Métodos analíticos

Seguimiento de los monosacáridos, oligosacáridos, etanol y glicerol durante mosto de

fermentación por iosensors b, HPLC y espectrofotometría

una , ⇑ segundo Contagem de 'c un

Rastislav Monošík , Peter Magdolen, Miroslav Stredansky, Ernest Šturdík

un Departamento de Nutrición y LIMENTOS Evaluación, Instituto de Bioquímica de

la Nutrición y la Salud, Facultad de Química y Tecnología de los Alimentos, Universidad de
Tecnología de Eslovaquia, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Eslovaquia

segundo Instituto de Química, Academia de Ciencias de Eslovaquia, Dúbravská

cesta 9, 845 38 Bratislava, Eslovaquia c Biorealis sro, Radlinského 9, 812 37 Bratislava,
Eslovaquia

artículo información

Articulo de historia:

Recibido el 23 de noviembre de 2011 Recibido en forma revisada 17 de julio de 2012 Aceptado

6 de octubre de 2012 Disponible en línea 8 Noviembre 2012

Palabras clave:

Mosto

Fermentación

Biosensor
HPLC

Espectrofotometría

Enzima

abstracto

El objetivo del presente estudio fue analizar los niveles de azúcar (maltosa, maltotriosa,
glucosa y fructosa) y alcoholes (etanol y glicerol) durante el proceso de fermentación en
muestras de mosto mediante biosensores enzimáticos amperometricos desarrollados por
nuestro grupo de investigación industrial aplicación, HPLC y espectrofotometría, y comparar la
idoneidad de los métodos presentados para la determinación de analitos individuales.
Podemos concluir que para el monitoreo específico de maltosa o maltotriosa sólo el método
de HPLC era adecuado. Por otro lado, los biosensores y la espectrofotometría reflejaron una
disminución en la concentración total de azúcar mejor y fueron capaces de detectar glucosa y
fructosa en las etapas posteriores de fermentación, mientras que la HPLC no lo fue. Esto se
puede atribuir a los bajos límites de detección ya la buena sensibilidad de los métodos
propuestos. Para el análisis de etanol y glicerol, todos los métodos demostraron ser
adecuados. Sin embargo, en lo que respecta a los costos y el análisis del tiempo, los
biosensores representaron la mejor opción.

2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción

La cerveza es una bebida alcohólica o no alcohólica que consiste en agua, compuestos

extractivos y dióxido de carbono. Las principales materias primas son la malta de cebada o de
trigo, el lúpulo crudo o granulado, el agua y la levadura fermentadora. El alcohol está presente
como un producto natural del proceso de fermentación. Las materias primas y aditivos varían
de un país o región a otro y por lo tanto el sabor, la calidad sensorial y el precio pueden diferir
significativamente. Con el tiempo, la industria cervecera evolucionó para ser un proceso
completamente controlado y sofisticado. En pocas palabras, como Esslinger y Narziss (2009)
descritos en su monografía, una vez que la malta se tritura y se mezcla con agua de infusión,
los componentes de alta masa molecular de la malta son degradados por enzimas. El almidón
contenido en malta se hidroliza principalmente a maltosa, glucosa y maltotriosa. Sin embargo,
el almidón no está completamente hidrolizado y las dextrinas que permanecen en la malta no
son fácilmente fermentables. La suspensión se filtra para separar el líquido, llamado mosto. El
mosto se hierve posteriormente con la adición de lúpulo, que está causando la coagulación de
algunos constituyentes (predominantemente proteínas). Se separan junto con los sólidos del
lúpulo. El mosto clarificado se enfría a la temperatura de lanzamiento requerida por la
fermentación. El proceso de fermentación se inicia añadiendo levadura cultivada. Después de
la maduración a gusto y el enriquecimiento con dióxido de carbono

⇑ Autor correspondiente. Tel .: 421 593 255 02 24. E-mail: rasto.monosik@gmail.com (R.
Monošík).

0308-8146 / $ - see front matter 2012 Elsevier Ltd. Todos los ts de Rig reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.10.039

producido por la fermentación, la cerveza se filtra y se embotella ( Essling- er y Narziss, 2009 ).

El análisis del mosto o producto final representa un desafío analítico en varios aspectos. Desde
una perspectiva analítica, la cerveza es una matriz muy compleja que contiene una amplia
gama de componentes que incluyen sacáridos, proteínas, alcoholes, vitaminas, ácidos,
polifenoles, etc. La presencia y cantidad de ciertos compuestos se controlan para asegurar un
producto consistente. En el caso del mosto, la información sobre la degradación de los
sacáridos y el contenido actual de etanol o glicerol son importantes para controlar todo el
proceso de fermentación. Para el análisis de los componentes de la cerveza específicamente,
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) ( Rodrigues et al., 2011 ),
HPLC ( Dewaele y Verzele, 1980 ), de intercambio iónico HPLC ( Klein & Leubolt, 1993 ), o
electroforético capilar (CE) métodos ( Cortace- ro-Ramirez, Hernainz-Bermudez de Castro,
Segura-Carretero, Cruces-Blanco, y Fernández-Gutiérrez, 2003 ) fueron empleados. En el
proceso de detección e identificación de sustancias, así como los procedimientos de
preparación de la muestra, que requieren materiales costosos para su realización, requieren
mucho tiempo. Por otra parte, estos métodos se benefician de una alta sensibilidad y
selectividad, que es también la razón por HPLC con detección electroquímica se ha convertido
en popular para el análisis de antioxidantes naturales en alimentos y bebidas ( Jandera et al.,
2005 ). La ventaja de la HPLC de intercambio iónico es que las resinas de intercambio iónico
normalmente no requieren disolventes orgánicos tales como metanol o acetonitrilo, y
solamente agua pura o

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221

se requieren soluciones salinas diluidas. Los iones de la misma carga y LAR-GER moléculas
están excluidos de los poros y se eluye con el vacío ( Klein & Leubolt, 1993 ). Por lo tanto, este
método puede no ser adecuado para la determinación de un perfil polisacárido. CE separa
especies iónicas por su carga y las fuerzas de fricción y el radio hidrodinámico, y representa
una alternativa a HPLC, ya que puede proporcionar eficiencias más altas, tiempos de
separación más rápidos y los bajos volúmenes de muestra necesarios ( Cortacero-Ramírez et
al., 2003 ). Una de las principales desventajas de la CE es su capacidad muestra limitada, que
puede ser cargado ( Stegehuis, Irth, Tjaden, & Van der Greef, 1991 ). Por lo tanto, este método
no es adecuado para la separación a escala industrial. Hoy en día, técnicas analíticas
modernas, como la determinación biosensorial, también pueden utilizarse para el análisis de
bebidas alcohólicas

Contagem de ' Contagem de

( Monošík, Stredansky, Tkáč, y Šturdík, 2012a ). El método biosensorico no está muy extendido
en los análisis de laboratorio de rutina todavía, pero proporciona posibilidades para la
determinación rápida, específica y de bajo costo.

El objetivo del estudio p resienten fue analizar los niveles de SAC-charides (a saber
oligosacáridos, maltosa, glucosa y fructosa) y alcoholes (etanol y glicerol) en muestras de
mosto por biosensores desarrollados por nuestro grupo de investigación para fines
comerciales, consulte-ENCE la HPLC y los métodos espectrofotométricos, y comparar la
idoneidad de los métodos presentados para la determinación de analitos individuales. El
proceso de fermentación fue monitoreado en industrias locales y cervecerías locales para una
mejor ilustración de la viabilidad de los métodos utilizados.

2. Materiales y métodos
2.1. Materiales

La glucosa deshidrogenasa dependiente de FAD (GDH-FAD, 1160 U mg 1 sólida) y diaforasa

(DP, 37 U mg 1 sólido) fueron adquiridos de Sekisui de diagnóstico (Tokio, Japón), glucosa
oxidasa (GOX, 258,7 U mg 1 sólida) a partir de Biozyme Laboratories (Dublín, EE.UU.). La
glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ (GDH-PQQ, 1010 U mg 1 sólido), glucoamilasa
(GLA, 37,8 U mg 1 sólido), fruc-Tose deshidrogenasa (FDH, 133 U mg 1 sólido), alcohol
deshidrogenasa (ADH, 331 U mg 1 sólido), peroxidasa (HRP, 132 U mg 1 sólido), glicerol
quinasa (GK, 103 U mg 1 sólido), sarcosina oxidasa (SAOX, 12,9 U mg 1 sólido), y creatinasa
(CRE, 8,73 U mg 1 sólido) fueron adquiridos de Sorachim (Lausanne, Suiza), y crea-tine quinasa
(CK, 23,3 U mg 1 sólido) de USB (Cleveland, OH, EE.UU.).

Potasio hexacianoferrato (II y III), N-methylphenazonium sulfato de metilo, D -glucosa, D -

fructose, o-dianisidina, ácido sulfúrico (95-97%), ácido clorhídrico (36,5 a 38%), etanol anhidro,
mag-nesium heptahidrato de sulfato, glicerol, adenosina 5 0 trifosfato y quitosano a partir de
cáscaras de gambas (85% desacetilado), ácido cítrico, tri-ton X-100, de hierro (III) hidrato de
sulfato, ácido fosfórico 99% y el hidrato mal-totriose fueron suministrados por Sigma-Aldrich
(St. Louis, EE.UU.). El fosfato de potasio monobásico y el fosfato de potasio dibásico se
adquirieron de Riedel-de Haen (Seelze, Alemania). El agua utilizada se desionizó mediante un
sistema de purificación Millipore Milli-Q. Todos los productos químicos utilizados fueron de
grado analítico.

Se obtuvieron electrodos planos de oro con un diámetro de 1,6 mm equipado con un

electrodo de referencia Ag / AgCl (diámetro 2 mm, serigrafiado) depositado sobre el sustrato
de laminado epoxídico planar de Biorealis (Bratislava, Eslovaquia).

Se suministraron muestras de mosto como regalo de Heineken as (Hurbanovo, Eslovaquia) y

de Richtár Jakub (Bratislava, Eslovaquia), una pequeña cervecería local.

2.1.1. Aparato

Determinaciones biosensóricas se realizaron con Omnilab ( Fig. 1 ) analizador electroquímico

de Biorealis (Bratislava, Eslovaquia).
Fig. 1. Analizador biosensorico Omnilab desarrollado por nuestro grupo de investigación
utilizado para monitorear la fermentación del mosto. Durante la medición, el biosensor se
sumerge en un microtubo que contiene una solución de medición.

Los ensayos de HPLC de referencia se realizaron en el sistema HPLC Waters 600E (Waters,
Milford, EE.UU.) equipado con un detector de refractómetro (modelo PU 4026, Philips,
Eindhoven, Países Bajos).

Las determinaciones enzimático-espectrofotométricas se realizaron con el espectrofotómetro

DR 2800 obtenido de Hach Lange (Düsseldorf, Alemania).
2.2. Métodos

2.2.1. Mediciones biosensoriales

Los biosensores amperométricos enzimáticos que utilizan oxidorreductasas utilizadas en este

trabajo se desarrollaron en cooperación con Biorealis Ltd y la Universidad Eslovaca de
Tecnología. Los detalles de los principios de funcionamiento de los biosensores presentados se
describen en la Sección 3 . Las enzimas se inmovilizan sobre los electrodos de oro PLA-nar de
trabajo (S = 0,02 cm 2) entre un quitosano

Contagem de '

sandwich ( Monošík, Stredansky, Greif, y Šturdík, 2012b; Monošík,

Contagem de '

Stredansky, Greif, y Šturdík, 2012c ).

El biosensor de glucosa se construyó por inmovilización de 8 Unidades de GDH-FAD. Las

mediciones que re realizaron en un tampón de fosfato (PB) a pH 5,5 con 1 g L 1 de sulfato de
N-metil methylphenazonium (PMS) en un medio de trabajo actúan como un mediador, y se
aplican-ing de trabajo potencial 50 mV frente a Ag / electrodo de referencia AgCl ( Monošík,
Stredansky', Lušpai, Magdolen, y Šturdík, 2012D ).

El biosensor para la monitorización de los oligosacáridos se basó en GDH-PQQ (8 unidades se

depositaron en el electrodo de trabajo) y el biosensor de fructosa se fabricó mediante
inmovilización de 4 unidades de FDH. Ambos biosensores estaban operando en las mismas
condiciones de trabajo descritas para la determinación de glucosa.

Los biosensores de alcohol utilizaron 2,5 unidades de ADH y 1 unidad de DP. Las condiciones
de trabajo fueron las siguientes: 0,4 M PB con 2 mM de NAD + y ferricianuro 5 mM, potencial
aplicado fue 300 mV.

El biosensor de glicerol utilizó una cascada multienzimática que consistía en GK / CK / CRE /

SAOX / HRP. Las mediciones se realizaron en 0,1 M PB (pH 7,5) que contiene los cofactores (5
mM de creatina phos-Phate, ATP 4 mM y 15 mM de magnesio heptahydr sulfato ate), y
ferricianuro mediador (5 mM). El potencial de trabajo fue

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50 mV. Detalles sobre este biosensor se pueden encontrar en el trabajo

Contagem de '

por Monošík, Ukropcová, Stredansky, y turdík S (2012E) . La determinación biosensorica se

realizó inyectando 5 ó

10 l L de muestra (diluida si es necesario) y la solución de calibración 2 (antes y después de la

inyección de la muestra) en 1 ml de medio de medición a temperatura ambiente. El tiempo de
análisis fue de hasta 8 min. Los biosensores se almacenaron en una solución de medición a
temperatura ambiente cuando no se usaron. Se utilizaron durante un período de 10 h, después
se utilizó el nuevo. Los biosensores se ensayaron también sobre posibles interrelaciones
ferencias (oxígeno, polifenoles, etanol, sacarosa, fructosa, hombre-nariz, lactosa, L láctico,
cítrico, tartárico, acético y ácido ascórbico L) y no hay respuestas actuales significativos fueron
observados (por más detalles ver documentos citados anteriormente).

2.2.2. Análisis de HPLC

Las condiciones analíticas fueron como sigue: columna Polymer IEX en forma H + 250 8 mm, 8 l
m de diámetro (Watrex, Bratislava, Slo-vaquia); temperatura de la columna 80 LC y presión
300 Psi; fase móvil Agua Milli-Q; velocidad de flujo 1,0 ml min 1. Los datos fueron recogidos y
procesados por una estación de cromatografía de claridad DataApex (Praga, República Checa).
Las muestras se diluyeron en una fase móvil y se filtran a través de 0,22 l m filtros CHROMAFIL
AO, Macherey-Nagel

(Duren, Alemania) antes del análisis. La glucosa, la fructosa, la maltosa, la maltotriosa, el

glicerol y el etanol se identificaron por comparación con los tiempos de retención y coelución
de soluciones estándar auténticas.

2.2.3. Ensayos espectrofotométricos enzimáticos

2.2.3.1. Glucosa. La glucosa se oxida a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno por glucosa
oxidasa. El peróxido de hidrógeno reacciona con o-dianisidina en presencia de peroxidasa para
formar un producto coloreado. La o-dianisidina oxidada reacciona con el ácido sulfúrico para
formar un producto rosado más estable que se puede medir a 540 nm.

En primer lugar, las muestras se diluyeron a aproximadamente 10-40 l g ml 1 de la glucosa. El

0,98 ml de PB (pH 6,5) y 0,02 ml de solución de o-dian-Isidine (4,5 mg ml 1 solución en HCl
0,02) eran pippet-ed en una cubeta de espectrofotómetro. A continuación, se añadieron 15
unidades de glucosa oxidasa y 5 unidades de peroxidasa. La mezcla se agitó suavemente y se
inició la reacción añadiendo 0,5 ml de soluciones estandar para la curva de calibración o
muestras para análisis. Las mezclas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Después, la
reacción se detuvo mediante la adición de 1,0 ml de 6 MH 2 SO 4 en cada CUV-ette. A
continuación, el color desarrollado se midió a 540 nm, utilizando como blanco una solución
que contenía todos los componentes excepto la glucosa.

2.2.3.2. Maltosa, oligosacáridos y dextrinas. La glucoamilasa para la descomposición de las

cadenas de sacáridos se añadió al principio así como la mutarotasa para el equilibrio
mutarotation de la glucosa en el 0,1 M PB de pH 6,0. Finalmente, se determinó la glucosa
usando el mismo principio que el descrito para el experimento de glucosa.

2.2.3.3. Fructosa. En presencia de ferricianuro, la fructosa es oxi-subven- por fructosa

deshidrogenasa a 5-ceto D -fructose y ferricianuro se reduce a ferrocianuro, que reacciona en
la siguiente etapa con sulfato férrico. La aparición del azul prusiano formado por reacción de
quelato se mide a 660 nm por espectrofotometría. El pH del tampón McIlvaine usado para este
procedimiento fue 4,5.

En primer lugar, las muestras se diluyeron a aproximadamente 0,5 g L 1 fructosa. El 450 l L de

solución de McIlvaine tampón (pH 4,5) que contiene 0,1% de Triton X-100 (w / w) se pippeted
en una cubeta de espectrofotómetro de espacio en blanco, 400 l L para la muestra y 425, 415,
400, 380, 370, 360 l L para las mediciones de calibración. Entonces la solución estándar que
contiene 0,5 g L 1 fructosa se pipeteó en cubetas de calibración para lograr volumen de 450 y
50 l de L de la muestra se añadieron en cubetas de muestra. La reacción se inició mediante la
adición de 5 l L de 1,5% (w / w) de fructosa deshidrogenasa (10 unidades). La mezcla se agitó
suavemente

y se incubaron durante 5 min a 37ºC. Después, 50 l L de solución de ferricianuro 0,1 M potas-

sium que contiene 0,1% (w / w) de Triton X-100 se pipetearon a cada cubeta y mezclas se
incubaron de nuevo durante 5 min a 37 LC. La reacción se detuvo mediante la adición de 250 l
L de solución de sulfato férrico-SDS (250 mg Fe 2 (SO4) 3 H 2 O, 150 mg de dodecilsulfato de
sodio, aproximadamente 6,8 g de crystalic o 4,75 ml de ácido fosfórico al 85%, y 50 ml de agua
Milli-Q). Después de esto, las cubetas se incubaron durante 20 min a 37ºC. Finalmente, se
añadieron 1,750 l l de agua Milli-Q y la aparición de azul de Prusia era mea-sured a 660 nm
mediante un espectrofotómetro.

2.2.3.4. Glicerol. Determinación de glicerol se realizó acuerdo-ing el principio descrito en

nuestro trabajo anterior utilizando glicerol quinasa, glicerol fosfato oxidasa, peroxidasa y o-
dianisidina ( Monošík et al., 2012E ).
Brevemente, las muestras se diluyeron a la concentración de glicerol aproximadamente 20-30 l
g ml 1. El 974,5 l L de 0,1 M PB (pH 7,5) y 0,02 ml de solución de o-dianisidina (4,5 mg ml 1
solución en HCl 0,02) se pippeted en una cubeta de espectrofotómetro de la adición de 1 mg
de ATP y 3 mg de MgSO 4 7H 2 O. Luego, 10 unidades de glicerol quinasa, 7,5 unidades de L -
se añadieron una oxidasa -glycerolphosphate, y 6 unidades de peroxidasa. La mezcla se agita
suavemente y se comienza la reacción añadiendo 0,5 ml de soluciones patrón para la curva de
calibración o muestras para análisis. Las mezclas se incubaron durante 30 min a 37ºC. Después,
la reacción se detuvo mediante la adición de 1,0 ml de 6 MH 2 SO 4 en cada cubeta. A
continuación, se midió el color desarrollado a 540 nm, utilizando como blanco una solución
que contenía todos los componentes excepto el glicerol.

2.2.3.5. Etanol. El análisis de etanol se realizó mediante la simple detección de NADH a 340 nm
formada durante el curso de una reacción catalizada por alcohol deshidrogenasa en 0,4 M PB
de pH 9,0. Eth-anol se oxida en presencia de NAD +, que se reduce a la NADH.

Las muestras se diluyeron hasta la concentración de etanol aproximada- mente 0,1% (v / v). El
2000 l L de tampón y 2 mg de NAD + se añadieron en una cubeta de espectrofotómetro.
Posteriormente, se pippeted 15 unidades de alcohol deshidrogenasa y 10 l L de estándar de
etanol 0,1% o SAM-ple. Las mezclas se incubaron durante 20 minutos a 40 LC. El NADH
formado se midió por espectrofotometría a 340 nm.

3. Resultados y discusión

Este estudio se centró en los análisis realizados mediante bio-sensores, espectrofotometría y

HPLC. Los biosensores representan un método analítico moderno y rápido que todavía no está
muy extendido en el análisis rutinario de muestras reales. Espectrofotometría y HPLC son
métodos aprobados, sin embargo, requieren equipos más caros, personal de laboratorio
educado y comparado con biosensores, estos métodos consumen mucho tiempo. Por lo tanto,
se analizaron dos series diferentes de muestras de mosto obtenidas en intervalos de tiempo
secuenciales de proceso de fermentación, y se compararon los tres métodos para cada analito
controlado. Características analíticas obtenidos para biosensores utilizados en este trabajo se
resumen en la Tabla 1 . El límite de detección (LOD) se definió mediante una relación señal a
ruido de 3 a 1 y un límite de cuantificación (LOQ) de 10 a 1. Los biosensores pudieron analizar
al menos 15 muestras seguidas sin ninguna deriva o pérdida de sensibilidad. La estabilidad de
almacenamiento fue de al menos 6 meses para todos los tipos.
Monitorización de la composición de azúcar en el mosto y la cerveza juega un papel
importante en la tecnología de elaboración de la cerveza moderna, sobre todo en el desa-
rrollo de nuevos tipos de cerveza y en la selección de nuevas cepas de levaduras y materias
primas ( Cortacero-Ramírez et al., 2003 ). Los principales azúcares del mosto fermentable
suelen ser glucosa (alrededor del 20% del

R. Monošík et al. / Food Chemistry 138 (2013) 220-226

223

tabla 1

Características analíticas obtenidas para los biosensores utilizados en este trabajo.

Biosensor

LOD (mg L 1)

LOQ (mg L 1)

Sensibilidad (nA l M 1 cm 2)

Maltosa

0,76

2,53

41,28

Glucosa

0,26

0,87

62,78

Fructosa

1,31

4,36

12,63

Alcohol
0,06

0,18

77,64

Glicerol

0,21

0,70

39,89

el total), maltosa (aproximadamente 60%) y maltotriosa (aproximadamente 20%), y se

consumen en ese orden con cierta superposición. Ocasionalmente la levadura puede no
consumir toda la maltotriosa. Esto se traduce en problemas fla-vour y un bajo rendimiento de
etanol sobre la hierba de hidratos de carbono ( Londesborough, 2001 ). Sin embargo, durante
la fermentación, los dext-rins están presentes en el mosto (como resultado de la degradación
previa del almidón), y se detectaron mediante métodos analíticos utilizados en este trabajo.
Sólo en el caso del análisis por HPLC fue posible reconocer respuestas únicas para mono- u
oligosacáridos de hormigón, es decir, se obtuvieron los picos separados de glucosa, fructosa,
maltosa, maltotriosa y dextrinas. Se intentó desarrollar un método para la detección de
maltosa como una alternativa para la HPLC. Sin embargo, como ambos de la Fig. 2 (A y B) indi-
cado, biosensóricas y método espectrofotométrico proporcionado resultados-ent difieren
cuando se compara con HPLC expresa como la suma de la maltosa y la maltotriosa. Los
resultados fueron obviamente los más altos cuando se midió con un ensayo
espectrofotométrico enzimático uti lizando glucoamilasa, mutarotasa, glucosa oxidasa y
peroxidasa. En este kit de baja especificidad, la enzima glucoamilasa descompone el almidón,
las dextrinas y los oligosacáridos en glucosa y, en el siguiente paso, la glucosa oxidasa
interactúa tanto con la glucosa libre como con la glucosa presentada después de la
descomposición, respectivamente. Por lo tanto, este procedimiento es adecuado para los
datos informativos sobre el contenido de azúcar, no para el análisis específico de maltosa. El
enfoque para desarrollar un biosensor de maltosa se realizó mediante la utilización de la
glucosa deshidrogenasa PQQ-dependiente y el siguiente principio utilizando PMS como un
mediador (Med):

GDH-PQQ
D-Glucosa D u otra th th azúcar ½ Med y buey !

ð1Þ

D-glucono-1; 5-lactona ð o correspondiente þ lactona Þ ½ Med & red

½ Med y rojo! ½ Med y þ buey e

ð2Þ

GDH-PQQ es conocida por su baja especificidad y puede oxidar una variedad de mono-, di- u
oligosacáridos, incluyendo maltosa ( Igarashi, Hirokawa, y Sode, 2004 ), por lo que era
cuestionable si los resultados sería satisfactorio o sobrevalorado. Los niveles de azúcar
obtenidos por un biosensor fueron superiores a los obtenidos por la HPLC al inicio del proceso
de fermentación, es decir, de 0-48 h para las muestras Richtár Jakub y para las muestras '' 0 '' y
'' 24 h '' para Heineken . El resto de los resultados se correlacionaron bien. La explicación de los
mayores niveles de su-gar observados por el biosensor es que a medida que el proceso de
fermentación se desarrollaba, la glucosa era consumida por la levadura antes de la maltosa y

maltotriosa, por lo que la glucosa ya no interfiere. Algunos injertos de almidón restantes

también podrían interactuar con GDH-PQQ. Los niveles más altos de azúcar en la muestra
Richtár Jakub '' 22 h '' en comparación con la muestra '' 0 h '' se debieron probablemente al
uso de un aditivo que contenía azúcares para suplementar el mosto o usando una preparación
llamada Fungam-yl que contenía alfa-amilasa fúngica como en el caso de las muestras de
Heineken. La alfa-amilasa hidroliza enlaces alfa-1,4-glicosídicos en amilosa y amilopectina, y el
producto final es maltosa. Este enfoque disminuye los gastos del proceso de elaboración de la
cerveza. Con base en los resultados, podemos concluir claramente que el método de HPLC
demostró ser el más específico y adecuado para el análisis de maltosa o maltotriosa. Por otro
lado, los biosensores y la espectrofotometría mejor reflejaron una disminución en la
concentración de azúcar durante el proceso de fermentación. En la literatura, se describieron
pocos enfoques para la determinación biosensorica de la maltosa. Odaci et al. biosensores
fabricados uti-glucosidasa y lizing una piranosa oxidasa ( Odaci, Telefoncu, y Ti- mur, 2010 ).
Estas enzimas son también de baja especificidad y un biosensor fue probado sólo para dos
productos de cerveza, no para muestras de mosto. En un estudio de especificidad de sustrato,
se observaron respuestas de biosensor para glucosa, galactosa, xilosa y sacarosa, pero no se
probó maltotriosa. Suponemos que este concepto tampoco representa una solución óptima
para la detección de maltosa durante un proceso de fermentación. Otros trabajos de Tessema
et al. descritos para la determinación de azúcares basados en oligosacárido deshidrogenasa
estudiados como sensores en un sistema de inyección de flujo. Los electrodos se activa para la
L-arabinosa, D -xylose, galactosa D, D -fruc-Tose, -glucosa D, manosa D, celobiosa, lactosa,
maltosa, y malto-oligosacárido ( Tessema et al., 1997 ). Por lo tanto, el desarrollo de
biosensores altamente específicos para la maltosa aplicables en matrices complejas que
contienen mono- y oligosacáridos todavía representan un gran desafío analítico.
Para la detección de glucosa, se utilizó un biosen sor comercialmente disponible que empleaba
GDH-FAD altamente específico. Se basa en el siguiente mecanismo de reacción:

D Glucosa þ ½ Med y buey

GDH FAD

D glucono 1; 5 lactona

þ ½ Med y rojo

ð3Þ

El siguiente paso de la reacción sigue siendo el mismo que el mostrado en la Ec. (4) ,
incluyendo la misma detección electroquímica. Como se puede ver tanto en la Fig. 3 A o B,
respectivamente, no se encontraron diferencias significativas. Es de destacar que biosensor
era el único método capaz de detectar glucosa en la fase posterior de la fermentación
(concentra-ción en la última etapa se encontró que era alrededor de 4,5 mg L 1 después de
injec-ción de un L muestra de 10 l en 1 ml de medidores). Esto demostró la alta sensibilidad y
el bajo límite de detección del método propuesto.

Se utilizó un principio similar para la detección biosensorial de la fructosa:

Fig. 2. Perfil de los oligosacáridos durante la fermentación del mosto en muestras de las
cervecerías Richtár Jakub (A) y Heineken (B). Los resultados de HPLC se expresan como la suma
de maltosa y maltotriosa. Los resultados se expresan en g L 1 ± STDEV (n = 5).

224 R. Monošík et al. / Food Chemistry 138 (2013) 220-226

Fig. 3. Perfil de la glucosa durante la fermentación del mosto en muestras de las cervecerías
Richtár Jakub (A) y Heineken (B). Los resultados se expresan en g L 1 ± STDEV (n = 5).

D fructosa þ ½ Med y buey

FDH PQQ

5 keto D fructosa

þ ½ Med y rojo

ð4Þ

La detección electroquímica es la misma que para el biosensor de glucosa y en ambos casos se

utilizó el PMS como mediador. Basado en los resultados presentados en la Fig. 4 A y B es obvio
que los resultados biosensóricas correlacionan bien con referencia HPLC obtenida de este
modo, mientras que espectrofotometría proporcionado en la mayoría de casos, los valores
ligeramente superiores. Esto probablemente se puede atribuir a alguna interacción menor de
ferri-cianuro con polifenoles presentados en las muestras de mosto. Estas diferencias son
despreciables considerando los niveles de fructosa en las muestras. De forma similar a la
glucosa, la fructosa tampoco fue detectada por la HPLC en las etapas posteriores de la
fermentación.

El etanol y el glicerol son los alcoholes más representados en una cerveza. La medición del
alcohol juega un papel importante en el control de calidad del mosto durante el proceso de
fermentación, ya que su nivel indica la etapa de fermentación y un nivel de etanol demasiado
alto puede conducir a la inhibición de la levadura. La concentración de etanol puede reducirse
por destilación en evaporadores de película o por ósmosis inversa. El contenido de etanol en
muestras de alimentos se puede determinar por varios métodos de análisis, por ejemplo,
cromatografía de gases ( Clarkson, Onnrod, y Sharpe, 1995 ), HPLC ( Lefebvre, Gabriel,
Vayssier, y Fontagne'-Faucher, 2002 ), espectrofotometría ( Arthur Caputi, Ueda,

& Brown, 1968 ), refractometría ( Rogerson y Symington, 2006 ) o biosensor ( Valach, Katrlík,
Šturdík, y Gemeiner, 2009 ). En nuestro caso, el biosensor amperométrico utilizado en este
trabajo fue desarrollado por nosotros con fines comerciales y utilizó el siguiente mecanismo de
reacción y ferricianuro como mediador:

ADH

ð5Þ

El etanol þ þ NAD ! acetaldehído þ NADH þ H þ

DP

d6 Þ

NADH þ þ H þ ½ Med y buey ! NAD þ þ 2e þ 2H þ þ ½ Med y rojo

El proporcional corriente eléctrica a la concentración de analito resultante de la re-oxidación
de [Med] rojo (ferrocianuro) directamente en el electrodo de trabajo se midió a potencial
constante.

Como se puede ver en la Fig. 5 A, los resultados obtenidos por todos los métodos
correlacionaron bien. Sin embargo, en el caso de la muestra "22 h", el método de HPLC no
detectó etanol. Probablemente fue la alta especificidad y sensibilidad de ambos métodos
enzimáticos que permitieron medir incluso un contenido de etanol muy bajo, es decir, por
debajo del 0,2% (v / v). Un efecto similar se observó en el caso de la muestra '' 0 '' de Heineken
( Fig. 5 B) y también se logró una buena correlación de los resultados. La dilución de muestras
fue necesaria para el uso de cada método. Dado que la determinación espectrofotométrica del
etanol no es una dependencia lineal, se utilizó el método de calibración de un punto y la
muestra tuvo que ser diluida a una concentración muy similar a la concentración de la solución
patrón para obtener resultados precisos. El mayor contenido de alcohol en la muestra
Heineken '' 216 h '' fue confirmado por todos los métodos. Se sabe de la literatura que cuando
se utiliza fábrica de cerveza de alta grav-dad, una cerveza con un contenido de etanol final de
7,5% (v / v) es pro-ducido y se diluyó adicionalmente ( Piddocke, Kreisz, Heldt-Hansen, Nielsen,
y Olsson, 2009 ). El uso de alta gravedad elaboración de la cerveza Technol-logía aumenta la
capacidad de la cervecería en un 20-30% y reduce los gastos para las instalaciones, energía y
mano de obra, y mejora la tersura de la cerveza y la estabilidad de la neblina ( Stewart, 2007 ).

El glicerol está formado por levaduras durante la fermentación alcohólica y contribuye a la

viscosidad y la calidad sensorial. También puede ser con-sidered como indicador de la
fermentación y su producción está relacionada con la presencia de microorganismos en
productos alimenticios ( Cordela, Antinel- li, y Carbrol-Bass, 2003 ). La metodología detallada
de las técnicas biosensoricas determinación (empleando cascada multi-enzima que consta de
GK / CK / CRE / SAOX / HRP y ferrocianuro se demostró en nuestro trabajo Previ-ous ( Monošík
et al., 2012E ). De un vistazo, resultados presentados en la Fig. 6 A y B puede parecer que
difieren entre sí, sin embargo las concentraciones son en general bajo y varían de
aproximadamente 1,5 g L 1 o menos. Cor-relación del método aplicado es, por tanto
satisfactoria.

En algunos casos, como la determinación de glucosa en muestras de Richtár Jakub, la fructosa

en muestras de las últimas etapas de fermentación (tanto para Richtár Jakub como Heineken)
o los análisis de glicerol, los resultados no se correlacionaron completamente. Esto puede
atribuirse a la
Fig. 4. Perfil de fructosa durante la fermentación del mosto en muestras de las cervecerías
Richtár Jakub (A) y Heineken (B). Los resultados se expresan en g L 1 ± STDEV (n = 5).

R. Monošík et al. / Food Chemistry 138 (2013) 220-226

225
Fig. 5. Perfil de etanol durante la fermentación del mosto en muestras de las cervecerías
Richtár Jakub (A) y Heineken (B). Los resultados se expresan en% ± STDEV (n = 5).

Fig. 6. Perfil de glicerol durante la fermentación del mosto en muestras de las cervecerías
Richtár Jakub (A) y Heineken (B). Los resultados se expresan en g L 1 ± STDEV (n = 5).

las propiedades específicas individuales de los métodos aplicados y no es un fenómeno

inusual. Según nuestro conocimiento, la literatura científica carece de un estudio exhaustivo
que describa el monitoreo de analitos individuales, especialmente el contenido de sacáridos
durante un proceso de fermentación por biosensores en comparación con otros métodos
analíticos comúnmente utilizados. Aunque los biosensores rara vez se emplean en análisis de
laboratorio de rutina o monitoreo de procesos industriales in situ, los resultados mostrados en
este documento manifiestan su gran potencial. Es importante señalar el bajo precio de los
análisis, especialmente cuando se miden series grandes de muestras, usualmente sólo se
requiere dilución en el proceso de pretratamiento de la muestra. Los gastos de
establecimiento fueron los más altos para HPLC, mientras que los gastos operativos fueron los
más altos para la espectrofotometría y relativamente bajos para los bio-sensores y HPLC. La
espectrofotometría es notablemente cara y desventajosa para los análisis de un número
pequeño de muestras, lo que también puede ser el caso de la monitorización de la
fermentación, cuando sólo se puede analizar una sola muestra al día. Por otra parte, la
determinación biosensorica fue menos lenta en comparación con la HPLC o
espectrofotometría y la posibilidad de realizar análisis in situ es, sin duda, una ventaja
considerable. El análisis de tiempo medio para los biosensores fue de 6-8 min, mientras que
para HPLC fue de 20-30 min. Los procedimientos de prepa ración para espectrofotometría
fueron tediosos y tardaron casi 2 horas. Sin embargo, la medida final de una muestra particular
por espectrofotómetro es muy rápida (hasta 2 s) y este método es óptimo para series más
grandes de muestras. Además, los biosensores se pueden aplicar también para el análisis de
otras muestras de alimentos que mosto, por ejemplo, bebidas, vino, productos lácteos etc. (
Monošík et al, 2012a;. Prodr- omidis y Karayannis, 2002 ).

4. Conclusión

Este trabajo presenta un amplio estudio comparativo de tres métodos de análisis, a saber, la
técnica de biosensóricas analítica moderna, ensayos espectrofotométricos enzimáticos de
referencia y

HPLC utilizado para el control de proceso de mosto de fermentación. Todos los biosensores
utilizados en este trabajo fueron desarrollados por nuestro equipo de investigación para que
sean compatibles con los dispositivos analíticos comerciales de la serie Omnilab (Biorealis,
Ltd.). Dos series de muestras de mosto represen-tando etapas individuales de la fermentación
se proporcionan a partir de Heine-ken y Richtár Jakub, una pequeña cervecería local. Podemos
concluir que para el seguimiento específico de maltosa o maltotriosa sólo el método HPLC era
adecuado. Sin embargo, los biosensores y espectrofotometría fueron capaces de detectar
tanto la glucosa y la fructosa en las etapas de la-ter de la fermentación, mientras HPLC no lo
era. Esto se puede atribuir a los límites de detección bajos y una buena sensibilidad de los
métodos propuestos. Para el etanol y glicerol analiza todos Meth-ods demostraron ser
adecuado. Sin embargo,en relación con los costos y el tiempo invertidos en los análisis,
biosensores eran la mejor variante.
Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por la Agencia Eslovaca de Investigación y Desarrollo (Proyecto
VMSP-P-0073-09) y la Agencia del Ministerio de Educación, Ciencia, Investigación y Deporte de
la República Eslovaca para los Fondos Estructurales de la Unión Europea (Proyecto ITMS
26240220040) .

También nos gustaría dar las gracias al Heineken y cervecerías Richtár Jakub para proporcionar
muestras de mosto.