15/Julio/2014

Análisis Instrumental:
Electroforesis en Gel de poliacrilamida, en gel de agarosa
y diferencia entre éstas dos.
Profesor: Julio Armando Alpuche Pérez
Carrera: Ingeniería en Biotecnología Grupo: 3ª
Integrantes:
• Diana Lizbeth Buenfil León
• Nayla Berenice Muñoz Euan
• Miguel Ángel Dzib Miss
• Daniela Pérez Yáñez
• Geovanni Edimir Hernández García
• Roberto Carlos Ventura Vázquez
• Jessica Sharlin Landeros Juárez
• Abraham Gustavo Yam Colli
• Ricardo José Lara Castellanos
Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE,
PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis en inglés)
técnica más ampliamente
utilizada para separar
moléculas biológicas
especialmente ADN, ARN
y proteínas.
Es un método conveniente,
rápido y económico a nivel de
muestra, pues se requieren
sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína.
 La poliacrilamida es un
soporte empleado
frecuentemente en
electroforesis en gel, es
químicamente inerte, de
propiedades uniformes,
capaz de ser preparado
de forma rápida y
reproducible.
 Ventajas
 Son químicamente inertes,
transparentes y estables en
un amplio rango de pHs,
temperatura y fuerza iónica.
 Para el estudio de ácidos
nucleicos, el gel de
poliacrilamida se suele
emplear en situaciones donde
se dispone de fragmentos de
bajo tamaño molecular (de
menos de 1000 pares de
bases).
 En la tecnica de SDS-PAGE,
se mezclan las
proteínas con el detergente
aniónico SDS para formar
complejos desnaturalizados,
cargados negativamente.
 La electroforesis en geles de acrilamida se puede
realizar empleando sistemas de uno o más
tampones, en estos casos se habla de sistemas
tampón continuos o discontinuos. En los sistemas
discontinuos el primer tampón asegura la migración
de todas las proteínas en el frente de migración,
provocándose la acumulación de todas las que se
han cargado en el pocillo. La separación realmente
comienza a partir del momento en el que el frente
de migración alcanza la frontera del segundo
tampón.
¿Qué es la agarosa?
es un agente fuertemente gelificante, neutral, no
iónico considerado como un polímero lineal cuya
unidad básica es un disacárido.

La agarosa es usada para aplicaciones de

electroforesis conocida como electroforesis en gel
del agarosa.
La electroforesis en gel es un método que se
emplea para separar macromoléculas en función
del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades
físicas.
La electroforesis en gel de agarosa es un método
normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN.
• La electroforesis en gel de agarosa es de las más
utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleícos
de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar
moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.

• El DNA aislado se puede analizar

mediante electroforesis en gel de agarosa.
 Tampón de electroforesis

• La movilidad electroforética del ADN se ve

afectada por la composición y la fuerza iónica
del tampón de electroforesis.
• En ausencia de iones, la conductancia eléctrica
es mínima y el ADN migra lentamente o ni
siquiera se desplaza.
 Concentración de agarosa

• En función de la concentración de agarosa o

tampón, se pueden separar segmentos de
ADN que contengan de 20 a 50 000 pb.
• En los geles horizontales, la agarosa se emplea
por lo general en concentraciones
comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %.
 ADN marcador

• Para una tensión, un gel de agarosa y unas

concentraciones de tampón determinadas, la
distancia de migración depende del peso
molecular del material inicial.
• Así pues, debe cargarse un ADN marcador de
tamaño conocido en las ranuras situadas en
los extremos derecho e izquierdo del gel.
 Tampón de carga

• Las muestras de ADN que deben cargarse en

el gel de agarosa se mezclan en primer lugar
con un tampón de carga que por lo general
contiene agua, sacarosa y un colorante (por
ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol,
verde de bromocresol, etc.).
• La cantidad máxima de ADN que puede
cargarse depende del número de fragmentos.
Soporte: (restrictivo) :Poliacrilamida

* Polimerización de dos componentes:

Acrilamida + Bisacrilamida

* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro

Electroforesis vertical
Ventajas:

* Gran poder de separación(resolución) por CARGA y por

TAMAÑO.
* Químicamente inertes.
* Transparentes (densitograma).
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura).
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.
 Aplicaciones:

 Separar proteínas
 Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
 Separar proteínas oligoméricas

 Separar proteínas en función de su pI Electroenfoque

 Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2D

 Ver si hay una proteína en concreto Western Blot

Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)

Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)

Separación por TAMAÑO

Densidad de carga igual para todas las

moléculas por los grupos PO4-
 Aplicaciones:

 Separar, identificar y purificar fragmentos de

Geles de agarosa
DNA o RNA.
 Determinar tamaño de un fragmento de DNA.

 Separación de cromosomas enteros

Geles poliacrilamida
 Secuenciación de DNA.

 Identificación de regiones de unión a proteínas.

Southern Blot
 Detectar la presencia de un gen (o secuencia
específica de DNA) en una muestra.

 Determinar si se expresa un gen específico Northern Blot

Soporte: (restrictivo) Agarosa
Electroforesis horizontal
muestra (-)

+ -

Campo eléctrico (DV)

1. Preparar el gel.
2. Aplicación de la muestra.
3. Electroforesis.
4. Detección por tinción con
Bromuro de Etidio (BrEt): se
intercala en el DNA y al irradiarlo
con luz UV emite fluorescencia.
 * Interacción DNA-DNA (complementación).
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA específica (muy
4. Revelado
sensible).
* Detectar la presencia de un gen, etc. DNA
1. Electroforesis en geles de agarosa interés
32P e-
2. Transferencia a membrana
moléculas
moléculas de DNA
de DNA
5. Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA 32P

…TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés

Todas los DNA

DNA de interés
* Interacción RNA-DNA (hibridación).
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA específica (muy sensible)
4. Revelado
* Expresión génica.
1. Electroforesis en geles de agarosa RNA
interés
2. Transferencia a membrana 32P e-
moléculas
moléculas de RNA
de RNA
Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
3. Hibridación con la sonda radioactiva

Sonda
de DNA 32P

…TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés

Todas los RNA

DNA de interés
Marcadores de peso
molecular:

* Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de las que
conocemos el peso molecular.

* Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
- El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la
electroforesis en geles de agarosa.
-Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras
un marcador molecular estándar.
- El marcador molecular estándar posee de 5 a 10 fragmentos de
DNA a los cuales se le conoce el peso molecular.
- Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular
de las moléculas y la distancia recorrida en el gel.
-Esta relación permite crear una curva estándar de la distancia
de migración versus el log10 del peso molecular de los
fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular
estándar.
-Esta curva estándar es utilizada para extrapolar el peso
molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.
Para crear la curva estándar es necesario:

1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del

marcador hasta cada una de las bandas observadas en el
marcador. Se repite lo mismo con los fragmentos de DNA en
estudio.

2) Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos

de DNA que se encuentran en el marcador estándar y trazar en
el eje de Y utilizando papel de gráfica regular.

3) Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la

gráfica se observa una línea.

4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar

a la línea para determinar el peso molecular.
Preparación del gel de agarosa al 1%

1. Pese 0.5 g de agarosa y colóquelos en un matraz de 200

ml. Añada 50 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X).
2. Cubra el matraz con un pedazo de papel de aluminio para
evitar la evaporación del amortiguador.
3. Coloque el matraz en una hornilla y caliente hasta que
toda la agarosa se haya disuelto.
4. Remueva el matraz de la hornilla y déjelo enfriar hasta 65
ºC. Añada 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).
5. Vierta la agarosa sobre la caja de electroforesis. Permita
que se solidifique.
 Sellar molde para la gel con cinta adhesiva
 Asegurarse que este bien bien sellada
 Disolver 0.8 g de agarosa en 100ml de TBE
 Derretir en microondas con incubaciones de
30 segundos hasta que hierva y no se vean
partículas flotando
 Dejarla bajar a 55C-60C y servirla en el molde
sellado, colocar peinilla remover burbujas*
 * Añadir 1-2µl de EtBr (opcional)
 Dejar solidificar por 10 –15 min, la gel se vera
opaca
 Colocar la gel en la camara vaciá
 Añadir buffer de corrida TBE hasta cubrir los
pozos completamente
 Remover la peinilla
 Servir las muestras en un orden
predeterminado
Preparación de la Muestra

6. Coloque 15 µl de la muestra de DNA cortado con las

endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl.
Añada 5 µl de amortiguador de la muestra (“loading buffer”).

7. Coloque 15 µl de la muestra del DNA sin cortar con las

endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl.
Añada 5 µl de amortiguador de la muestra.

8. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las
muestras en el gel.
9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis.

10. Añada el amortiguador de la corrida (“running buffer”) al

tanque de electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel
completamente.

11. Utilizando una pipetta de 1-10 µl, añada 5 µl del marcador

molecular estándar a la primera fosa del gel.

12. Utilizando una pipetta de 10-100 µl, añada los 20 µl de la

muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción
(preparada en la parte anterior) a la segunda fosa del ge.
13.Coloque los 20 µl de la muestra de DNA sin cortar con las
endonucleasas de restricción (preparada en la parte anterior) a la
tercera fosa del gel.

14.Continué con el paso 4 y 5 para cada grupo de trabajo.

15.Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conéctela a la caja

de electricidad. Verifique que los polos estén correctamente
conectados.

16.Corra la electroforesis a 80 V por 1 hora.

 Conectar el power supply 50-100 V y correr la
gel por 45-75 minutos
 Remover la gel y observarla en lampara de luz
UV
 Fotografiar y medir distancia en la gel
 Preparar gráfica de distancia vs log10 del
peso molecular (o bp)
17.Luego de la hora apague la caja de electricidad.

18. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado colóquelo

sobre la lámpara de luz ultravioleta.

19. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las
diferentes bandas observadas.