UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO

VILLARREAL
FACULTAD DE ODONTOLOGIA

GUIA DE PRACTICAS MICROBIOLOGIA

2018-1
 AUTOR

Nora Bravo Cruz

Bióloga Microbióloga
Profesor Asociado
Facultad de Ciencias Naturales y Matemática.
Universidad Nacional Federico Villarreal

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA BLGA: NORA BRAVO CRUZ

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 INDICE

Regulaciones y normas de seguridad en el laboratorio

Equipos del laboratorio de microbiología
Preparación de material
Esterilización y desinfección
Preparación de medios de cultivo
Métodos de siembra
Observación de colonias
Coloraciones bacterianas
Susceptibilidad de los microorganismos frente a los antibióticos
Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias

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 REGULACIONES Y NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

INFORMACION GENERAL
 Antes de cada sesión de trabajo se debe leer la guía de práctica y planificar el
trabajo cuidadosamente.
 No empezar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones. La sesión de
trabajo se iniciará con las instrucciones del profesor de prácticas. Si la
información del instructor o del manual no están claras, realice las preguntas
adecuadas.
 Anote todas las observaciones cuando las realice. El examen práctico incluirá la
información que el profesor de prácticas le brindará, la del manual y la de sus
propias observaciones y conclusiones.
 Responda las preguntas en las hojas de respuestas incluidas.

REGLAS DEL LABORATORIO

 Los alumnos deben venir con las uñas cortas y con el cabello debidamente
sujetado.
 Debe usar un mandil limpio cuando este en el laboratorio. Este debe ser lavado
por lo menos una vez a la semana utilizando agua caliente y lejía.
 Antes de empezar y después de trabajar limpie la mesa del laboratorio y cada
vez que sea necesario (derrame de material contaminado).
 Coloque sólo el material indispensable sobre las mesas de laboratorio. No
colocar bolsas, ni mochilas u otro material que no sea del curso.
 Nunca utilice la boca para pipetear, el material puede ser tóxico o infeccioso.
 Esta PROHIBIDO comer, fumar o aplicarse cosméticos en el laboratorio.
 Lávese las manos con agua y jabón antes de retirarse del laboratorio.
 Coloque el material contaminado en envases apropiados los que deben ser
esterilizados al terminar las prácticas, siendo de responsabilidad del grupo
correspondiente de acuerdo al cronograma.
 Algunos de los reactivos y los microorganismos con que se trabajan son
peligrosos. Use guantes o mascarillas descartables cuando sea necesario y siga
las instrucciones del profesor de prácticas.
 Reporte los accidentes o derrames del material, incluso los menores al
instructor. Estos reportes no serán tomados en cuenta para la nota.
MATERIAL NECESARIO
El alumno debe contar con el siguiente material para el desarrollo de las prácticas:
 Desinfectantes: Alcohol
 Jabón líquido y toallas de papel
 Material de escritorio: Plumón indeleble, Caja de colores
Material de limpieza: detergente, escobillas.
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 PRACTICA 1. EQUIPOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

OBJETIVO
Conocer el funcionamiento de los equipos utilizados en el laboratorio de
microbiología.
Entrenarse en el uso y manejo de equipos y materiales de laboratorio.
INTRODUCCION
En un laboratorio de microbiología, es necesario la utilización de ciertos
instrumentos para llevar a cabo su normal funcionamiento. Los instrumentos más
comunes en un laboratorio de microbiología son: microscopio, incubadora,
autoclave, horno, refrigeradora, baño maría, centrífuga, balanza, potenciómetro,
porta filtros.

1. EL MICROSCOPIO Y SUS PARTES

El microscopio, es el instrumento más importante utilizado por los
microbiólogos, de los cuidados y correcto uso dependerán el éxito de las
observaciones. Es función del microscopio hacer visible aquellas cosas tan
pequeñas que el ojo humano no puede hacerlo, está compuesto de un
sistema de lentes de suficiente magnificación y poder de resolución que
aquellos elementos que están muy juntos entre sí, se puedan distinguir
separados dando una imagen clara y detallada cuando se utiliza suficiente
iluminación.
El aumento total de un microscopio se determina multiplicando el aumento
que proporciona el ocular por el aumento que proporciona el objetivo.
Parte mecánica, esta constituida por:
 Soporte
 Cuerpo con el revólver porta-objetivos
 Platina
 Reguladores de enfoque: tornillos macrométrico y micrométrico.
Parte óptica, constituida por:
 Oculares, con diferente magnificación, 5X, 10X, 15X, puede ser
monocular o binocular
 Objetivos secos, bajo poder 10X, alto poder 40X.
 Objetivo de inmersión de gran definición 96X ó 100X
Sistema de iluminación, constituido por:
 Espejo, plano y cóncavo
 Condensador
 Diafragma

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  Fuente de iluminación
2. LA INCUBADORA
Equipo que se caracteriza por tener temperaturas fijas o que fluctúan en un
rango muy corto +- 0.2°C, la cual se esta regulada mediante un termostato,
se utiliza para mantener los cultivos a una temperatura adecuada según los
requerimientos del germen con el cual se está trabajando.
3. LA REFRIGERADORA
Equipo para proporcionar ambientes de temperaturas bajas, se utiliza con
fines de conservación para el material biológico, medios de cultivo ya
preparados, reactivos etc.
4. EL BAÑO MARIA
Equipo que se utiliza para mantener temperaturas homogéneas que
transmitirán calor en forma indirecta. El rango de temperatura se puede
graduar de acuerdo a la utilidad que se le va a dar, para licuar medios de
cultivo por ejemplo se utilizará entre 70°C y 90°C
5. LA CENTRIFUGA
Equipo que se caracteriza por proporcionar fuerzas centrífugas que
permitirán al usuario separar sustancias a diferentes velocidades y rangos de
temperatura predeterminados, para procesar una muestra de orina se
requiere 3,000 r.p.m. x 5'
6. LA BALANZA
Instrumento de precisión que se utiliza para determinar el peso de diferentes
sustancias, existen diversos tipos de acuerdo a las necesidades, con
diferente sensibilidad.
7. EL POTENCIOMETRO
Instrumento de precisión que sirve para determinar la concentración de iones
(pH) en diferentes soluciones, sustancias o medios de cultivo (líquidos o
sólidos), dependiendo de la sustancia que se quiera medir el pH se elige el
tipo de electrodo a utilizar.
8. CONGELADORA
Para mantener reactivos que son sensibles al calor o para mantener
muestras o cepas. Son de -20°C y -70°C.
9. CAMARA DE BIOSEGURIDAD
Equipo que se utiliza para manipular microorganismos altamente infecciosos.
Sistema cerrado o semicerrado que permite trabajar con agentes infecciosos
evitando la contaminación tanto del operador como del material en trabajo
En estos sistemas el aire que entra y sale pasa a través de filtros de alta
eficiencia (HEPA).

10. AUTOCLAVE

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 Equipo que se utiliza para esterilizar material de laboratorio. Sistema de
cerrado hermético que permite la entrada de vapor de agua a presión.
Constituye uno de los procedimientos más eficaces para esterilizar material
de laboratorio.
Componentes de la autoclave:
 Tapa
 Sujetadores de la tapa
 Válvula de salida de aire
 Válvula de seguridad
 Cámara de esterilización
 Camiseta de vapor
 Canastilla
 Soporte de canastilla
 Drenaje
 Indicadores de Temperatura, presión.
 Regulador de tiempo
 Fuente de calor
11. EL HORNO
Se caracteriza por proporcionar temperaturas altas, se utiliza para esterilizar
material de vidrio e instrumental metálico mediante calor seco. La
temperatura máxima generalmente es de 200°C.
12. LOS PORTAFILTROS
Equipo que se utiliza como soporte de las membranas de filtro, las que se
usan con diferentes objetivos, por ejemplo, para esterilizar algunas
sustancias (medios de cultivo) o para procesar muestras como es el caso del
estudio bacteriológico de aguas.
13. OTROS
 Jarra (Gaspack) de anaerobiosis
 Mecheros, de alcohol o de gas
 Porta asa o mango de Kolle, para fijar la aguja o alambre de nicrón.
 Gradillas porta tubos.
 Material de vidrio: Matraces, Erlenmeyer, Kitasatos, Probetas, pipetas,
placas de Petri, tubos de ensayo, etc.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué temperatura es la indicada para esterilización en seco?
2. ¿Qué temperatura es la indicada para esterilización con vapor a presión?
Esquematice el equipo de laboratorio, indicando sus componentes.

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 PRACTICA 2: PREPARACION DE MATERIAL

OBJETIVO
Conocer el material de laboratorio utilizados en el laboratorio de bacteriología y su
manera de prepararlo para su uso.
FUNDAMENTO
En un laboratorio de microbiología, cuando se procesan cultivos, es necesario
utilizar material limpio, sin residuos de detergente y estéril para tener éxito en el
aislamiento y posterior identificación de los gérmenes que se está investigando. La
limpieza es un proceso físico mediante el cual se elimina de los objetos en uso las
materias orgánicas y otros elementos sucios mediante el lavado con agua con o sin
detergente.
MATERIAL NECESARIO
 Placas Petri 100 x 15
 Tubos 13 x 100
 Tubos 13 x 100 con tapa de bakelita
 Tubos 15 x 125
 Pipetas serológicas x 1 mL
 Pipetas serológicas x 5 mL
 Pipetas serológicas x 10 mL
 Matraces de 500 mL
 Matraces de 1000 mL
 Probetas
 Láminas portaobjeto
 Algodón
 Papel Kraft
 Detergente
 Guantes domésticos
 Escobillas para tubos
PROCEDIMIENTOS
1. Identificar el material y el uso al que esta destinado
2. Lavar el material de vidrio
3. Secar el material
4. Poner tapones de algodón en la boca de las pipetas, tubos y matraces
5. Envolver el material con papel Kraft

PREGUNTAS
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1. ¿Cuál es el detergente adecuado para el lavado de material?
2. ¿Qué riesgos existen en el momento de lavar el material?
3. ¿Cómo se preparan las láminas portaobjetos?
4. ¿Cómo se prepara la mezcla sulfocrómica?
Esquematice el material utilizado en el laboratorio

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 PRACTICA 3: ESTERILIZACION Y DESINFECCION

OBJETIVO
Conocer los procedimientos para la esterilización y desinfección en el laboratorio.
FUNDAMENTO
La desinfección es un proceso en el que se utilizan principalmente agentes químicos
en estado líquido, la pasteurización a 75°C y la radiación ultravioleta. La
esterilización, es la destrucción de toda forma de vida, puede ser por vapor saturado
a presión (autoclave) o por calor seco (horno).
MATERIAL NECESARIO
 Material preparado en la práctica anterior
 Cinta para el control de autoclave
 Horno
 Autoclave
 Agua destilada
ACTIVIDADES
 Procedimientos para el lavado de las manos
 Acondicionamientos del material dentro de los equipos
 Uso de indicadores de esterilización
 Químicos
 Biológicos
 Esterilización por calor seco
 Esterilización por calor húmedo
 Uso de desinfectantes en el laboratorio
 Preparación de solución de fenol al 5% y al 0.5%
 Limpieza de la mesa de trabajo
 Procedimientos para derrame de sustancias infecciosas

CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los procedimientos para evitar los accidentes en el laboratorio?
2. ¿Cuáles son los pasos para la esterilización en seco?
3. ¿Cuáles son los pasos para la esterilización en autoclave?
4. ¿Qué otros métodos de esterilización existen?

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 PRACTICA 4: PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO
Dar a conocer la manera de preparar los diferentes medios de cultivo utilizados en
bacteriología.
MATERIALES
 Balón de 500 mL
 Balón de 250 mL
 Probeta graduada de 500 mL
 Espátula
 Balanza
 Guantes de asbesto
 Autoclave
 Trípode
 Mechero de Bunsen
 Rejilla de asbesto
 Tubos 15 x 125 estériles
 Sangre de Carnero
 Placas Petri 100 x 15
 Caldo Tripticase soya
 Agar Tripticase soya
PROCEDIMIENTOS
1. Pasos generales de la preparación de un medio de cultivo
1.1. Pesar los ingredientes
 El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias
detergentes.
 Si se va a preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se
deberán pesar exactamente uno a uno y colocarlos en un recipiente adecuado
como un balón que tenga el doble de volumen de la cantidad que se va a
preparar.
 Si se va a preparar utilizando un medio deshidratado, se debe leer
cuidadosamente las instrucciones del fabricante y tomar exactamente la cantidad
indicada, teniendo cuidado de cerrar herméticamente el frasco inmediatamente
después de haberlo utilizado.
1.2. Hidratar el medio de cultivo
 Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria,
preferentemente en dos partes, primero la mitad del volumen y se agita
suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se

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 incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta para desprender las
partículas de medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la pared
interna del recipiente.
1.3. Disolver el medio de cultivo
 Si se trata de un medio que contenga agar o gelatina, será necesario la ayuda
del calor para disolverlo. Este calentamiento se puede realizar en un baño maría,
en un mechero con ayuda de una rejilla de asbesto o utilizando un horno
microondas, hasta que se alcance su completa disolución, esto se reconoce
cuando al agitar no se adhiere ninguna partícula de agar a la pared interna del
recipiente. No debe olvidarse que todos los medios de cultivo son sensibles al
calentamiento, por este motivo no debe calentarse más de lo estrictamente
necesario. Los medios de cultivo que no contienen agar o gelatina son solubles
en agua fría.
 Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado, cuando se
utiliza agua destilada neutra esto se logra pesando exactamente los ingredientes
en los medios comerciales; cuando se prepara por componentes es necesario
realizar la medición, para lo cual se puede utilizar un potenciómetro o papel
indicador de pH que tenga un rango útil de 4.0 a 8.0. Si el valor de pH no se
ajusta a los intervalos previstos se debe efectuar la corrección con la adición de
gotas de ácido clorhídrico 1N o hidróxido de sodio 1N.
1.4. Distribuir los medios
 Antes de la esterilización es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones
pequeñas, de ser posible en los recipientes definitivos en los que posteriormente
se llevara a cabo el trabajo (a excepción de las placas Petri).
1.5. Esterilizar
 Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilización se lleva a
cabo en la autoclave a 121°C durante 15 minutos.
1.6. Verter en placas
 Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio
se encuentre a una temperatura de 45 a 55°C para evitar que se formen gotas
de agua de condensación en la tapa de las placas. En la práctica a esta
temperatura es posible sostener el frasco con el medio con la mano desnuda sin
quemarse.
 Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para
asegurar que halla una mezcla uniforme y flameando previamente la boca del
recipiente se agregar el medio de cultivo a las placas Petri que se encuentran
cerca del mechero, aproximadamente 16 a 18 mL a cada una.
 Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar
flameando rápidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.
 Se debe dejar que se enfríe el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la
superficie del medio quedara húmeda, puede colocarse las placas en estufa a
37°C, dejando las tapas ligeramente abiertas y con el lado que contiene el medio
hacia arriba por 30 minutos.

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1.7. Controlar la esterilidad
 Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a
usar de inmediato. Una placa de cada lote preparado deberá colocarse en la
estufa a 37°C para verificar su esterilidad.
 Guardar las placas en posición invertida en el refrigerador hasta el momento de
usar.

2. Medios de cultivo
2.1. Medio simple
 Pesar el TSA y colocarlo en un matraz.
 Añadir el agua destilada y mezclar.
 Calentar hasta ebullición, agitando constantemente.
 Autoclavar a 121°C (15 lb de presión) por 15 minutos.
 Sacar de la autoclave y dejar enfriar a 50°C.
 Preparar placas y tubos en plano inclinado.
2.2. Agar sangre
 Preparar el medio base (Tripticase Soya Agar ó Agar Base para Sangre ó Agar
Brucella ó Agar Columbia) en un frasco estéril según lo descrito anteriormente.
 Al frasco con medio base estéril y previamente enfriado a 45°C, frente a un
mechero a gas para evitar la contaminación, se le añade 5 a 10% de sangre de
conejo o de carnero desfibrinada y fresca, mezclando bien y evitando se formen
burbujas.
 Frente al mechero verter el agar sangre en placas Petri estériles y dejar enfriar.
 Controlar en la incubadora a 37°C por 24 horas.
2.3. Agar chocolate
 Una vez preparado el agar sangre en un matraz ó en un frasco, se calienta en
baño maría a 80°, agitando suave y constantemente hasta que el medio tome un
color chocolate. El tiempo necesario depende de la sangre que se este utilizando
y el uso que se le va a dar.
 Dejar enfriar a 50°C antes de plaquear.
2.4. Preparación de medios en tubos
 Si se utilizan medios semisólidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que
se van a utilizar antes de esterilizarlos, después de ella dejarlo enfriar en
posición vertical.
 Cuando se quieren colocar medios sólidos en tubos igualmente se les debe
distribuir en sus envases finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en
posición inclinada o semi inclinada.

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CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tiene el uso de los medios sólidos?
2. ¿Qué sustancia es la encargada de solidificar los medios sólidos y de donde se
extrae?
3. ¿Por qué se le agrega sangre de origen animal a los medios de cultivo?

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 PRACTICA 5: METODOS DE SIEMBRA

OBJETIVO
Enseñar al estudiante de microbiología las técnicas de siembra de muestras y
aislamiento para la obtención de cultivos puros de bacterias.
MATERIALES
 Placas con agar
 Tubos con caldo nutritivo
 Tubos con agar en plano inclinado
 Tubos con agar en plano semi-inclinado
 Asa de siembra
 Aguja de puntura
 Mechero
 Marcador de tinta indeleble.
 Muestra: cepa de Escherichia coli y absceso o herida
 Incubadora a 37°C.

INTRODUCCION
Las muestras clínicas pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta
razón se utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y
obtenerlos en cultivo puro, para luego identificarlos estudiando sus características
culturales, bioquímicas, de susceptibilidad a antibióticos, etc. La siembra por estrías
si se ejecuta correctamente es el método más útil para obtener colonias aisladas y
cultivos puros.
Si bien las técnicas pueden variar de un laboratorio a otro, a continuación, se
describen algunas de ellas muy útiles para la inoculación de la muestra.

DEFINICIONES
 Siembra. - Es la acción de poner en contacto bacterias con un medio de cultivo;
en el cual luego de un periodo de incubación se van a desarrollar colonias. Los
fines de la siembra son los de aislamiento de la bacteria, su enriquecimiento,
recuento poblacional y estudios bioquímicos.
 Inóculo. - Es la porción de muestra que se siembra.
 Resiembra y repicaje. - Es cuando se extrae con el asa o la aguja de cultivo
una fracción de las colonias a partir de un medio sólido o de un medio líquido y
se lleva este inóculo a otro medio líquido o sólido en el cual se evidencia el
desarrollo de colonias por gérmenes de una sola especie, obteniéndose el
aislamiento bacteriano.
 Cultivo puro. - Es aquel que consta de una sola especie bacteriana.

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 Cepa. - Es una especie bacteriana plenamente identificada por sus
características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y serológicas.
MODALIDADES DE SIEMBRA
 Siembra por estrías. - Consiste en repartir el inóculo por la superficie del medio
sólido con el asa de Kolle, en forma de líneas zigzagueantes.
 Siembra por agotamiento. - Consiste en repartir el inóculo sobre la superficie
del medio sólido produciendo líneas zigzagueantes en tres o cuatro campos de la
placa Petri, rotando sucesivamente la placa. Sirve para aislar bacterias a partir
de muestras muy contaminadas.

 Placa vertida. - En esta modalidad de siembra el inóculo se mezcla con el

medio sólido licuado (45°C aproximadamente). Se utiliza en el recuento de
población bacteriana.

 Siembra por diseminación. - Consiste en sembrar sobre la superficie del medio

sólido a manera de monocapa obteniéndose un desarrollo homogéneo. Sirve
para pruebas de sensibilidad, estudios bacteriológicos y desarrollo masivo de
cepas (recolección para vacunas).

 Siembra por puntura o picadura. - Es una siembra en medio dispuesto en

tubo, consiste en introducir la aguja hasta el fondo o a poca profundidad, según
la naturaleza del medio. Sirve para estudiar las características bioquímicas o
fisiológicas.

1. SIEMBRA POR ESTRIAS SIMPLES

 Flamee hasta la incandescencia el asa de cultivo sobre la llama del mechero.
Deje que enfríe.
 Usando el dedo meñique de la mano derecha, retire el tapón de algodón del tubo
que contiene la muestra.
 Flamee ligeramente la boca del tubo con la muestra.
 Tome una asada de la muestra. El tamaño del inóculo utilizado depende del
estimado del número de bacterias que podría contener la muestra.
 Coloque nuevamente el tapón sobre la boca del tubo.
 Coloque el inóculo sobre un extremo de la superficie de la placa de agar y estríe
toda la placa, procurando que el espacio entre estría y estría sea el mínimo
posible.
 Flamee el asa de cultivo.
 Luego de 5 minutos colocar las placas y tubos sembrados en incubación por 24
horas a 37°C

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2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO
 Flamee hasta la incandescencia el asa de siembra sobre la llama del mechero.
Deje que enfríe.
 Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo.
 Tome una asada de la muestra.
 Coloque nuevamente el tapón sobre la boca del tubo.
 Coloque el inóculo sobre un extremo de la superficie de la placa de agar y estríe
la cuarta parte de la superficie de la placa. Cubra la placa. Esterilice el asa y deje
que se enfríe.
 Rote la placa en un ángulo de 90° y estríe tomando como punto de inicio la parte
final de lo estriado con anterioridad. Esterilice el asa.
 Repita el paso anterior.
 Repita el paso anterior y en este momento estríe toda la superficie de la placa
que falte.
 Luego de 5 minutos colocar las placas y tubos sembrados en incubación por 24
horas a 37°C

3. INOCULACION EN TUBOS CON MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo que se utilizan en tubos pueden estar en forma sólida, líquida
(caldos), o semisólida. En algunos casos se utiliza el asa de siembra para la
inoculación, en otros es necesario la utilización de la aguja de siembra.
 Flamee el asa o aguja de siembra sobre la llama del mechero, deje que se
enfríe.
 Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo.
 Tome una asada de la muestra y tape nuevamente el tubo.
 Destape el tubo que va a ser inoculado.
 En un medio sólido siembre por estrías sobre la superficie de este.
 En un medio semisólido inocule con la aguja de puntura hasta antes de tocar el
fondo del tubo.
 En medios que tienen una parte inclinada y fondo, toque con la punta de la aguja
de puntura una colonia y luego inocule primero el fondo del tubo y luego estríe la
superficie del medio.
 En medios líquidos emulsione el cultivo en el medio.
 Luego de 5 minutos colocar las placas y tubos sembrados en incubación por 24
horas a 37°C.

Esquematice las diferentes formas de siembra utilizados en la práctica:

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 PRACTICA 6: OBSERVACION DE COLONIAS

OBJETIVOS
Aprender las características que diferencian una colonia de otra.
Conocer las características de crecimiento de la colonia su forma, su tamaño, etc.
INTRODUCCION
Las placas de Petri y los tubos sembrados e incubados a 37°C por 18 a 24 horas,
son retiradas de la incubadora para realizar la "lectura" de las colonias anotando sus
características de crecimiento en los diferentes medios de cultivo.
Colonia. - Es el desarrollo masivo de microorganismos de una especie. Es una
agrupación de células bacterianas que comparten las mismas características
morfológicas, fisiológicas y bioquímicas cuando se hallan en un medio sólido o
semisólido y se han originado de una sola célula progenitora. Las colonias elegidas
para ser estudiadas deberán estar separadas una de otra y bien conservadas.
PROCEDIMIENTO
Estudio de las colonias en medio sólido
Con la ayuda de un estereoscopio se observa las características morfológicas de los
distintos tipos de colonias, se enumeran y describen cada una por separado.
Teniendo en cuenta lo siguiente:
 CANTIDAD. - Hacer un recuento si es posible o dar una apreciación (poco,
regular, abundante) de las colonias que son iguales.
 TAMAÑO. - Se mide y expresa el diámetro de cada tipo diferente de colonia en
milímetros. Serán:
 Grandes > de 4mm.
 Medianos de 2 a 4mm.
 Pequeños de 1 a < 2mm.
 Puntiformes < 1mm.
 FORMA. - Redondeada, ovalada e irregular.
 BORDE. - Enteros, ondulados, dentados, festoneados y filamentosos.
 ELEVACION. - Plana, elevada, convexa, umbilicada, papilar o crateriforme.
 SUPERFICIE (ASPECTO). - Puede ser:
 Mucoide, Lisa, Rugosa,
 Brillante u opaca
 PIGMENTO. - Puede verse si la colonia es incolora o pigmentada; indicar el color
y el medio de cultivo.
 Incoloros: Streptococcus.

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  Pigmentos propios: Pseudomonas aeruginosa (bacilo piociánico, colonias
verdes). Bacteroides melaninogenicus (colonias de color negro).
 Pigmentos por el medio: Escherichia coli color rosado en agar MacConkey;
Salmonella color negro en agar SS.
 OLOR. - Proteico, ácido láctico, a heces, a frutas (agradable o desagradable).
 CARACTERISTICAS DEBIDAS AL MEDIO DE CULTIVO:
 La hemólisis en Agar Sangre:
 Beta - hemolíticas: halo claro que indica hemólisis completa.
 Alfa - hemolíticas: halo verdoso que indica hemólisis parcial.
 Gamma - hemolíticas: ausencia de halo que indica no hemólisis.
 Demostración de la acción enzimática sobre el sustrato del medio: Acción
de proteasas, lipasas, DNasas entre otras
 Fermentación de carbohidratos.
2. ESTUDIO DE LAS COLONIAS EN MEDIO LIQUIDO
El desarrollo bacteriano en medio líquido se evidencia por la presencia de:
 Sedimento
 Turbidez
 Película
HAGA ESQUEMAS DE LAS COLONIAS OBSERVADAS:

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 PRACTICA 7: COLORACIONES BACTERIANAS

OBJETIVO

Demostrar la morfología y las diferentes estructuras bacterianas.

INTRODUCCION

La morfología bacteriana puede ser observada de dos formas: por observación de los
microorganismos vivos (sin colorearlos) y las células (bacterias) muertas y teñidas con
colorantes apropiados.

Las bacterias vivas casi siempre son incoloras y no dan suficiente contraste con el
agua en el cual ellas están suspendidas, para ser visibles con claridad al microscopio.
Al ser teñidas se incrementa el contraste con lo que le rodea, por lo tanto, son más
visibles. Ciertas coloraciones pueden ayudar a identificar estructuras internas y el uso
del objetivo de inmersión para su observación al microscopio es más conveniente
para aumentar su magnificación.

Razones por las cuales se preparan y se usan preparaciones coloreadas de

microorganismos:

Para identificar las diferentes formas de los microorganismos

Para identificar las estructuras en la célula bacteriana

COLORACION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

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1. MATERIAL NECESARIO

 Material de vidrio
Láminas portaobjeto: 4 por grupo
Pipetas Pasteur estériles 4 por grupo

 Material biológico
Cultivo de Escherichia coli
Cultivo de Staphylococcus aureus
Mezcla de cultivos (a) y (b)
Tubo conteniendo saliva

 Colorantes
Azul de metileno
Cristal violeta
Carbol fucsina

 Otros
Asas de siembra
Plumón indeleble
Puente soporte de láminas
Frascos goteros

 Equipo necesario
Microscopios: 1 por grupo

PROCEDIMIENTOS
2. Preparación del frotis o extendido de la muestra

Antes de colorear, se debe fijar el material a ser observado, si la preparación

no está fijada a la lámina, las células se despegarán durante el proceso de coloración.
El método para preparar los extendidos que se describe es preliminar a la mayoría de
los diferentes métodos de coloración para bacterias. En este ejercicio el alumno
utilizará el calor para matar las bacterias y producir así la adherencia al portaobjeto.

2.1 Utilizando un asa de siembra, colocar una asada de caldo de cultivo sobre los
portaobjetos limpios (libres de grasa) previamente marcados con los códigos de las
muestras.

2.2 Con el asa hacer el extendido, formando una capa fina sobre la lámina.

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2.3 Colectar saliva en un tubo estéril y proceder como en (2.1) y (2.2).

2.4 Dejar secar las láminas al aire o sujetarlas cerca de la llama del mechero.

2.5 Cuando el extendido está seco, con la muestra hacia arriba, pasar la lámina sobre
el mechero, teniendo cuidado que mucho calor distorsiona la forma y las estructuras
de las células bacterianas. El calor es el método más común para la fijación de las
células a la lámina. También existen algunas sustancias químicas como alcohol que
se puede usar como fijador.

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3. COLORACION SIMPLE

Se puede utilizar colorantes básicos como Azul de metileno, Cristal violeta o Carbol
fucsina, estos colorantes difieren entre sí por el grado de tinción y por el tiempo
necesario para colorear:

 Azul de metileno 30 - 60 segundos

 Cristal violeta 10 - 20 segundos
 Carbol fucsina 5 - 10 segundos

3.1. Colocar las láminas fijadas sobre el puente para colorear.

3.2. Cubre el frotis con el colorante elegido y dejar el tiempo necesario.
3.3. Lavar la lámina con agua de caño o con la piseta cuidando de no eliminar la
muestra, déjelo escurrir.
3.4. Secar las láminas con papel absorbente o dejar secar al aire libre.
3.5. Examinar las láminas al microscopio con lente de inmersión (1000x).
3.6. Hacer esquemas de lo que observa al microscopio, en relación a la forma y
coloración que han tomado las bacterias, utilizando los círculos al final de la guía.

4. COLORACION DE GRAM

La coloración de Gram es un método descrito por primera vez por el

bacteriólogo Danés Christian Gram en una publicación en 1884.

El método de coloración de Gram es el procedimiento de coloración

bacteriológico más útil, es una coloración diferencial. Este procedimiento permite la
división de las bacterias en dos grupos: gram-positivos y gram-negativos, la diferencia
entre estos dos tipos de células se basa en las diferentes reacciones químicas que
suceden a nivel de los componentes de la pared celular de las bacterias.
El método de Gram requiere de cuatro soluciones: un colorante básico, un
mordiente, un agente decolorante y un colorante de contraste.
4.1. Preparar extendidos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y un extendido
mixto de ambos cultivos
4.2. Fijar las preparaciones con calor.
4.3. Colocar las láminas fijadas sobre el puente para colorear.
4.4. Cubre el frotis con cristal violeta durante un minuto.

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4.5. Lavar la lámina con agua de caño o con la piceta cuidando de no eliminar la
muestra, déjelo escurrir.

4.6. Cubrir la preparación con solución de Lugol para Gram durante un minuto.

4.7. Lavar la lámina con agua de caño o con la piseta, déjelo escurrir.

4.8. Decolorar con alcohol-acetona ó con alcohol de 95% de 10 a 20 segundos, lave

con agua de caño o con la peseta, déjelo escurrir.

4.9. Cubra el frotis con safranina (colorante de contraste) de 20 a 30 segundos.

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4.10 Lavar la lámina con agua de caño o con la piceta y escúrralo.

4.11. Secar las láminas con papel absorbente o dejar secar al aire libre.

4.12. Examinar las láminas al microscopio, con lente de inmersión (1000x).

4.13. Hacer esquemas de lo que observa al microscopio, en relación a la forma y

coloración que han tomado las bacterias.

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5. COLORACION ACIDO RESISTENTE DE ZIEHL-NEELSEN

La coloración ácido resistente es una coloración diferencial que mide la

resistencia de las células a la decoloración por ácido, característico de Mycobacterium
y Actinomicetos lo cual está relacionado con el alto contenido de lípidos en su pared
celular.

El método de Ziehl-Neelsen requiere de calor y colorantes que tengan mucha

afinidad con las células a colorear, una solución alcohol-ácido decolorante y un
colorante de contraste.

1 Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel periódico, humedecido
con fenol al 5%.
2 En una lámina nueva y desgrasada, con un asa de siembra colocar la muestra
más representativa de esputo (partículas amarillentas, purulentas o
sanguinolentas) y luego hacer el extendido con el asa o con una bagueta de
madera (palito de chupete cortado en bisel), en un área de 2x3cm

3 Desinfectar el asa de siembra, primero sumergiéndolo en el recipiente de enjuague

para remover los restos de esputo adheridos a ella y luego esterilizarla calentando
el alambre con la llama del mechero hasta que se torne rojo.

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4 Dejar secar la preparación a temperatura ambiente, luego fijarla con calor y
colocarla sobre el puente para colorear.

a. Colorear con carbol fucsina de Ziehl luego calentar la preparación por

debajo de la lámina con el mechero hasta que se vea la salida de humo,
repetir la operación por tres veces evitando la ebullición del colorante y que
la lámina se seque.

5 Remover el colorante y lavar la lámina con agua de caño o con la peseta, escurrir
el exceso de agua.

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6 Decolorar con alcohol-ácido 10 a 30 segundos, lavar la lámina con agua de caño o
con la peseta y escurrir el exceso de agua.

7 Colorear con azul de metileno (colorante de contraste) por 30 segundos y lavar la

lámina con agua de caño o con la peseta.

8 Secar las láminas con papel absorbente, solo por el reverso, luego dejar secar al
ambiente

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9 Examinar las láminas al microscopio, con lente de inmersión.

10 Hacer esquemas de lo que observa al microscopio, en relación a la forma y

coloración que han tomado las bacterias.

Hacer la limpieza del objetivo de inmersión con PAPEL LENTE Y alcohol ó

BENCINA

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 PRACTICA 8: SUSCEPTIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS FRENTE A LOS
ANTIBIOTICOS

OBJETIVO
Demostrar la susceptibilidad de los microorganismos frente a los antibióticos utilizando
la prueba de difusión en disco de Kirby y Bauer.

INTRODUCCION
El método de disco difusión para medir la susceptibilidad de los microorganismos
frente a los antibióticos nos permite categorizar a los aislamientos bacterianos como
susceptibles, resistentes o intermedios.
Para el desarrollo de esta prueba existe en el mercado discos de papel filtro
impregnados con la cantidad específica de los agentes antimicrobianos los mismos
que serán colocados en la superficie de un agar donde previamente se habrá
sembrado la bacteria que se quiere probar.
Esta prueba ha sido estandarizada para gérmenes de crecimiento rápido. El
diámetro de la zona de inhibición está influenciada por el poder de difusión del
agente antimicrobiano a través del agar.

1. MATERIAL NECESARIO
CEPAS
 Escherichia coli ATCC 25922
 Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853
MATERIALES
 Medio de Mueller Hinton en placas
 Estándar de McFarland 0.5
 Ácido sulfúrico al 1% x 100 mL
 Hisopos con punta de algodón
 Tabla de halos de inhibición
 Placas de Petri 15 x 100 estériles
 Staphylococcus aureus ATCC
25923
 Caldo de Mueller Hinton en tubos x
3 mL
 Cloruro de Bario al 1% x 100 mL
 Pinzas de punta plana
 Discos de antibióticos
 Regla milimetrada o Vernier
 Tubos de prueba 13 x 100 estériles

2. PROCEDIMIENTO
2.1 Preparación de medios
- Prepare el Agar Mueller Hinton como lo indica el fabricante.

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 - Repartir en placas, llenar hasta conseguir 4 mm de espesor.
- Dejar enfriar.
- Controle la esterilidad colocando las placas a 37C x 18 a 24 horas
- Prepare el Caldo Mueller Hinton (Reparta 5 mL en cada tubo antes de
esterilizar)
como lo indica el fabricante.
- Controle la esterilidad colocando los tubos a 37C x 18 a 24 horas

2.2 Standard de Turbidez (Nefelometría) Escala de Mac Farland

2.2.1. Preparar una solución de cloruro de Bario 0.048 M en agua destilada
(1.175%, p/v BaCl2.2H2O)
2.2.2. Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.36 N en agua destilada (1%,
v/v).
2.2.3. Añadir las cantidades necesarias de acuerdo a la siguiente tabla
utilizando tubos limpios y secos. Los tubos deben tener el mismo
diámetro que los tubos que tengan las muestras que serán utilizadas
para determinar la turbidez.
Tubo N Cloruro de Bario Ácido Sulfúrico Cantidad Aproximada
1% 1% de bacterias
(millones/mL)
0.5 0.5 99.5 150
1 1 99 300
2 2 98 600
3 3 97 900
4 4 96 1,200
5 5 95 1,500
6 6 94 1,800
7 7 93 2,100
8 8 92 2,400
9 9 91 2,700
10 10 90 3,000

2.2.4. Sellar los tubos y etiquetarlos, colocando la fecha.

2.2.5. Se guardan a temperatura ambiente y deben ser reemplazados cada 6
meses.
2.2 Preparación de los cultivos
- Sembrar Escherichia coli ATCC 25922
- Sembrar el cultivo a probar, previamente identificado.
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 - Ambos cultivos en Caldo Mueller Hinton
- Incubar a 37C x 4 a 6 horas o hasta lograr la turbidez equivalente al tubo 05
de la escala de Mc Farland.

3. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA (Método de Bauer AW, Kirby WMM Am J Clin

Pathol 1966; 45:493-6)

3.1 Preparación del inóculo

- Con un hisopo de dacrón o con el asa de siembra y de la placa con el germen a
probar se tocan 4 ó 5 colonias morfológicamente iguales y se suspenden en el
Caldo Mueller Hinton.

- Incubar a 37ºC de 4 a 6 horas, hasta que la turbidez se aproxime o exceda al

tubo 0.5 de la escala de McFarland.

3.2 Siembra de las placas

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- Dentro de los 15 minutos próximos de haber estandarizado el inóculo, sumergir en
el tubo un hisopo estéril, remover el exceso de inóculo rotando el hisopo contra
las paredes del tubo.

- Con el hisopo, inocular la superficie total del Agar Mueller Hinton en tres
direcciones y a 60 una de otra dejar secar entre 3 a 5 minutos.

3.3. Colocación de los discos antibióticos

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 - Con la ayuda de una pinza estéril o con el dispensador, colocar los discos de
antibióticos apropiados sobre la superficie del agar ya inoculado y haciendo
ligera presión sobre los mismos asegurándonos de lograr un buen contacto con
la superficie del agar.

- Colocar las placas en la incubadora y en forma invertida e incubar por 16 a 18

horas a 37C
3.4 Lectura e interpretación de la prueba
- Mida los halos de inhibición con la ayuda de una regla milimetrada o un Vernier
sobre la placa (se debe colocar sobre el centro del disco) y sobre un fondo
oscuro.

- Interprete la zona de inhibición como: Susceptible, Intermedio o Resistente.

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Susceptible. - El microorganismo es susceptible al agente antimicrobiano a los niveles
proporcionados en sangre y tejidos con las dosis estándares de las drogas
Intermedio. - El microorganismo no es susceptible ni resistente el uso de drogas con
esta categoría no debería ser considerado a menos que se le determine la
Concentración Mínima Inhibitoria (MIC).
Resistente. - El microorganismo es resistente a las dosis terapéuticas recomendadas.
CUESTIONARIO
1. Cuál es el mecanismo de acción de los diferentes tipos de antibióticos
2. Cuáles son los mecanismos de resistencia que presentan las bacterias
3. Que es CIM y CBM.
4. Que pruebas hay para determinar la presencia de betalactamasas

RESULTADOS:
Bacteria:
Antibiótico Lectura en mm Interpretación

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 PRACTICA 9: ACCION DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE LA
VIABILIDAD DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO

Demostrar la acción de los agentes físicos y químicos sobre el crecimiento de las

bacterias.

INTRODUCCION
Los microorganismos están presentes en todo tipo de ambiente, como en el
agua, aire, suelo, alimentos contaminados, ropa y en instrumentos de todo tipo.

En la práctica médica, odontológica, o en la industria farmacéutica y alimentaria

es muy importante el control de estos microorganismos para evitar la transmisión de
infecciones en el primer caso o el deterioro de los productos en el segundo caso.

Con esta finalidad existen procedimientos físicos como la ebullición, el

autoclavado, las radiaciones y el uso de químicos.
Muchos de los agentes químicos, tanto inorgánicos como orgánicos son tóxicos para
los microorganismos.

PROCEDIMIENTO

1. MATERIAL NECESARIO

1.1 Material de vidrio

Placas de Petri 15 x 100 estériles (12 por grupo)
Tubos de prueba 13 x 100 estériles (16 por grupo)
Pipetas de 0.2 estériles

1.2 Productos químicos

Alcohol etílico al 70%
Mercurio cromo, solución al 2%
Alcohol yodado, solución al 1%
Merthiolate
Savlon, solución al 1/200: Hibitane gluconato de clorhexidina - Cetavlon
(cetrimida) 15%

1.3 Material biológico

Cultivo de Escherichia coli ATCC 25922
Cultivo de Staphylococcus aureus ATCC 25923

1.4 Medios de cultivo

TSB
TSA
1.5 Otros
Hisopos estériles
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 Discos de papel filtro (0.5 mm de diámetro) estériles
Pinzas
Asas de siembra
Plumón indeleble

2. PROCEDIMIENTO

2.1 Acción de la temperatura

- Sembrar en 5 tubos con TSB Escherichia coli
- Sembrar en 5 tubos con TSB Staphylococcus aureus
- A cada pareja de tubos (uno con E. coli y uno S. aureus) someterlos a
las siguientes temperaturas y tiempos:

#1 Control
#2 70C x 5'
#3 100C x 1'
#4 100C x 5'
#5 121C x 15'
- Incubar a 37C x 18 a 24 horas
- Leer y anotar.

2.2 Acción de pH
- Sembrar Escherichia coli
- Sembrar Staphylococcus aureus
- En 2 tubos (uno con E. coli y uno S. aureus) en TSB con diferentes pH:
#1 pH 2
#2 pH 7
#3 pH 10

- Incubar a 37C x 18 a 24 horas

- Leer y anotar los resultados.

2.3 Acción de las Radiaciones (UV)

- Sembrar por diseminación con hisopo en una placa de TSA
Escherichia coli y en otra Staphylococcus aureus.
- Dividir las placas en cuatro cuadrantes.
- Con la ayuda de una plantilla de papel aluminio, a la cual se le habrá
cortado un cuadrante IRADIAR CON LUZ ULTRAVIOLETA DE LA
SIGUIENTE MANERA:
Cuadrante 1 : Control (no irradiar)
Cuadrante 2 : a 15 cm x 10 min.
Cuadrante 3 : a 30 cm x 10 min.
Cuadrante 4 : a 60 cm x 10 min.

- Incubar a 37C x 18 a 24 horas

- Leer y anotar los resultados.

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 2.4 Acción de los Agentes Químicos
- Sembrar por diseminación con hisopo en una placa de TSA
Escherichia coli y en otra Staphylococcus aureus.
- Dejar reposar las placas ya sembradas 5 minutos.
- Colocar discos de papel filtro (previamente esterilizados) embebidos
con lo siguiente:

Alcohol etílico al 70%

Mercurio cromo, solución al 2%
Alcohol yodado, solución al 1%
Merthiolate

- Incubar a 37C x 18 a 24 horas

- Leer y anotar los resultados.

2.5 Acción de Otros Desinfectantes: Savlon 1/200

- A un tubo con desinfectante inocular 0.1 mL de Escherichia coli (cultivo
de 18 a 24 horas) con ayuda de una pipeta de 1 mL.
- Repetir lo anterior utilizando TSB en lugar del desinfectante (Control)
- Hacer siembras en Agar sangre a partir del tubo con desinfectante
como sigue:

Cuadrante 1 : luego de 5 min.

Cuadrante 2 : a los 10 min.
Cuadrante 3 : a los 20 min.
Cuadrante 4 : a los 30 min.

- Repetir del mismo modo con el tubo control.

- Incubar a 37C x 18 a 24 horas
- Leer y anotar los resultados.

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