UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

CÓDIGO: SGC.DI.505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16

CARRERA:

GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO

PERIODO Oct 2016-Febrero 5to
ASIGNATURA: Genética NIVEL:
LECTIVO: 2017 Semestre
DOCENTE: Dra. Thelvia Ramos NRC: 3831 PRÁCTICA N°: 2
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
Laboratorio de Docencia
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
EXTRACCIÖN DE ADN A PARTIR DE MUESTRA DE SANGRE PERIFERICA
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa de todo análisis genético.
Obtener DNA relativamente puro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que será
destinado, en el marco de investigaciones de tipo forense, poblacionales, predisposición a enfermedades y otros. Esta
tarea demanda una "puesta a punto" de las técnicas de extracción utilizadas, con el objeto de determinar las
condiciones ideales en las que se obtendrá un máximo rendimiento. En general; los métodos de extracción de DNA
tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son, a saber:
disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes
quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación de las proteínas (que constituyen
los principales contaminantes del extracto), concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para
eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión.

Para muestras de sangre en particular, distintos protocolos han sido descriptos y publicados, pudiendo diferenciarse
básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del
extracto.

Así podemos encontrar métodos que aprovechan las propiedades desnaturalizantes que tienen ciertos solventes
orgánicos como cloroformo, fenol, etc. y a aquellos fundamentados en el conocido cambio de solubilidad que
experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio. En
presencia de bajas concentraciones de sales, se verifica un ligero aumento en la solubilidad de las proteínas (salting-
in) por aumento de la fuerza iónica del medio respecto de soluciones acuosas. Por el otro lado, en presencia de altas
concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas disminuye y terminan por precipitar (salting-out).

Sin embargo, estos protocolos requieren siempre una previa estandarización a las condiciones y recursos del
laboratorio donde se lleven a cabo, así como también es necesario introducir modificaciones pertinentes a las
situaciones especiales que pudieran plantearse. Entre ellas, la disponibilidad de muestra constituye un problema que
puede presentarse con cierta frecuencia en estudios forenses o similares. Por ello, es de importancia determinar las
condiciones bajo las cuales es posible la obtención de DNA en condiciones de relativa pureza, para ser empleado en
los estudios genéticos posteriores a los que será destinado

OBJETIVOS:

 Obtener una muestra de sangre con anticoagulante de aproximadamente 8ml

 Lisar los leucocitos mediante tratamiento con una solución de lisis.
 Eliminar las proteínas del extracto por precipitación salina.
 Obtención de la medusa de ADN.
 Establecer la relación 260/280 para ver contaminación de la muestra y calidad de la misma.
MATERIALES:
INSUMOS:
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CARRERA:

REACTIVOS: - tubo de 50ml.

- EDTA - punta azul
- PBS - puntas amarillas.
- Tris-HCL 10mM (ph 8.0) - ependorff
- Tritón X-100 1%
- sacarosa
- NaCL
- agua destilada
- proteinasa K
- Fenol
- Cloroformo
- alcohol –isoamilico)
- alcohol

EQUIPOS:
- Centrifuga
- pipeta de 5 mL.
- baño de maría
- vortex
- micropipetas

MUESTRA:
Sangre periférica de humanos.

INSTRUCCIONES:

- Utilice ropa de protección: mandil, guantes, cabello recogido, zapato cerrado.

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

Preparación de Soluciones:

- EDTA 250μl
- PBS
- TLB (Tris-HCL 10mM (ph 8.0), Tritón X-100 1% y sacarosa 320 mM)
- NLB (Tris HCL 10 mM (ph 8.0), NaCL 400 mM y EDTA 2 mM)
- SDS al 10 %.
- NaCl 5M
- CIA(Fenol Cloroformo alcohol –isoamilico)
- 2 propanol.
- Alcohol 70%
- T.E

Practica de laboratorio (protocolo):

1. Se parte de 10 ml de sangre con 250μl de EDTA (56mg/ml) en tubo de 50ml.
2. Añadir PBS hasta completar 50ml y homogenizar suavemente.
3. Centrifugar a 3500 rpm por 20’ a 4ºC.
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4. Desechar sobrenadante con una pipeta de 5 mL con extremo cuidado.

5. Adicionar TLB hasta completar 50ml. (SE PUEDE COMENZAR EN ESTE PASO).
(Tris-HCL 10mM (ph 8.0), Tritón X-100 1% y sacarosa 320 mM)

6. Poner a 4ºC durante 30 min. e invirtiendo la muestra 10 veces cada 10 min.

7. Centrifugar a 3500 rpm, 20 min. a 4 º C, desechar sobrenadante por inversión
8. Añadir 5 mL de PBS al pellet y agitar.
9. Centrifugar a 3500 rpm, 20min a 4 º C, desechar el PBS de lavado por inversión.
10. Añadir al pellet de células 3 mL de NLB y 230 μL de SDS al 10 %.Vortex por 15 seg. (Tris HCL 10
mM (ph 8.0), NaCL 400 mM y EDTA 2 mM), hasta disgregar el pellet y seguidamente añadir 60
uL de proteinasa K.(Proteinasa K 1mg/ml, SDS 1% y EDTA 2 mM).
11. Incubar la muestra en el baño de maría a 55 ºC por 1 h y luego a 37 ºC toda la noche.
12. Al otro día añadir 1200 μL de NaCl 5M. Dar vortex por 15 segundos.
13. Centrifugar por 20 min. a 3500 rpm a 15ºC.
14. Extraer sobrenadante a un tubo falcon cuidando no tocar el precipitado.
15. Añadir 5 mL de CIA y dar vortex por 5 segundos. CIA(Fenol Cloroformo alcohol –isoamilico)
16. Centrifugar por 20 min. a 3500 rpm a 15ºC.
17. Extraer el sobrenadante cuidando no tocar la interfase y depositarlo en un tubo falcon.
18. Agregar igual cantidad de 2 propanol.
19. Invertir para favorecer la precipitación del ADN en forma de medusa.
20. Pescar la medusa con ayuda de una punta azul.
21. Transferir el ADN a un tubo eppendorf limpio y estéril.
22. Dar un toque de centrifuga y con ayuda de una punta amarilla extraer el resto de
2 propanol sin tocar el ADN.

23. Añadir 1 mL de alcohol al 70 %

24. Centrifugar a 13000 rpm a 1ºC durante 10 min.
25. Eliminar sobrenadante por inversión, dar un toque de centrífuga y con ayuda de una punta
amarilla extraer el resto de líquido sin tocar el ADN.
26. Colocar el tubo en la desecadora con la tapa abierta y secar a vacío por 15 min y
40 de presión.

27. Resuspender en 400-500 uL de H2O ó T.E.

28. Guardar a 4ºC durante 24 hrs.
29. Conservar a –20ºC, si no se va a usar después de disuelto el ADN.
EN CASO DE HACERSE LA EXTRACCION RAPIDA, PONER LAS MUESTRAS 30 MINUTOS EN EL BAÑO DE MARIA A 55 O C Y
1 HORA A 37 OC.

RESULTADOS OBTENIDOS:

Se indicará los resultados que debe obtener o presentar el estudiante, por ejemplo:
- Evidenciar con foto.
- Elabore un informe de la práctica realizada
CONCLUSIONES:

Esta práctica de laboratorio permite que los estudiantes conozcan cómo se realizan las extracciones de ADN a partir de un
método diferente con otro tipo de muestra y conocer como eliminar de una manera más eficaz la contaminación con
proteínas. Las adaptaciones del método de extracción salting-out permiten la obtención de DNA de calidad y pureza necesarias
para la amplificación mediante PCR a partir de pequeños volúmenes de sangre, con un volumen mínimo de 0,5 µL de sangre de
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CARRERA:

partida.

RECOMENDACIONES:

FIRMAS

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Nombre: Dra. Thelvia Ramos Nombre: Francisco Flor Nombre: Patricia Jimenez
COORDINADOR DE ÁREA DE COORDINADOR DE LABORATORIOS
DOCENTE CONOCIMIENTO