces toman sustancias

4
generadas por otros organismos basando en ello su funcionamiento y desarrollo.
Las raíces de las plantas decretan sustancias que son utilizadas por los
microorganismos eficaces para crecer, sintetizando aminoácidos, ácidos nucleicos,
vitaminas, hormonas y otras sustancias bioactivas. Cuando los microorganismos
eficaces incrementan su población, como una comunidad en el medio en que se
encuentra, se incrementa la actividad de los microorganismos naturales,
enriqueciendo la microflora, balanceando el ecosistema microbial, suprimiendo
microorganismos patógenos.

Los microorganismos eficaces protegen a las plantas del ataque de patógenos por
competencia por nutrientes, antagonismo, y parasitismo por otro lado, la planta
estimula el sistema de asociación interdependiente lixiviando azucares,
aminoácidos y sales minerales necesarios al crecimiento de los microorganismos
en simbiosis en detrimento o deterioro de los patógenos.

5
 II. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general:

Evaluar la eficacia biológica in vitro de los microorganismos eficaces para el control

de la bacteria Ralstonia solanacearum Raza 2.

2.2 Objetivo específico:

Evaluar in vitro el efecto de diferentes concentraciones de microorganismos

eficaces para suprimir el crecimiento de la bacteria Ralstonia solanacearum en
medio de cultivo.

2.3 Hipótesis

Los microorganismos eficaces tienen un efecto supresivo in vitro sobre el

crecimiento de la bacteria Ralstonia solanacearum en medio de cultivo.

6
 Ill. REVISIÓN DE LITERATURA

La bacteria Ralstonia solanacearum es un organismo altamente complejo con una

gran variabilidad genética y patogénica, que parasita cerca de 50 familias botánicas
y más de 200 especies. La bacteria puede penetrar e infectar la planta a través de
aperturas naturales, así como por heridas ocasionadas por herramientas. Una vez
dentro del hospedante, la bacteria de desplaza a través de los haces vasculares,
proceso que es acelerado por las altas temperaturas. Otro factor que influye en la
velocidad de desplazamiento de la bacteria en la planta es el tejido vegetal. Algunos
de los hospedantes de importancia económica son la papa, el tomate, el tabaco, el
banano, las heliconias, el cacahuate.

La bacteria R. solanacearum es muy heterogénea y teniendo en cuenta su

patogenicidad ha sido clasificada en razas, basados en el rango de hospederos y
los diferentes biovares que se han identificado con base a las características
fisiológicas; la raza 1 corresponde a los biovares1, 3 o 4, la raza 2 a los biovares1
o 3, la raza 3 al biovar 2, y la raza 4 al biovar 4. En cada una de estas razas y
biovares hay numerosos subtipos que pueden ser asociados con una localización
geográfica en particular (Gomes, 2005).

R. solanacearum ha sido dividido en 5 razas basándose en el rango del hospedero

del patógeno. La raza 1 afecta un amplio rango de hospederos que incluye papa,
tomate, tabaco, bananos diploides, maní, jengibre, olivo y muchas semillas
particularmente de solanáceas. La raza 2 está limitada a musáceas causando
marchitez bacteriana de bananos tripoides (enfermedad del Moko) y heliconias la
raza 3 afecta la papa y tomate particularmente en ambientes fríos, pero no es
altamente virulenta en otros cultivos de solanáceas (Gomes, 2005).

Las tres razas se pueden diferenciar por inoculación de hojas de tabaco. La raza 1
causa marchitez típica, la raza 2 induce reacción de hipersensibilidad y la raza 3
causa clorosis en el área infiltrada.

7
3.1 Patogenicidad

Es el potencial de una cepa para inducir enfermedad o respuesta de

hipersensibilidad, que son dos tipos de interacciones específicas para patógenos
de plantas. La realización y la determinación de la patogenicidad es un paso muy
importante en la identificación de la bacteria fitopatógena. Las pruebas de
patogenicidad no están estandarizadas y dependen de la relación entre hospedero
y patógeno (Goszczynska et al., 2000).

Debido a que existen dificultades para verificar todas las características de una
bacteria y diferenciar entre especies, algunos grupos de bacterias fitopatógenas
solo pueden ser diferenciados por su patogenicidad en plantas, ya que solo atacan
determinadas especies de plantas. Esto se debe de que algunas como R.
solanacearum son muy restringidas en cuanto a su rango de hospederos, mientras
que en otras es más amplio (Goszczynska et al., 2000).

3.2 Mecanismos de dispersión

La bacteria puede ser directamente dispersada a través de materia vegetal

contaminado como cormos e hijuelos (semilla), frutos, hojas, tallo, pseudotallos y
raíces; además los insectos juegan un papel importante como vectores,
principalmente a aquellos de la familia Apidae.

Por otro lado, las herramientas utilizadas en las labores culturales dispersan
fácilmente el patógeno. También el agua contaminada con la bacteria atreves de
riachuelos, canales de riego, entre otros; y por el movimiento de suelo directa o
indirectamente por medio de herramientas, maquinaria agrícola, botas y zapatos
(Belalcázar et al., 2003).

La bacteria está adaptado a sobrevivir en el suelo, en residuos de cosecha o en

malezas aun en ausencia de plantas de plátano. Estas características son muy
importantes en la epidemiología de la enfermedad ya que la bacteria al sobrevivir
por mucho tiempo en el suelo, constituye una fuente de inóculo inicial para la
infección de nuevas plantas de plátano en el campo y dificulta su control en las
plantaciones.

8
La bacteria también se disemina a través de material vegetal propagativo infectado,
lo anterior, es un punto estratégico para el desarrollo de medidas profilácticas en el
manejo de esta enfermedad. Insectos polinizadores constituyen otra fuente de
diseminación de la bacteria, los cuales al posarse sobre una planta enferma con
exudados de R. solanacearum raza 2, se convierten en vectores, esta forma de
transmisión se considera el medio más explosivo de dispersión del Moko del
plátano. La visita de avispas, abejas y dípteros a las inflorescencias de la planta de
plátano y banano es frecuente. En la transmisión por insectos, la las brácteas que
cubren el racimo de flores se marchitan y muren (SENASICA-SAGARPA, 2016).

Las principales prácticas culturales de manejo de la enfermedad implican:

desinfección de herramientas utilizadas en la plantación, control de malezas,
rotación de cultivos, solarización y aireación del terreno en épocas de secas. En
plantaciones donde la enfermedad ya está establecida, las flores masculinas de
ben ser continuamente removidas, posterior a la emisión de la última mano
(SENASICA, 2016).

Control genético mejoramiento genético asistido por técnicas tales como extracción
de ADN y marcadores moleculares son sin lugar a dudas las opciones más
prometedoras en el diagnóstico, prevención y control de la enfermedad. La
resistencia genética, es un elemento importante en el manejo de suelos con
presencia de cepas patogénicas, la propagación in vitro es una herramienta que
permite obtener plantas sanas, sin embargo, el costo para la producción de estas
plántulas eleva significativamente los costos de producción (Hernández, 2010).

3.3 Microorganismos eficaces

Los microorganismos eficaces (ME) son una combinación de diversas bacterias,

las cuales secretan substancias benéficas como vitaminas, ácidos orgánicos,
minerales quelatados y fundamentalmente substancias antioxidantes, que
suprimen microorganismos patógenos, y que en investigaciones previas han tenido
resultados positivos en el control de Ralstonia solanacearum. Por lo que la
evaluación de estos ME en aplicaciones al suelo en áreas afectadas por esta
enfermedad podría afectar la sobrevivencia de la bacteria y contribuir a bajar las

9
poblaciones del patógeno, lo cual, aunado a otras acciones como la desinfección
de herramientas y la eliminación de plantas enfermas, disminuirá la incidencia del
Moko en las fincas y las pérdidas económicas que actualmente padecen los
productores.

Castro et al (1995) reportaron el potencial que tienen los microorganismos eficaces

en el control de varios hongos y bacterias patógenos, entre ellos a Pseudomonas
(Ralstonia) solanacearum. En una evaluación in vitro Lwin y Ranamukhaarachchi
(2006) encontraron que los microorganismos eficaces tuvieron la mayor inhibición
de crecimiento de colonias de Ralstonia solanacearum aisladas de tomate, lo que
mostró su potencial como agente de control biológico de este patógeno.

En otras enfermedades de gran importancia económica que afectan a cultivos

tropicales como la Sigatoka negra del plátano y la moniliasis del cacao, los ME han
demostrado eficacia biológica en el control de los patógenos cuando se usan como
parte de un manejo integrado de la enfermedad. Su acción es sobre los procesos
de germinación de esporas, de infección y de esporulación de los patógenos, lo que
se traduce en la disminución de fuentes de inóculo de la enfermedad (Bayro, 1998;
Eguez, 2000; Ramón, 2000; Nájar y Thomas, 2001; IPADE, 2008; Quiroz, et al,
2009).

En estudio preliminar en la zona de Teapa, Tab., Caballero (2016) encontró que los
ME suprimen significativamente el crecimiento de la bacteria en medio de cloruro
de tetrazolio, de tal manera que en porcentajes de 60%, 80% y 100% de ME
aparecieron 5, 15 y 20 colonias bacterianas, respectivamente, provenientes de una
solución concentrada de R. solanacearum obtenida de tejido de plátano enfermo.

10
 lV. MATERIALES Y METODOS

La investigación se llevó a cabo en los laboratorios de la carrera de Ingeniería en

Agronomía del Instituto Tecnológico Superior de la Región Sierra durante agosto a
diciembre de 2017.

4.1 Activación de los microorganismos eficaces (ME)

Para activar los microorganismos eficaces se usaron: parrilla eléctrica, recipiente

de aluminio, tambo de plástico de 50 litros con tapa, cuchara, termómetro,
potenciómetro, melaza, agua no clorada y microorganismos eficaces distribuidos
en Tabasco por la empresa Desarrollo Integral Ambiental, S. A. (Figura 1).

Se prepararon 20 litros de microrganismos eficaces compuestos por un litro de

melaza, un litro de ME y 20 litros de agua. El proceso de activación consistió en
medir un litro de melaza que se colocó en un recipiente de aluminio, el cual se
calentó en una parrilla eléctrica hasta una temperatura de 70 ºC. Luego se agregó
agua poco a poco para bajar la temperatura hasta 30 ºC. Posteriormente esta
mezcla se vació a un recipiente de plástico de 50 litros de capacidad y por último
se le agregó el resto del agua para obtener la mezcla total de 20 litros.

Al terminar el proceso se registró el pH y la temperatura de la mezcla y se tapó el

recipiente para evitar la entrada de luz. Diariamente se midió el pH y cuando bajó
de 4.0 los microorganismos ya estaban activados y listos para su aplicación.

4.2 Toma de muestras

Se tomaron muestras de cormo, hijuelo y fruto de plantas de plátano variedad

Enano Gigante con síntomas de la enfermedad del Moko, así como del suelo
circundante en la finca El Desengaño, Ra. Galeana, Teapa, Tabasco.

11
 Figura1. Activación de ME. Figura 2. Solución de Cloruro de tetrazolio

Figura 3. Mezcla de medio de cultivo. Figura 4. Vaciado en caja de Petri.

Figura 5. Medio de cultivo modificado con Figura 6. Cajas de Petri en incubadora

diferentes concentraciones de ME.

12
4.3 Preparación de medio de cultivo con cloruro de tetrazolio (CTZ)

Se usó como medio de cultivo papa dextrosa agar al 2.5%. En un matraz

Erlenmeyer de un litro se colocaron 500 de agua destilada y se le agregaron 25
gramos de agar bacteriológico, luego el matraz se colocó en una placa de agitación
magnética con calor hasta que el agar se disolviera correctamente, luego se
esterilizó por 30 minutos en la autoclave (Figuras 2 y 3).

Se pesó 0.1 gramo de cloruro de Tetrazolio y se disolvió en 100 ml de agua

destilada estéril y se cubrió con papel aluminio por su sensibilidad a la luz. Después
de esterilizar el medio con agar se esperó a que descendiera su temperatura hasta
que fuera manejable y luego agregaron 2.5 ml de CTZ en cada matraz. Del total de
medio con CTZ se vaciaron 100 ml en cada uno de 5 matraces de 100 ml de
capacidad (Figura 4).

4.4 Preparación de las concentraciones de M E

Las diferentes concentraciones de ME se hicieron de la siguiente manera: en un

matraz se pusieron 80 ml de agua destilada estéril y se le agregaron 20 ml de ME
activados, en otro matraz se colocaron 60 ml de agua más 40 ml de ME, en otro
recipiente se pusieron 40 ml de agua más 60 ml de ME, y finalmente en otro matraz
se colocaron 20 ml de agua destilada y se agregaron 80 ml de ME; estas mezclas
dieron concentraciones de 20%, 40%, 60 % y 80% de ME (Figura 5).

4.5 Modificación del medio de cultivo con ME

Después de que el medio de agar bacteriológico se esterilizó y se le agregó el

cloruro de tetrazolio, se colocaron 80 ml de este medio en un matraz Erlenmeyer y
luego se añadieron 20 ml de ME (V/V), para obtener un volumen de 100 ml. Este
procedimiento se repitió con cada una de las diluciones y con la de 100% de ME.
Finalmente, el medio modificado se vació en cajas de Petri estériles; se usaron 5
cajas por concentración de ME y del testigo sin ME.

13
4.6 Proceso de muestras y siembra de la bacteria en medio de cultivo

En el laboratorio con un bisturí estéril se cortaron pequeños fragmentos de las

muestras de tejido vegetal enfermo, extrayendo la parte más afectada. Se pesaron
cinco gramos de cada muestra de cormo, hijuelo, fruto y de suelo en una balanza
granataria, luego se desinfectaron sumergiéndolos en una solución de hipoclorito
de sodio al 10% por tres minutos. Después de ese tiempo los trozos de tejido se
enjugaron en agua destilada estéril (Figuras 7 y 8)).

El tejido desinfectado se colocó en agua destilada estéril en un vaso de precipitado

y se dejó reposar durante 15 minutos con el objetivo de permitir que las bacterias
salieran de los tejidos enfermos y del suelo y se obtuviera una solución bacteriana
concentrada; se usó un vaso para cada muestra de tejido. De cada solución se
sembró por estriado con un asa bacteriológica estéril en cajas de Petri con el medio
modificado con ME y se incubaron durante 5 días a una temperatura a 25ºC; se
usaron cinco cajas por concentración bacteriana (Figura 9,10 y 11).

De cuerdo a las diluciones de ME los tratamientos evaluados fueron.

Tratamiento 1: 20 % de ME
Tratamiento 2: 40 % de ME
Tratamiento 3: 60 % de ME
Tratamiento 4: 80 % de ME
Tratamiento 5: 100 % de M.E
Tratamiento 6: Testigo (sin ME)

4.7 Evaluación de los tratamientos

La eficacia de las concentraciones de Microorganismos Eficaces sobre el patógeno

se midió al cuarto día después de la siembra cuantificando el número de colonias
bacterianas de R. solanacearum que crecieron en el medio de cultivo modificado
con ME. Se revisó el aspecto de las colonias bacterianas presentes. La prueba se
repitió tres veces durante el periodo de estudio (Figura 12).

14
Figura 7. Frutos infectados por Moko Figura 8. Corte de fruto enfermo

Figura 9. Desinfección de la muestra Figura 10. Reposo de la solución

Figura 11. Siembra en medio de cultivo

15
 V. RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 Aislamiento e identificación de las bacterias

Se obtuvo mayor crecimiento bacteriano en las muestras de suelo, cormo, hijuelo y

fruto de plátano con síntomas típicos y más frecuentes de infección por Moko; en
suelo y fruto fue muy escasa la cantidad de bacterias aisladas (Tabla 1).

En el medio de cultivo las colonias presentaron una morfología característica de R.

solanacearum; algunas tuvieron un color blanco con el centro rojo y otras
completamente rojas, pero en ambos casos fueron muy pequeñas de entre uno y
dos milímetros. Además, entre mayor fue la concentración de ME fue menor el
tamaño de las colonias y no se pudieron observar tan fácilmente (Figuras 13 a 17).

Esta morfologia
́ corresponde a las cepas de R. solanacearum las que se han
asilado en estudios reportados por Sánchez (2000), Ramirez et al (2006), López
(2010) y Ramiŕ ez et al (2011) en fincas bananeras de Teapa y otros municipios de
Tabasco, y por Gómez et al (2005) y Tapiero et al (2007) en Colombia.

5.2 Cuantificación de colonias bacterianas aisladas en medio de cultivo CTZ

En la Tabla 1 se muestra el número promedio de colonias bacterianas en medio de

cultivo con CTZ y sin microrganismos eficaces, aisladas de diferentes órganos de
la planta de plátano y del suelo.

Tabla 1. Número de colonias de R. solanacearum obtenidas de diferentes

órganos de una planta de plátano y suelo infectado por Moko a los cuatro días
de la siembra en medio de cultivo CTZ sin ME.

Órgano de la planta Cormo Hijuelo Fruto Suelo

Número de colonias 33 34 15 4
Promedio de cinco repeticiones

16
 Figura 12. Conteo de las colonias Figura 13. Colonias bacterianas de muestras de
fruto en medio con ME al 20%.

Figura 14. Colonias bacterianas de Figura 15. Colonias bacterianas en el testigo sin
muestras de suelo infestado con Moko. ME.

Figura 16. Colonias bacterianas de Figura 17. Colonias bacterianas de muestras de

muestras de cormo en el testigo sin ME fruto en medio con ME al 60%.

17
En esta prueba los órganos de la planta de donde se obtuvieron mayor crecimiento
de colonia fueron en cormo y en hijuelo. En cuanto a la relación entre síntomas
avanzados y la presencia del patógeno en los diferentes tejidos de las plantas,
Ramírez et al., 2006, indican que en pseudotallo, cormo y frutos existe mayor riesgo
de adquirir la enfermedad debido a las labores de cultivo como el deshoje, el
deshije, el desmane y desflore del racimo, en las que se usan herramientas que
causan heridas por donde puede penetrar el patógeno.

En la Tabla 2 se muestra el número de colonias bacterianas aisladas en medio de

cultivo con CTZ y modificado con ME, donde se observa que la cantidad de colonias
que crecieron fue diferente dependiendo del porcentaje de ME en el medio. A mayor
concentración de ME, el número de colonias fue menor, lo que indica un efecto
supresor de los especialmente a altas concentraciones de microrganismos.

Esos resultados coinciden con los de un ensayo preliminar realizado en el ITSS,

donde se encontró el efecto inhibidor de las colonias en un medio de CTZ con ME,
aunque en aquel si se presentó crecimiento, aunque mínimos en concentraciones
de 80% y 100% de hasta 15 colonias. Quizá la diferencia pueda deberse a una
diferente concentración de inóculo en los tejidos enfermos.

Tabla 2. Número de colonias de R. solanacearum aisladas en medio de CTZ

modificado con diferentes concentraciones de microorganismos eficaces.

Dosis ME (%) 20 40 60 80 100 Testigo

Colonias 99 74 76 0.6 0 162

Como se puede observar, el mayor crecimiento de colonias se obtuvo en 20%, 40%

y 60% de concentración de ME así como los testigos donde siempre hubo mucho
crecimiento de colonias. De acuerdo con esto, entre menos es la concentración de
microorganismos eficaces más crecimiento de colonias se podrá presentar. Esto
indica que los ME detienen el crecimiento de R. solanacearum in vitro, muy
probablemente debido a las sustancias antibióticas que producen las bacterias que
forman parte del complejo de microorganismos que componen los ME.

18
Las sustancias antibióticas producidas por los ME afectan el crecimiento y el
metabolismo de otros microorganismos (hongos levaduras, bacterias etc.)
provocando cambios morfológicos en las células de los hongos y a veces previenen
la germinación de las esporas. Además, existe una serie de componentes derivados
de los ME como carbohidratos, aminoácidos, antibióticos y sustancias fenólicas,
que tienen un rol importante en la inhibición del crecimiento de patógenos. Los ME
también secretan aminoácidos y carbohidratos que están correlacionados con la
susceptibilidad y resistencia a enfermedades (Andel, 1965 citado por Najar y
Thomas, 2001).

La evaluación de medios de cultivo modificado para el crecimiento de la bacteria

Ralstonia solanacearum obtenidos de cada muestra indicó que las concentraciones
de 80% y 100% frenaron totalmente el crecimiento de la bacteria, entre mayor
concentración de microorganismos eficaces en medio modificado menor
crecimiento de la bacteria lo que indica que existe un potencial de control contra
esta bacteria. Esto se debe posiblemente a que los ME deterioran el crecimiento y
la actividad metabólica de otros microorganismos patogénicos (hongos levaduras,
bacterias etc.) provocando así cambios morfológicos en sus células que provocan
su muerte (Andel, 1965 citado por Najar y Thomas, 2001).

19
 VI. CONCLUSIONES

 De acuerdo a las pruebas realizadas se concluye que los Microorganismos

Eficaces tienen un efecto supresivo bajo condiciones in vitro de la bacteria
Ralstonia solanacearum asilada de tejido de plátano afectado por la
enfermedad Moko o marchitez bacteriana.

 Entre mayor es la concentración de ME en el medio de cultivo el efecto

supresivo es mayor llegando a evitar completamente la aparición de colonias
del patógeno con una concentración de 100% de ME.

 Se sugiere que estos resultados de comprueben en laboratorio y se validen

en campo en aplicaciones al suelo, ya que es evidente que para que los ME
sean efectivos deben entrar en contacto con Ralstonia solanacearum.

20
 VII. BIBLIOGRAFIA

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