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Bioquímica Geral C

Trabalho nº 2

SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS BIOLÓGICOS POR CROMATOGRAFIA

A. CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL


A1. Introdução
O método de filtração em gel, baseado no efeito de peneira molecular, é um
método usado para a separação de substâncias de acordo com o tamanho e
forma moleculares. Estas peneiras moleculares são redes porosas
tridimensionais, constituídas por cadeias lineares de polímeros que se
entrecruzam e formam a matriz do gel. Os géis mais usados são os obtidos
pela polimerização de cadeias de polisacáridos (Sephadex) ou os constituídos
pela polimerização de cadeias de poliacrilamida (Biogel). Quando estas
peneiras moleculares se colocam em água, incham e formam o gel. As
partículas que formam o gel têm poros e o tamanho dos poros é função do
grau de entrecruzamento das cadeias de polímeros. A possibilidade de variar
o tamanho do poro torna este método útil para a separação de diferentes
substâncias e a sua utilização na determinação dos pesos moleculares das
mesmas.
A facilidade de uma molécula de soluto penetrar na rede do gel é função do
seu tamanho e forma molecular. Quando as moléculas são demasiado
grandes para penetrar na matriz do gel, elas passam somente no volume de
líquido fora do leito (Vo). Quando as moléculas são suficientemente pequenas
elas podem penetrar em quase todo o volume interior do leito (Vi). Se o
volume das partículas de gel for (Vg) então o volume total (Vt) do leito será:

Vt = Vo + Vi + Vg

Se for colocada uma mistura de macromoléculas na parte superior de uma


coluna cheia de gel, e se se deitar tampão para provocar a sua eluição, as
moléculas começarão a sair da coluna com o tampão em fracções diferentes e
por ordem decrescente do seu tamanho molecular. A filtração em gel é pois
uma técnica muito usada na separação de misturas de macromoléculas de
pesos moleculares diferentes e especialmente utilizada no isolamento e
purificação de proteínas.

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TABELA 1. ALGUNS TIPOS DE SEPHADEX E RESPECTIVOS LIMITES


DE EXCLUSÃO

Tipo de Sephadex Peso Molecular

Limite Inferior Limite Superior

G-10 – 700
G-15 – 1500
G-25 1000 5000
G-50 1500 30000
G-75 3000 70000
G-100 4000 150000
G-150 5000 400000
G-200 5000 800000

Comercialmente encontram-se preparações de géis com vários tamanhos de


poro permitindo separar macromoléculas de diferentes pesos moleculares. A
tabela 1 indica vários tipos de Sephadex utilizados na separação de proteínas.
Por exemplo, o Sephadex G-25 tem poros relativamente pequenos e exclui
moléculas de pesos moleculares (PM) superiores a 5000. É um gel útil na
separação de moléculas de PM compreendidos entre 1000 e 5000. O
Sephadex G-200 exclui só moléculas com PM superiores a 800000 e é
utilizado na separação de pesos moleculares entre 5000 e 800000. Entre
estes dois tamanhos existe uma grande gama intermédia de poros que
permite a separação mais fina dentro de gamas de PM mais estreitas.
Numa separação as macromoléculas saem em fracções diferentes e por
ordem decrescente do seu PM podendo estabelecer-se relações empíricas
entre o volume de solvente necessário para a sua eluição (Ve) e o respectivo
PM. Esta relação é empírica e varia para as diferentes classes de
macromoléculas (polissacáridos, proteínas globulares, etc.). Para as proteínas
globulares verificou-se que essa relação é traduzida por:

Ve = A log10 PM + B

em que A e B são constantes tendo A um valor negativo. Esta relação só é


válida num domínio restrito de PM. Assim Ve terá um valor mínimo igual ao Vo
quando a proteína tem um PM superior ao limite máximo de PM de
discriminação do gel. Para proteínas com PM inferior ao PM máximo, o
volume Ve aumentará com a diminuição dos pesos moleculares até se atingir o
seu valor máximo constante de Ve=Vo+Vi. As constantes A e B são
determinadas por calibração da coluna com pelo menos duas proteínas
globulares de peso molecular conhecido.

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Ve
Vo + Vi

recta Ve = A log PM + B

Vo

log PM min log PM max log PM

A2. FILTRAÇÃO EM GEL E SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO


QUÍMICO DE PROTEÍNAS
A filtração em gel é também frequentemente utilizada no tratamento de
proteínas com determinados reagentes (de PM muito inferiores aos das
macromoléculas). Assim, podemos carregar uma zona da coluna com um
determinado reagente de modo que, a proteína ao mover-se e ao atravessar
essa zona vá contactando sucessivamente com camadas de reagente novo
tornando o processo de reacção mais eficiente. A separação entre a proteína
e o excesso de reagente pode ser feita por eluição contínua.

A3. OBJECTIVO DO TRABALHO


Neste trabalho vamos utilizar a técnica de filtração em gel com dois objectivos
distintos:
i) Utilização do gel como suporte para uma reacção química entre uma
proteína e reagentes.
ii) Separação entre a proteína e os reagentes.

Nesta experiência a oxihemoglobina (vermelho vivo) é tratada com


ferricianeto de potássio (Fe(CN)63-) e transformando-se em metahemoglobina
(castanha). Esta mistura é introduzida no topo da coluna para separação. A
metahemoglobina é posteriormente tratada com ditionito de sódio (Na2S2O4)
na coluna resultando deoxihemoglobina (púrpura) que é oxigenada à medida
que percorre o gel, contactando com o oxigénio molecular que aí se encontra,
dando origem a oxihemoglobina (vermelho vivo).

AS DIFERENTES FORMAS DE HEMOGLOBINA:


A função da hemoglobina é transportar oxigénio dos pulmões para os tecidos
e dióxido de carbono e H+ dos tecidos para os pulmões. A hemoglobina
contém um grupo prostético designado por grupo hemo. O hemo contém um
ião ferroso que está quelado no centro de um anel de porfirina. Os iões Fe2+
são mais estáveis quando é satisfeito um número de coordenação 6. Quatro

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das posições de coordenação são preenchidas pelos átomos de azoto do anel


de porfirina, outra
posição pela base de histidina (His) da cadeia polipeptídica da proteína e, na
oxihemoglobina, a sexta posição é preenchida por oxigénio molecular.

O2
Fe2+ Fe2+
His His
Deoxihemoglobina Oxihemoglobina

Pretende-se nesta experiência observar três formas de hemoglobina que são


interconvertíveis:
– Metahemoglobina - nesta forma o ião Fe2+ no centro do anel de porfirina
é oxidado à forma férrica com (Fe(CN)63-). Esta forma não liga O2 e é
rapidamente reconhecida pela sua cor castanha.
– Deoxihemoglobina - esta forma tem cor púrpura (roxo).
– Oxihemoglobina - hemoglobina oxidada - esta forma é vermelho vivo.

Redução
Na2S 2O4 Oxigenação
Metahemoglobina Desoxihemoglobina Oxihemoglobina

Oxidação Fe(CN)63-

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A4. Técnica experimental


A4.1. Reagentes
Sephadex G-50 equilibrada em tampão fosfato
Tampão fosfato 10 mM pH= 7.0: 3,9 ml NaH2PO4 1 M, 6,1 ml Na2HPO4 1M,
para 1 litro
Ditionito de sódio: Solução 10mg/ml preparada no tampão fosfato
Ferricianeto de potássio (PM 329 g/mol)
Solução de hemoglobina

A4.2. Preparação da coluna


Com a torneira fechada, deite um pouco de tampão na coluna e verifique que
esta não se encontra entupida. Comece a encher a coluna com a papa de gel
diluída. Abra a torneira e observe o empacotamento do gel. Sem deixar
formar interface, vá adicionando mais papa de gel até que a zona já
empacotada atinja uma altura de aproximadamente 20 cm. Feche a torneira.
Depois de devidamente cheia a coluna deve ser lavada com tampão. Deite o
tampão cuidadosamente no topo da coluna e abra a torneira para deixar
escorrer o excesso de tampão através do gel até que o nível esteja mesmo
acima da superfície do leito. Feche a torneira. É muito importante não
deixar secar a coluna durante todo este processo. Pipete
cuidadosamente 0.2 ml da solução de ditionito de sódio para a superfície do
gel. Abra a torneira para deixar o ditionito entrar na coluna até que o menisco
atinja a superfície do gel. Feche a torneira. Logo a seguir pipete
cuidadosamente 0.2 ml de tampão para a superfície da coluna. Abra a
torneira para deixar o tampão entrar na coluna até que o menisco atinja a
superfície do gel. Feche a torneira.

c a m a d a d e d itio n ito d e N a
ta m p ã o

gel

to rn e ira p a ra fe c h a r o u a b rir

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A4.3. Preparação e eluição da solução de metahemoglobina


Adicionar 50 mg de ferricianeto de potássio sólido à solução de hemoglobina.
Agitar bem. Pipete cuidadosamente 0.5 ml de solução de metahemoglobina
para a superfície da coluna. Abra a torneira e depois da amostra penetrar no
gel, inicie a eluição adicionando tampão pelo topo da coluna (a solução
eluente contem sais, para diminuir qualquer adsorção de proteína ou
reagentes ao gel). Comece a recolher o eluente num copo limpo. Deixe a
amostra percorrer as partículas do gel e anote as mudanças de cor
observadas. Repare ainda na banda amarela do ferricianeto de potássio que
se atrasa e separa da banda da hemoglobina.
Para determinar os volumes de eluição da hemoglobina e do ferricianeto a
recolha do eluente é feita em dois copos; desde o início até à saída de
metade da banda vermelha num copo e desde aí até à saída de metade da
banda amarela noutro copo. Meça os volumes recolhidos com uma proveta.
Lave a coluna com tampão até esta ficar de novo branca para recuperação do
gel.

B. CROMATOGRAFIA DE PERMUTA IÓNICA


B1. Introdução
As proteínas podem ser separadas por adsorção diferencial em materiais de
permuta iónica. Alguns destes materiais são convenientemente preparados
introduzindo grupos iónicos na celulose. A dietilaminoetilcelulose (DEAE-C) é
um destes materiais e contém grupos -O-CH2-CH2N(C2H5)2 em vez de alguns
grupos OH da celulose original. Estes grupos adquirem uma carga positiva
quando o átomo de azoto se combina com um protão para se tornar -NH+R2.
A DEAE-C é uma resina aniónica pois as suas cargas positivas atraem aniões.
A solução de proteínas a separar é passada através de uma coluna de DEAE-C
e as diferentes proteínas são eluídas passando através da coluna soluções
tampão com composições diferentes. Baixando o pH elui-se mais proteína
pois vai-se diminuindo o número total de cargas negativas da molécula de
proteína diminuindo a sua interacção com a DEAE-C carregada positivamente.
Por outro lado, o aumento da concentração do sal no tampão facilita a eluição
de mais proteína pois há mais aniões no meio para competir com a proteína
para as cargas positivas da DEAE-C.

Neste trabalho vamos separar duas proteínas a catalase (proteína verde) e o


citocromo c (proteína vermelha). A primeira é uma enzima que catalisa a
reacção:
Catalase
H2 O 2 H2 O + 1/2 O 2

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e o citocromo c catalisa a transferência de electrões entre os complexos III e


IV da cadeia respiratória.

complexo III complexo IV


QH 2 -citocromo c cit. c O2
reductase ox citocromo c
red oxidase red

complexo III complexo IV


QH 2 -citocromo c
reductase citocromo c
ox cit. c oxidase ox
red 2 H 2O

B2. Técnica experimental


B2.1. Reagentes
Mistura de citocromo c e catalase em água
Resina aniónica DEAE-C equilbrada em tampão A
Tampão A: tampão 20mM acetato de sódio, 5mM ácido acético
Tampão B: tampão 20mM acetato de sódio, 5mM ácido acético, 1M
NaCl
Ferricianeto de potássio
Ditionito de sódio
Peróxido de hidrogénio (10 vol.)

B2.2. Preparação da coluna de permuta iónica


A forma de preparação da coluna é semalhante à efectuada no ponto A4.2.
Contudo otampão a ser utilizado é o tampão A. Em seguida, deite a resina
DEAE-C na coluna com a ajuda de uma vareta, de modo a ficar com uma
altura de aprox. 7cm. Esta resina foi previamente equilibrada no tampão.
Verifique se a superfície da coluna está plana. Lave a coluna com tampão A,
tendo o cuidado para não perturbar a superfície. É importante que a
coluna não seque.

B2.3. Separação da mistura de proteínas


Deixe entrar todo o tampão A na coluna antes de introduzir cuidadosamente 5
ml da solução de proteína. Verifique a concentração de material corado no
topo da coluna. Depois de deixar entrar a solução de proteína na coluna,
continue a adicionar o tampão inicial (A) até eluir completamente a primeira
proteína. Note que a banda avermelhada não se adsorve à superfície
começando a descer imediatamente na coluna. Recolha o efluente em tubos
de ensaio desde o início até ao fim da eluição das duas proteínas (recolha um

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volume de cerca de 5ml por tubo). Completada a eluição da banda vermelha,


mude para o tampão B, para eluir a 2ª proteína. Repare que a banda
esverdeada desce na coluna, continue a recolha do eluente em tubos de
ensaio até ela sair.

B2.4. Identificação das proteínas coradas


Verifique quais as fracções mais concentradas em proteína, medindo a
absorvância das fracções recolhidas a λ=280 nm. Com as fracções mais
concentradas e com o objectivo de identificar as proteínas divida cada fracção
em duas partes. A uma das partes adicione H2O2 (a 10 volumes) e verifique
se há libertação de bolhas. À outra adicione ditionito (Na2S2O4) para reduzir a
proteína e trace o espectro de visível entre 350-700 nm. Compare os
espectros com os da figura em que se apresentam os espectros de visível do
citocromo c e da catalase na forma oxidada (a) e na forma reduzida (b).

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PREPARAÇÃO DA AULA PRÁTICA

A. CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL

1. Qual a base do método de separação por cromatografia de filtração em


gel?

2. Quais são os componentes separados na coluna de Sephadex?

3. Será possível determinar o peso molecular da hemoglobina por


cromatografia de filtração em gel utilizando Sephadex G-25? Em caso
negativo diga qual o tamanho de poro que escolheria.

B. CROMATOGRAFIA DE PERMUTA IÓNICA

1. Calcule o pH e a força iónica (I = 1/2 ΣCi(Zi)2) dos dois tampões utilizados


sabendo que o pKa (ácido acético) = 4.7.

2. Qual a base do método de separação por cromatografia de permuta


iónica?

3. Sabendo que apenas a banda verde se agarra à resina DEAE-C ao pH do


tampão A o que pode concluir acerca do pI do citocromo c de cavalo? E
acerca do pI da catalase?

4. A banda verde é eluída por aumento de força iónica do tampão de eluição


pIB>pIA. Sugira um método alternativo para a eluição desta proteína
mantendo constante a força iónica.

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QUESTIONÁRIO

Grupo nº /Turno
Nome Aluno nº

A. CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL

1. Como interpreta a sucessão de cores observada na coluna de Sephadex.

2. Qual a relação entre os volumes de eluição da hemoglobina (PM=64500)


e do ferricianeto (PM= 329) e os volumes Vo e Vi.

B. CROMATOGRAFIA DE PERMUTA IÓNICA

1. Represente graficamente a absorvância a 280 nm em função do número


das fracções recolhidas. Identifique as bandas no gráfico. Justifique.
Anexe o gráfico.

2. Comente a eficiência da separação.

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