Polimorfismos

Aplicaciones en la
Genética Médica
BASES MOLECULARES ADN ADN
genoma
DE LA VIDA
ARN
Célula
cromosomas
PROTEÍNAS
genes
los genes
contienen
instrucciones
para hacer
ADN
proteínas

proteínas

las proteínas actúan

solas o en complejos
para realizar las
funciones celulares
 Polimorfismo
• Carácter determinado generalmente por
un gen en el que existen al menos dos
alelos, cada uno de los cuales se
encuentra con una frecuencia mayor
que 0.01 ( es decir, el 1%) dentro de la
población. Garantizándose dentro de la
población varios alelos y varios
genotipos posibles.
 Tipos de polimorfismos y
Técnicas de Análisis
• Polimorfismos de determinación
indirecta: incluye aquellos caracteres
detectables mediante el análisis de los
productos derivados de los tejidos.
• Polimorfismos de determinación
directa o de ADN: incluye aquellos
caracteres detectables mediante el
análisis directo del material hereditario.
 Polimorfismos de
determinación indirecta:
• Antígenos Eritrocitarios

• Antígenos Leucocitarios

• Proteínas
 Polimorfismos de determinación indirecta
Antígenos Eritrocitarios
•Reacción directa de aglutinación •Reacción indirecta o test de Coombs
Polimorfismos de determinación indirecta
Antígenos Leucocitarios
Polimorfismos de determinación indirecta
Proteínas
 Polimorfismos de
determinación directa o
de ADN
 ADN Nuclear:
Ubicado en el Núcleo de la célula.

ADN Mitocondrial:
Interior de las mitocondrias.
Secuenciado y mapeado totalmente.
Herencia materna.
 ADN Nuclear
ADN Codificante:

Importancia desde el punto de vista médico.

Es poco variable o polimórfico a excepción del
sistema HLA.
Representa la mayor parte del genoma humano.

ADN no Codificante:

Es muy polimórfico y variable entre los individuos.

Gran utilidad en Medicina Legal.
Es una fuente importante de marcadores genéticos.
Métodos
 Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción

son moléculas que reconocen
y cortan secuencias espe-
cíficas del ADN de doble
cadena.
El descubrimiento de las
enzimas de restricción permi-
tió que el ADN de fuentes
diferentes fuera cortado y re-
ensamblado-recombinado,
resultando en los primeros
experimentos de recombi-
nación del ADN
 Uso de enzimas de restricción para hacer moléculas
Clonación del ADN- Enzimas de restricción
de ADN recombinantes
Eco R1

Fragmentos de ADN unidos en

los bordes cohesivos
Bordes cohesivos

Borde cohesivo

ADN recombinante
 Las enzimas de restricción permitieron desarrollar
la Clonación del ADN, cuyo principio fundamental
es la amplificación selectiva de un fragmento de
ADN de tal manera que este pueda ser aislado y
analizado (e.g. secuenciación, análisis de expresión
funcional).

Existen dos tipos básicos de clonación:

• Clonación hecha en la célula,
• Clonación fuera de la célula (PCR).
Reacción en cadena de la
polimerasa
ó
Clonaje fuera de la célula
 Tecnología del ADN (Diagnóstico
Molecular) PCR - REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA

El PCR utiliza la capacidad de las Enzimas polimerasas

que catalizan la formación y reparación de ADN
(y ARN), mediante un mecanismo que permite iniciar y
parar su actividad en un punto específico de una hebra
de ADN, para lo cual se emplean polimerasas obtenidas de
arqueobacterias como Termophillus aquaticus que resisten
temperaturas arriba de los 100°C.

Kary B. Mullis, de Cetus Corporation que

concibió el mecanismo del PCR, en la década de
los 80 recibió el Premio Nobel en 1993.
Para la replicación del ADN
se necesita:

1. Molde de ADN

2. DNA polymerasa
3. Nucleotidos

Pares de bases complementarias:

1. G/C
2. A/T
 ¿Para que es el PCR?

PCR: es una técnica para clonar fragmentos de ADN provenientes del genoma de
algún organismo utilizando los mismos principios que la célula (replicación del ADN)
.

Se necesita …Molde de ADN

Enzima ADN polymerasa
Nucleótidos
Buffer
Oligos o Cebadores
Los Polimorfismos como
Marcadores genéticos
 1. Extracción de DNA
Procedimiento general para la
utilización de Marcadores

Enzimas de restricción
2. Generación de
Reacción PCR
polimorfismo Combinación de los 2 anteriores
Moleculares

3. Electroforesis
(horizontal, y/o vertical)
Sondas marcadas, Bromuro de
4. Detección de los etidio, UV, Quimioluminiscencia,
fragmentos tinción con plata

5. Autoradiografía
y/o fotografia
6. Evaluación de los
fragmentos
FUNDAMENTO DE LA
TÉCNICA
 Origen del polimorfismo en AFLP´s
La técnica descrita por Vos et al. (1995), denominada AFLP, se
considera una de las más rápidas y de menor costo.
Se basa en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción
digeridos a partir del ADN genómico total, utilizando PCR
(Polymerase Chain Reaction) (Williams et al. 1990).
Los AFLPs pueden producir patrones de complejidad variada de
acuerdo al tipo de enzimas de restricción y la longitud de los
imprimadores utilizados en el PCR.
 Fragmentos Polimórficos de ADN
Amplificados (AFLP)
Los AFLP marcadores que segregan de forma
mendeliana, igual que los RFLP. Detectan una gran
cantidad de loci.
En esta técnica se combinan los principios de los RFLP
y PCR, donde los fragmentos producidos por la
restricción del ADN son amplificados selectivamente
El polimorfismo es detectado por la presencia o
ausencia de fragmentos, de herencia dominante.
 AFLPs
Los resultados de diversidad genética obtenidos son
similares con los AFLP y RFLP.
Desventajas para la interpretación de los datos es el
tiempo necesario para el análisis cuando se realiza en
forma no automatizada (visual).
Los loci de AFLP son tan reproducibles como los
RFLPs, pues son prácticamente insensibles a las
condiciones de la reacción (Tohme et al., 1996),
Ambas técnicas requieren de una buena calidad de ADN
para el proceso de digestión con enzimas de restricción.
Estas dos técnicas son de mayor precisión que los
RAPDs, susceptibles a una falta de estandarización del
proceso de amplificación.
 PCR-SSP/PCR-ARMS
Amplificación utilizando primers con especificidad de alelo
(Specific Sequence Primer), también conocida como
sistema PCR-ARMS (Allele Refractory Mutation
System)
Un conjunto de reacciones simultáneas de PCR, cada una
de ellas conteniendo primers específicos a un alelo o
grupo de alelos
Su especificidad se deriva de que la Taq Pol solo elonga a
partir de un primer cuyo extremo 3’ sea perfectamente
complementario a la molécula diana.
 PCR-SSP
Locus con tres alelos A, B y C
(individuo porta alelos A y C)

PCR* con primer A PCR* con primer B PCR* con primer C

Sí Amplificación No Amplificación Sí Amplificación

(*) En todos las reacciones se incluye además el primer común y los

dos primers correspondientes al control interno
 Polimorfismo de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLPs)
• RFLP es la identificación de alelos polimórficos
por la presencia o ausencia de sitios específicos
de restricción reconocidos por endonucleasas.
– GAATTC versus GATTTC
• RFLP se identifica a través de la digestión de ADN
genómico con enzimas de restricción específica
seguido por un Southern blotting
• Regiones de ADN con polimorfismos:
– Intrones
– Secuencias flanqueantes
– Exones
– Sólo pueden detectar cambios dentro de una
secuencia determinada, de modo que no todas las
mutaciones serán reveladas por esta técnica.
 Repeticiones en tándem de número
variable (VNTR)
• Es un tipo de polimorfismo muy extendido por el
genoma. Una vez que existe una secuencia
repetida la producción de nuevas variantes se ve
facilitada por entrecruzamientos desiguales.
• Se encuentran en regiones no codificantes del
ADN, aunque en ocasiones invaden un gen con
consecuencias negativas para el individuo
portador.
• Microsatélites: La secuencia que se repite es de 2
a 6 pares de bases.
• Minisatélites: La secuencia es de una longitud
mayor.
• El polimorfismo que determina los VNTRs se
caracteriza por el número de repeticiones.
• Su frecuencia alélica será la frecuencia con la que
aparece el mismo número de repeticiones en una
población
 Southern Blot
RFLPs
Gel PCR-SSP para
un gen HLA
Minisatélite: repeticiones en Tándem de una secuencia que varia entre 14 a 100 nucleótidos en
extensión

Polimorfismo: número variable de repeticiones

Microsatélites: corta secuencias de repeticiones en Tándem, e.g. repeticiones CA

SNP Polimorfismo de simple nucleótido

Polimorfismo: sustitución de un solo nucleótido ( e.g. C A)

Minisatélites y Microsatélites.
Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) y
microsatélites (SSR) son dos categorías de secuencias
repetidas que se presentan en eucariontes.
Se encuentran repetidas en tandem y dispersas a través
del genoma representando muchos loci. Cada locus
tiene distinto número de repeticiones variable,
asociándose de esta manera a alelos específicos de alta
variabilidad. A través del uso de estos marcadores se
han obtenido patrones complejos de ADN en animales,
plantas, y microorganismos.
 Microsatélites
Simple Sequence Repeat
(SSR)
 Qué es un microsatélite?
Un microsátelite es un fragmento de ADN formado por una simple secuencia
repetitiva

TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT

AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

Estas unidades pueden estar formadas desde 2 hasta 6 pares de base

GGTA GGTA GGTA GGTA GGTA GGTA GGTA

CCAT CCAT CCAT CCAT CCAT CCAT CCAT

G G G G G G G G G

C C C C C C C C C

TC TC TC TC TC

AG AG AG AG AG
 Qué es un microsatélite marcador?

Es un fragemento de ADN que contiene no dólo la región SSR sino también una
porción extra de ADN y necesita una pareja de oligos (alrededor de 20 bp.cada uno
para ser amplificado

ADN
Genómico

(TC)14

......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCT CTC TCT CTC TCTCTC T CT

CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT......
......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAA
ACTTAAA......
5’ TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT

AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA 5’

 SSR son marcadores codominantes

1 2 3
1 4

4
X
 ORIGEN DE
MICROSATELITES
En 1991 Edwards
et.al los
denomina SSR o
STR

Urqhart en 1994
los clasifica en • simples, compuestos, complejos.
STRs

Brinkmann en • STRs con baja microvariabilidad

1996 propone • STRs con intermedia
una clasificación microvariabilidad
alternativa • STRs con alta microvariabilidad
 MICROSATELITES
Se encuentran en zonas no codificantes del ADN.

Son neutros

Codominantes

Poseen una alta tasa de mutación (polimórficos).

La variabilidad que presentan resulta útil como

marcadores moleculares
 APLICACIONES
Actualmente se Identificación de
han realizado los parentales de Control de
trabajos aplicando algunas cruzamientos
microsatelites poblaciones

Identificación y
Una batería de Estudios de
discriminación de
microsatèlites diversidad y
individuos
permite: distancia genética
(Fingerprints)

Serie de estudios Identificación y

para Aplicaciones a protección de
mejoramiento corto plazo: variedades
genético patentadas
 Ventajas
Polimorfismo muy elevado (multialélicos).
Número enorme de loci.
Herencia mendeliana codominante
Interpretación sencilla de los resultados.
Reproducibilidad muy alta
Resultados transferibles entre laboratorios
Posible automatización
 Desventajas
Reconocimiento previo del genoma
Costo alto si es necesario desarrollar los
iniciadores
Unilocus (aunque se puede hacer
multiplex)
Su alta tasa de mutación puede afectar la
reproducibilidad en estudios genealógicos.
 Microsatélites
Los microsatélites son muy atractivos para los genetistas pues
combinan varias ventajas como son su codominancia, multialelismo
y su alta heterocigosidad.
El alto nivel de polimorfismo que detecta permite una discriminación
precisa entre individuos altamente emparentados.
Las condiciones de amplificación y de reacción son especie-
específicos y la variación en el largo de los productos amplificados
mediante PCR es función del número de unidades repetidas.
En general, la amplificación de microsatélites ha demostrado que
éstos son más variables que isoenzimas, RFLP, AFLP y RAPD.