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“Máster en Biotecnología”
“Máster en Biotecnología”
de Bacillus pumilus.
Julio de 2011
Tutora: Co-Tutor:
A mi tutora, Dra. Susana Vílchez Tornero un gracias sincero por haberme dado la
oportunidad de realizar este trabajo de investigación, gracias por el tiempo dedicado a este
proyecto y por la enseñanza y orientación brindada en la realización del mismo, sin ella,
esto no hubiese sido posible. Así mismo tengo que agradecer a mi co-Tutor, Dr. Antonio
Osuna, por sus consejos y apertura al trabajo que realizo. A los dos, mil gracias por creer en
mí y permitirme ser parte de este grupo de investigación.
A mis compañeros de laboratorio, en especial a esas personas que han sabido darme su
apoyo cuando lo he necesitado, gracias por brindarme su mano amiga y hacer que mi
estancia aquí sea más fácil. Quiero nombrar a mi grupo de trabajo: Alfonso, Juanfran, Tania
y Alejandra, gracias por compartir este proyecto, por su ayuda y sus consejos.
Las gracias mayores se las debo a mis padres, Nancy y Pepe, no tengo palabras para
decirles lo agradecida que estoy por brindarme todo su amor, por apoyar mis decisiones
(aunque eso nos cueste la distancia) y por sacrificar tantas cosas por mí. Gracias papitos por
enseñarme a luchar por lo que quiero. A mis hermanas Gaby y Josesita y mis sobrinas
Paulita y Samy, por su amor, su apoyo y su confianza. Gracias familia por ser el eje de mi
vida, por darme las fuerzas que necesito cuando he sentido flaquear y por su apoyo
constante a pesar de la distancia. Porque los siento a mi lado todos los días…
Un gracias especial a Víctor, por tener siempre las palabras adecuadas, por no soltar mi
mano y caminar junto a mí. Las cosas a tu lado son más fáciles.
Diana
i
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... I
ÍNDICE ..................................................................................................................................V
RESUMEN ............................................................................................................................. 1
ABREVIATURAS ................................................................................................................. 5
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9
1.1 Microorganismos entomopatógenos ............................................................................. 11
1.2 Bacterias entomopatógenas .......................................................................................... 13
1.2.1 El género Bacillus ................................................................................................ 14
1.2.2 Bacillus thuringiensis ........................................................................................... 15
1.2.2.1 Factores de Virulencia: Toxinas Cry y Cyt .................................................... 17
1.2.2.2 Otros factores de virulencia ........................................................................... 19
1.2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas ........................................................................ 21
1.3 Bacillus pumilus .......................................................................................................... 22
1.3.1 Biología ............................................................................................................... 22
1.3.2 Aplicaciones Biotecnológicas ............................................................................... 24
1.3.2.1 Producción de Enzimas ................................................................................. 24
1.3.2.2 Producción de Antibióticos ........................................................................... 26
1.3.2.3 Control Biológico ......................................................................................... 27
1.3.2.3.1 Control de Hongos y Bacterias en plantas .............................................. 27
1.3.2.3.2 Control de Insectos ................................................................................ 30
1.3.2.4 Otras Aplicaciones ........................................................................................ 32
1.4 Bacillus pumilus 15.1................................................................................................... 32
2. OBJETIVOS................................................................................................................... 37
4. RESULTADOS ............................................................................................................... 63
4.1 Perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1 ..................................................................... 65
4.1.1 Perfil proteico de un cultivo vegetativo ................................................................. 66
4.1.2 Perfil proteico de un cultivo esporulado ................................................................ 67
4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa............................................. 70
4.3 Observación de B. pumilus 15.1 mediante microscopía ................................................. 79
4.4 Análisis de las fracciones de un cultivo de B. pumilus 15.1 mediante Inmunoblot .......... 85
4.5 Solubilización de proteínas........................................................................................... 88
4.6 Identificación de proteínas mediante análisis de huella peptídica o finger printing. ........ 92
4.7 Actividad de las proteínas aisladas en los gradientes de sacarosa frente larvas de C.
capitata ............................................................................................................................. 95
5. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 99
1
2
3
4
ABREVIATURAS
5
kDa Kilo Daltons
L Litro
M Concentración molar
mA Mili amperios
mg Mili gramos
mL Mili litros
mm Mili metros
mM Mili Molar
MS - MS Método de fragmentación de péptidos en espectrometría de masas
PBS Tampón Fosfato salino
pH Potencial de Hidrógeno
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
ARNasa Ribonucleasa
rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecilsultafo sódico
TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilenodiamina
UFC Unidades formadoras de colonias
V Voltios
Vh Voltaje de hall
W Watt o Vatio
xg Fuerza relativa de centrifugación, del inglés Relative Centrifugal
Force (RCF)
6
7
8
1. INTRODUCCIÓN
9
10
Introducción
Los insectos son el grupo más diverso de animales sobre la tierra, con más de
un millón de especies descritas, y cuya diversidad y adaptación a los
ambientes los han convertido en hospederos o fuente de alimento de muchos
parásitos (Bode 2009). Los microorganismos entomopatógenos son
microorganismos parasíticos que causan la muerte al insecto huésped y
posteriormente son dispersados por el agua, viento u otros insectos (Nicholls-
Estrada 2008). Representan una alternativa sostenible de control a largo plazo
comparados con los productos químicos cuyo espectro de especificidad es
muy bajo y por lo general son de larga acción residual.
11
Tabla 1.1 Principales microorganismos entomopatógenos desarrollados y utilizados
como agente de control biológico.
Baculovirus
Larvas de lepidópteros, larvas de
Virus de la poliedrosis nuclear
Hymenoptera (Tenthredinidae)
Virus de la granulosis Larvas de lepidópteros
Virus Virus no ocluido (Oryctes) Larvas de Scarabaeidae
Virus de la poliedrosis citoplásmica Larvas de lepidópteros
Entomopoxvirus Orthoptera, larvas de Scarabaeidae
Inidovirus Mosquitos
Bacillus popilliae Larvas de Scarabaeidae
Bt. var. thuringiensis Larvas de lepidópteros
Bacterias
Bt. var. israelensis Larvas de mosquitos y otros dípteros
Bacillus sphaericus Larvas de coleópteros y mosquitos
Mastigomycotina
Coelomomyces spp. Larvas de mosquito
Lagenidium giganteum Larvas de mosquito
Zygomycotina
Áfidos, larvas de lepidópteros,
Entomophthoraceous
coleópteros, Orthoptera
Deuteromycotina
Hongos Larvas de coleópteros, lepidópteros,
Beauveria bassiana
Orthoptera
Larvas de coleópteros, cicadélidos,
Metarhizium anisopliae
cercopidos, cucarachas
Verticillium lecanii Áfidos, moscas blancas
Microsporidia
Orthoptera, larva de mosquito,
Nosema spp.
coleoptera
Vairimorpha necatrix Larvas de lepidopteros
Mermithidae Larvas de mosquito
Nematodos Steinernematidae y Larvas de lepidópteros, larvas de
Heterorhabditidae coleópteros y Gryllotalpidae
12
Introducción
13
industrialmente para la producción masiva y la aplicación en el campo como
insecticida microbiológico (van Emden and Service 2004).
14
Introducción
16
Introducción
A B C
F
D E F
El grupo de las δ-endotoxina está compuesto por dos grupos de proteínas que
no presentan homología de secuencia ni de estructura terciaria entre sí: las
proteínas Cry (del inglés “Crystal”) y las proteínas Cyt (del inglés
“Cytolitic”). Hasta la fecha se han clonado y secuenciado 572 genes cry
diferentes y 35 genes cyt (Crickmore et al. 2011).
Las toxinas Cry una vez activadas, se unen por su extremo C-terminal a una
caderina en el extremo apical de la membrana de las células epiteliales del
intestino, se produce una escisión de 28 residuos aminoacídicos del extremo
N-terminal y se establece una forma pre-poro, que incrementa su afinidad por
un receptor secundario que puede ser aminopeptidasa N o fosfatasa alcalina.
Esta última unión facilita la formación del poro en el epitelio intestinal,
provocando un desequilibrio osmótico y la posterior lisis celular (Bravo et al.
2004).
20
Introducción
21
Todas estas características, hacen de los productos basados en las toxinas de
Bt sean una herramienta útil, ventajosa y muy aplicable para el control de
plagas y vectores de enfermedades.
1.3.1 Biología
Bacillus pumilus fue descrita por primera vez por Meyer y Gottheil en 1901.
Es conocida también por los nombres de Bacillus aminoglucosidicus o
Bacillus mesentericus. Taxonómicamente pertenece al dominio Bacteria, filo
Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género
Bacillus (Skerman et al. 1989).
22
Introducción
24
Introducción
Las proteasas alcalinas de B. pumilus han sido descritas para las siguientes
aplicaciones: inactivación de ARNasas durante la purificación de ARN de
células homogenizadas, coagulación de la leche de soja, limpieza de
membranas de ultrafiltración, depilación del cuero, producción de
hidrolizados de zeína, formulación de detergentes con subtilisina y otras
proteasas (Jaouadi et al. 2008).
Las proteasa de B. pumilus destacan por ser más eficientes que las de otras
bacterias, por ejemplo, se ha descrito que la proteasa alcalina de B. pumilus
CBS presenta mejor eficacia catalítica que la subtilisina, además mayor
estabilidad al pH, temperatura y desnaturalizantes químicos (Jaouadi et al.
2008); mayor eficiencia en la depilación de cuero (Wang et al. 2007);
keratinasa mas estable para la degradación de pelo de bovinos (Kumar et al.
2008); y colagenasa con alta especificidad (Wu et al. 2010).
Otra de las enzimas producidas por esta bacteria son las xilanasas,
ampliamente utilizadas en las industrias para blanquear la pulpa artesanal,
aumentar el brillo del papel, mejorar la digestibilidad de los piensos, aclarar
los zumos y procesar el alimento animal (Xu and Tao 2005; Kapoor and
Kuhad 2007).
26
Introducción
27
con las mismas características es B. pumilus T4, que induce resistencia en
Arabidopsis frente a Pseudomona syringae (Ryu et al. 2003).
28
Introducción
Cepa de
Planta Enfermedad Patógeno
Bacillus pumilus
Cronartium quercuum,
INR7, SE34, Pino de
Roya fusiforme Miyabe exsirai f. sp.
SE39, SE52 incienso
Fusiforme
29
Tabla 1.3 Productos comerciales para control biológico en plantas basadas en B.
pumilus
Marca / nombre
Cepa de B. pumilus Patógeno / enfermedad
del Producto
GB34 Biological
GB34 Rhizoctonia y Fusarium
Fungicide
30
Introducción
31
Nuestro grupo de investigación, publicó el aislamiento y caracterización
mediante comparación de secuencias parciales del gen 16S ARNr, de una
cepa de B. pumilus entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del
Mediterráneo (Ceratitis capitata). La cepa B. pumilus 15.1 presentó rangos
de mortalidad del 68 al 94% en larvas de C. capitata, dependiendo de las
condiciones bajo las cuales se realizan los bioensayos (Molina et al. 2010).
33
otras especies de Bacillus. La endospora mide 1 µm en su eje mayor y 0.5 µm
en su eje menor.
34
35
36
2. OBJETIVOS
37
38
Objetivos
39
40
41
42
3. MATERIALES Y MÉTODOS
43
44
Materiales y Métodos
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, junto con sus genotipos o
características más relevantes se recogen en la Tabla 3.1
Sin publicar:
Proporcionado por
15.1 Cepa curada de elementos
Bacillus pumilus J.F. Caña-Roca (de
Curado extracromosómicos
nuestro grupo de
investigación)
Dr. Calvo,
Cepa degradadora de
M1 Universidad de
compuestos aromáticos
Granada
45
3.1.2 Medios de cultivo
También se utilizo el medio TSB (Tryptic Soy Broth) (Scharlau), usando las
cantidades indicadas por la casa comercial (30 g por litro de agua destilada).
46
Materiales y Métodos
47
sales del medio. Tras la diálisis las muestras estuvieron a una concentración
aproximada de 20x.
48
Materiales y Métodos
Para comprobar que la lisis celular fue exitosa, se realizó la siembra en placa
de diluciones seriadas de distintos puntos del lisado.
50
Materiales y Métodos
3.2.4 Microscopía
51
3.2.4.2 Microscopía electrónica de transmisión
3.2.5 Inmunoblots
53
Cardiff) a una dilución 1:2000. Como anticuerpo secundario se utilizó IgG-
Fab de cabra anti–conejo conjugada con la peroxidasa de rábano HRP
(Dakor) a una dilución 1:1000. La membrana se reveló con Sustrato
Peroxidasa, cuya composición ha sido anteriormente detallada.
54
Materiales y Métodos
TRATAMIENTOS
Coctel inhibidor
pH Tampón PMSF 1 mM
de proteasa 1x
3 NaHCO3 50 mM
6 NaHCO3 50 mM
9 Na2CO3 50 mM
12 Na2CO3 50 mM
KCl 50 mM
1
HCl 134 mM
KCl 50 mM
2
HCl 13 mM
CH3COOH 98 mM
3
CH3COONa*3H2O 1.77 mM
CH3COOH 84.7 mM
4
CH3COONa*3H2O 15.4 mM
Na2HPO4 95.5 mM
9 X X
HCl 4.5 mM
Na2HPO4 96.6 mM
10 X X
NaOH 3.36 mM
Na2HPO4 96.53 mM
11 X X
NaOH 3.47 mM
KCl 50 Mm
12 X X
NaOH 12 mM
KCl 50 Mm
13 X X
NaOH 132 mM
55
3.2.7 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF
Bajo las mismas condiciones una de las bandas fue analizada por el Servicio
de Proteómica del CBMSO, Madrid, el cual pertenece al Instituto Nacional
de Proteómica, ProteoRed.
Para los ensayos realizados con larvas de Ceratitis capitata se contó con la
cría continua de una colonia en el laboratorio. La colonia fue establecida a
partir de una colonia mantenida en el Centro de Ecología Química Agrícola
(CEQA) de la Universidad Politécnica de Valencia, amablemente
proporcionada por el Dr. Navarro Llopis.
56
Materiales y Métodos
Las moscas adultas fueron alimentadas con dieta artificial compuesta por
Autolisado de Levadura y Sacarosa, en relación de 1:4 (p/p), y se les
suministró agua a través de una esponja amarilla húmeda. La pared frontal de
las cajas estaba provista de una tela para simular la piel de las frutas, y ahí las
moscas depositen los huevos para ser recogidos en contenedores de plástico
con agua destilada.
Estos huevos fueron recogidos y colocados sobre una dieta artificial para
larvas compuesta por 200 g de Salvado de Trigo, 50 g de Sacarosa, 25 g de
Levadura de Cerveza, 2 g de Nipagin (Metil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 2 g
de Nipasol (Propil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 7.5 mL de HCl 37% y 500 mL
de agua destilada. Esta cantidad de dieta fue suficiente para alimentar las
larvas procedentes de 0.5 mL de huevos de C. capitata, las cuales fueron
colocadas en un ambiente de temperatura constante a 25 °C.
57
3.2.8.2 Bioensayos con larvas
58
Materiales y Métodos
59
60
61
62
4. RESULTADOS
63
64
Resultados
65
En este trabajo se utilizó Azul de Coomassie, comúnmente usado por su bajo
costo, fácil visualización, mejor cuantificación y su compatibilidad con
ensayos de espectrometría de masas (Westermeier 2006). Con esta técnica se
visualizaron los perfiles proteicos de la cepa B. pumilus 15.1 a diferentes
tiempos de incubación.
66
Resultados
En la Figura 4.1 se puede observar que las proteínas no se degradan con este
proceso.
T3 TSB
kDa
M 1 2 3 1 2 3
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.1 SDS-PAGE al 12% de B. pumilus 15.1 en estado vegetativo crecido en medio
T3 y TSB. El carril 1 corresponde al sedimento del cultivo (10x), el carril 2 al sedimento
después del tratamiento con lisozima (10x) y el carril 3 al sedimento después de la lisis
mecánica (100x).
kDa
M 1 2
250
150
100
75
50
37
25
20
15
68
Resultados
kDa M 1 M 2 M 3
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.3 SDS-PAGE al 12% del sedimento de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el
tratamiento A (carril 1), B (carril 2) y de un cultivo de la cepa M1 con el tratamiento B
(carril 3).
69
4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa
M 1 2 3 4 5
kDa
50
37
30
25
70
Resultados
La Figura 4.4 muestra que ninguna proteína fue retenida en las fases del
gradiente de sacarosa, posiblemente porque no existe síntesis importante de
proteínas insolubles en este estado celular. Todas las células sintetizadas que
se observan en el carril 1 forman parte constituyente de la célula y son
arrastradas con ellas hacia el sedimento.
A B
1
2
Figura 4.5 Resultado del gradiente discontinuo de sacarosa, en donde se muestran las
fases (2, 4 y 6), las interfases (1, 3 y 5) y el sedimento formado (7) de un cultivo de B.
pumilus 15.1 con el tratamiento A y B respectivamente.
71
Cada una de estas fracciones, después de ser lavadas y resuspendidas a una
concentración 500x, fueron analizadas mediante electroforesis SDS-PAGE.
Para mejor visualización de las proteínas retenidas en cada fracción, el
análisis se realizó en geles con distinta concentración de poliacrilamida, al
7.5% (Figura 4.6), 12% (Figura 4.7) y 15% (Figura 4.8). En todos los geles
destaca la presencia de dos bandas de tamaños moleculares de ~ 45 kDa y
~17 kDa por la mayor intensidad que presentan en relación al resto de
bandas. El hecho de que las proteínas de 45 y 17 kDa no estén presentes en la
fracción pellet (carril 7), donde se encuentra la mayoría de las proteínas
celulares, indica que dichas proteínas han sido excretadas por la bacteria
durante el proceso de esporulación y que son insolubles, posiblemente porque
sean cuerpos de inclusión.
72
Resultados
A
M 0 1 2 3 4 5 6 7
kDa
250
150
100
75
50
37
B
M 0 1 2 3 4 5 6 7
kDa
250
150
100
75
50
37
73
A
kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
150
100
75
50
37
25
20
15
B
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
150
100
75
50
37
25
20
15
74
Resultados
A
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
75
50
37
25
20
15
10
B
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
75
50
37
25
20
15
10
76
Resultados
12%
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
150
100
75
50
37
25
20
15
15%
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
75
50
37
25
20
15
10
77
pumilus M1. Una observación que se puedo hacer en el transcurso de la
realización del gradiente fue que tras la centrifugación bajo las mismas
condiciones que las usadas con la cepa B. pumilus 15.1, no hubo formación
de sedimento. La muestra no entró ni siquiera en la fracción más concentrada
de la sacarosa, la fracción de 2.3 M de sacarosa. Aún así, se recogieron las
fracciones y se analizaron en un gel de poliacrilamida. Como se observa en la
Figura 4.10, todas las fracciones (2, 3, 4 y 5) presentaron el mismo perfil
proteico, sin haber a penas proteínas en las fracciones 6 y 7.
kDa
M 0 1 2 3 4 5 6 7
250
150
100
75
50
37
25
20
15
En principio cabe pensar que el hecho de que todas las fracciones tengan el
mismo perfil indica que B. pumilus M1 no excreta proteínas insolubles como
lo hace B. pumilus 15.1, aunque para finalmente concluir esto haría falta
optimizar las condiciones del gradiente en cuanto a concentración de las
fracciones y las condiciones de la centrifugación.
78
Resultados
79
a b
c d
Según las bases de la técnica de tinción empleada solo los cristales se tiñen
completamente, presentándose como cuerpos teñidos de azul obscuro
(Ammons et al. 2002), mientras que las esporas presentan un color azul más
claro. La definición de estas manchas no es clara, no se distinguen formas y
son de tamaño similar a las esporas. Hay predominancia de este tipo de
manchas en las fracciones 4 y 5 del gradiente de sacarosa.
80
Resultados
81
A
Figura 4.12 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A (A)
y B (B), las fechas blancas señalan las estructuras paraesporales cristalinas fuera de las
células.
82
Resultados
a b
Figura 4.13 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 curado. Las flechas
blancas señalan los cristales paraesporales (a). La imagen ampliada muestra la
diversidad de formas de estos cristales (b).
b c
Figura 4.14 Detalle de los cuerpos paraesporales producidos por B. pumilus 15.1. (a)
muestra la estructura cristalina dentro de la célula. (b y c) muestra los detalles de las
inclusiones cristalinas en donde se aprecia un patrón de cuadriculas en el cristal.
84
Resultados
85
Figura 4.15 Inmunoblot realizado utilizando antiCry1Aa como anticuerpo frente a las
muestras de B. pumilus 15.1 resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A
y B. El carril C+ muestra el control positivo para el anticuerpo utilizado. Las flechas
indican los carriles en donde se alguna señal.
Tanto las muestras del cultivo antes del gradiente (carril 0), como el
sedimento resultante del gradiente (carril 7) mostraron un rastro coloreado sin
ninguna banda definida (Figura 4.15).
86
Resultados
M 0 1 2 3 5 7 C+ M
225 225
150 150
102 102
76 76
52 52
38 38
31 31
24 24
17 17
Figura 4.16 Inmunoblot realizado utilizando Cry1Aa como anticuerpo frente a una
muestra de B. pumilus 15.1. Se analizan el cultivo antes del gradiente (carril 0) y cinco
de las fracciones resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A (carriles 1,
2, 3, 5 y 7). El carril C+ es el control positivo para el anticuerpo utilizado.
87
En la Figura 4.16 se muestra el resultado del imnumoblot realizado. Se pudo
observar la existencia de varias bandas tenues de ~17 kDa de tamaño en los
carriles 0 y 3, una banda de ~50 kDa en el carril 0, y una banda de ~31 kDa
en el carril 7. Las bandas de ~17 kDa correspondieron a una de las bandas de
mayor intensidad en los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie Blue, las
bandas de ~50 y 31 kDa son poco intensas en estos geles (Figura 4.7, A).
Debido a la similitud observada entre los cristales producidos por esta cepa y
los cristales de δ-endotoxinas de B. thuringiensis intentó realizar una
solubilización in vitro de la misma forma que se realiza en las inclusiones de
B. thuringiensis (Li et al. 2004).
88
Resultados
P S 3P 3S 6P 6S 9P 9S 12P 12S
17 kDa
P S 3P 3S 6P 6S 9P 9S 12P 12S
42 kDa
89
Para estrechar el rango de solubilización óptimo para la proteína de 17 kDa,
se realizó un ensayo de solubilización a pHs 1, 2, 3 y 4. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 4.18.
kDa kDa M 3P 3S 4P 4S
M F2 CP CS 1P 1S 2P 2S
200 200
75 75
50 50
37 37
25 25
20 20
15 15
10 10
90
Resultados
kDa kDa
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S
200 200
75 75
50 50
37 37
25 25
20 20 A
15 15
10 10
kDa kDa
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S
200 200
75 75
50 50
37 37
25 25 B
20 20
15
15
10
10
kDa kDa
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S
200 200
75 75
50 50
37 37
25 25
20 20
C
15 15
10 10
91
Los esfuerzos para inhibir la acción de las proteasas no consiguieron mejorar
el resultado, obteniéndose una proteína mucho menos intensa en todos los
sobrenadantes de todas las condiciones. Es interesante el resultado que se
observó en la solubilización realizada a pH 13, ya que fue la única muestra en
donde toda la proteína se solubilizó eliminándose por completo de la fracción
del sedimento (Figura 4.19).
Algunas de las proteínas resueltas por SDS-PAGE fueron extraídas del gel
para ser enviadas a al servicio de identificación por espectrometría tal y
como se explica en el apartado 3.2.7 de Materiales y Métodos. Las bandas
analizadas se muestran en la Figura 4.20.
92
Resultados
M 1
M GA.6 GA.3 GA.1
250
250 250
150
150 100
100 75
75 60
50
37
50
45
37
25
20
37
25 17
15
20
Tabla 4.1 Resultados de las búsquedas en base de datos utilizando el programa Mascot
a partir de los espectros obtenidos por el análisis de MALDI TOF/TOF de proteínas de
B. pumilus 15.1
Predicción
Muestra Proteína
peso Especie Descripción MS SC
kDa (nr. NCBI)
Da
B. pumilus
37 ---- 157691932 Flagelina 89* 35.4
SAFR-032
B. pumilus
45 43580 194017930 ATCC Oxalato descarboxilasa 275* 19
7061
Proteína A de la
B. pumilus
60 58882 157691334 cubierta externa de la 191* 34
SAFR-032
espora
B. pumilus
Repetición de
250 81260 194015823 ATCC 228* 9
colágeno triple hélice
7061
nr. NCBI: Número de referencia en el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología.
MS: Mascot Score, se calcula como MS = -10*log(P); donde P es la probabilidad de que la
identificación se produzca por azar. Es un indicador de la calidad de la identificación; un
valor por debajo de 83 (NCBIn) es considerado no significativo; (*) indica resultados
significativos.
SC: Sequence coverage, porcentaje de veces que un segmento de proteínas está representado
en la secuencia proteica de la base de datos.
94
Resultados
95
Bioensayo
100
90
80
% de mortalidad
70
60 4 Dias
50 10 Dias
40
30
20
10
0
Control GA. 1 GA.5 GC.2 GC.5
96
97
98
5. DISCUSIÓN
99
100
Discusión
101
las concentraciones de sacarosa empleadas (ver Figura 4.4), lo cual nos hace
pensar que las proteínas sintetizadas por la cepa en este punto forman parte
constituyente de las células y por eso son arrastradas con ellas al sedimento.
El perfil proteico de la cepa 15.1 una vez esporulada, fue analizado con el
tratamiento A y B para comparar las diferencias a nivel proteico que pueden
suceder en el periodo de incubación a 4 °C durante 96 horas (tratamiento A),
ya que es bajo estas condiciones donde se revela la toxicidad de la cepa
(Molina et al. 2010). Los resultados de estos ensayos indicaron que tanto la
fracción sobrenadante como el sedimento presentan perfiles proteicos
similares en los dos tratamientos. Al realizar el gradiente de sacarosa con el
sedimento, se logró la separación de diferentes proteínas en las fracciones de
sacarosa, destacando proteínas de 17 kDa y 45 kDa por su mayor intensidad.
103
Con la obtención de estos resultados barajamos la posibilidad de que el
agente tóxico de la cepa 15.1 sea una proteína similar a las δ-endotoxinas. El
espectro de toxicidad de algunas δ-endotoxinas puede ser más amplio de lo
comúnmente establecido, por ejemplo la toxina Cry1 usualmente activa
frente a lepidópteros es moderadamente tóxica para algunas especies de
dípteros (Hodgman et al. 1993).
El tamaño de estas bandas no concuerda con las bandas esperadas para las
proteínas Cry1, que tienen un peso molecular aproximado a 130 kDa
(Soberon and Bravo 2009). Esto nos hace pensar que puede ser una δ-
endotoxina nueva. También se sabe que las protoxinas de Cry1Aa y Cry1Ab
(133 kDa) al ser sometidas a proteólisis in vitro producen hasta 7 proteínas
intermediarias, hasta dar lugar a la toxina activada (57 kDa) (Mohan and
Gujar 2003). Este ejemplo nos hace creer que dado que ni el cultivo ni el
sedimento tiene ningún inhibidor de proteasas, las bandas observadas en los
104
Discusión
106
107
108
6. CONCLUSIONES
109
110
Conclusiones
111
112
113
114
7. TRABAJO FUTURO
115
116
Trabajo futuro
Es necesario analizar en detalle los cristales producidos por esta cepa, para
esto, se recomienda analizar todas las fracciones de los gradientes de
sacarosa, para ver si esta técnica es capaz de retener esos cristales en alguna
de las fracciones y de esta manera enviar a secuenciar las proteínas que se
evidencien en esa fracción.
117
118
119
120
8. BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
141
Anexos
Proteína de 37 kDa
143
Proteína de 17 kDa
Proteína de 45 kDa
145
Proteína de 60 kDa
147