UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

MICOLOGÍA
PRÁCTICA 1 Observación de estructuras de Hongos
PRÁCTICA 2 AISLAMIENTO DE HONGOS DE DIFERENTES FUENTE
PRÁCTICA 3 CARACTERÍSTICAS TINTORIALES DE LOS HONGOS
PRÁCTICA 4 MICROCULTIVO
PRÁCTICA 5 DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERISITCAS FISIOLOGICAS DE LOS HONGOS

Alumnos: Olivares Romero Orlando

Grupo:1701
OBJETIVOS:
1.Reconocer las principales estructuras de hongos filamentosos y levaduriformes.
2.Demostrar la presencia y distribución de los hongos que se encuentran en el medio ambiente.
3. Analizar la morfología de los hongos que se han obtenido de diversas fuentes.
4. Realizar la identificación y clasificación.
5. Adquirir la capacidad de diferenciar hongos.
6.Ser capaz de realizar la técnica de microcultivo
7. Entender la eficacia de un microcultivo para identificar y clasificar un hongo filamentoso.

Cuestionario
Practica 1
1. ¿A qué se le llaman hongos verdaderos y hongos falsos?
Los hongos verdaderos; En este reino se establecen 6 filos. Haciendo clic en cada uno de ellos se accederá a
una información más detallada: Filo Chytridiomycota: Es el único grupo de hongos verdaderos que presenta
esporas flageladas. Reciben el nombre coloquial (bueno, lo de coloquial es un decir) de quítridos.
Los hongos falsos; Organismo heterótrofo, su alimentación No son organismos heterótrofos, su es por
absorción. ... Son organismos unicelulares o Son organismos unicelulares. pluricelulares. En su pared celular
posee quitina.
2. Nombre tres hongos de importancia para la industria farmacéutica.
Degradadores de celulosa: Trichoderma y Chaetomium
Producción de medicamentos: Penicillium notatum,
3. Nombre tres hongos de importancia médica.
Streptomyces rimosus (B) (Tetraciclina) y Micromonospora purpurea (B) (gentamicina), Cephalosporium
acremonium. (Cefalosporina)
4. ¿Qué es una espora?
Un cuerpo microscópico unicelular o pluricelular que se forma con fines de dispersión y supervivencia por
largo tiempo (dormancia) en condiciones adversas, y que generalmente es una célula haploide.
5. ¿Cuáles son las principales diferencias entre un hongo micelial y uno levaduriforme?
Los hongos miceliales tienen micelio que es una estructura filamentosa , este puede ser reproductivo o
vegetativo . En el reproductivo se encuentran conidios microscopicos que tiene diferentes formas y que al
realizar una preparación con un colorante nos ayudan a distinguir entre los generos. EL micelio vegetativo
puede ser cenocitico o septado.
Los hongos miceliales se reproducen por esporulación.
Los hongos levaduriformes tienen una morfología colonial igual a la de bacterias, al realizar un frotis estan son
más grandes. Las levaduras, al ser eucariotes, también tienen su material genético definido, se dividen por
gemación y en ocasiones por bipartición. No tienen esructuras filamentosas ni producen esporas.

Practica 2
1. ¿Qué clase de productos útiles proceden los hongos?
Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad
enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran
cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende
el hombre.
2. ¿Cómo afectan la temperatura, pH, presión osmótica y humedad en el desarrollo de un hongo?
FACTORES FISICOS
a) Humedad y Agua disponible (aw).
La cantidad de agua existente en el ambiente y en los sustratos es uno de los factores importantes para el
desarrollo de los hongos y para la producción de micotoxinas. Sin embargo, no sólo influye la cantidad de agua
sino también la forma de presentación de la misma, así pues, el agua se encuentra en forma libre y en forma
combinada.
El agua libre existe dentro y alrededor de los tejidos vegetales o de las células y puede ser eliminada sin
interferir seriamente con los procesos vitales.
La forma combinada está presente en los tejidos vegetales y animales, formando parte integrante de las
células que los componen y en unión con las proteínas y glúcidos. Para la germinación de las esporas de
hongos, es necesario que el agua se encuentre en forma libre.
Existen dos grandes unidades relacionadas con la cantidad de agua, a saber:
.- Humedad relativa de equilibrio (HRE): es la cantidad de humedad de la que disponen los microorganismos
una vez alcanzado el equilibrio entre la humedad libre del producto y el vapor de agua existente en el medio
ambiente que lo rodea. La HRE se expresa en porcentaje y varia de unos alimentos a otros conforme su
riqueza en glúcidos o en materia grasa.
.- Agua disponible (aw): es la relación existente entre el agua libre en los alimentos y la capacidad de los
microorganismos para allí proliferar. La aw nos indica cual es la cantidad de agua disponible para el desarrollo
de los microorganismos una vez se ha alcanzado el equilibrio hídrico en el sistema - alimento/medio ambiente.
La aw se expresa como la relación existente entre la tensión del vapor de agua en el sustrato (P) y la del agua
pura (P0), a la misma temperatura, (aw = P/P0).Si la humedad del alimento está en equilibrio con la humedad
relativa de equilibrio (HRE) de la atmósfera que lo rodea, la aw en el alimento es numéricamente equivalente
a esta, (aw= HRE/100).
Tengamos en cuenta que la HRE se refiere a la atmósfera en equilibrio con el producto y la aw se refiere al
propio producto. El agua pura tiene una aw de 1 y está en equilibrio con una atmósfera de 100% de HRE. La
aw de un alimento es siempre menor que 1.
Los valores de aw que los diversos grupos de hongos necesitan varían de acuerdo con el sustrato y la
temperatura, veamos ahora algunos valores de aw necesarios para el desarrollo de algunos hongos y para la
producción de micotoxinas
b) Temperatura
La temperatura óptima para el desarrollo de los hongos se encuentra entre 25 y 30ºC y el límite máximo entre
40 y 45ºC. Destacamos que la mayor parte de los hongos no crecen por debajo de 5ºC y que sin embargo hay
hongos como el Aspergillus flavus, Aspergillus candidus y Aspergillus fumigatus que pueden crecer sin
problemas hasta los 55ºC y otros como el Penicillium expansum y el Penicillium cyclopium que son capaces de
crecer a 0ºC.
Veamos ahora la temperatura mínima necesaria para el desarrollo de algunos mohos y para la producción de
Micotoxinas

c) pH.
Los hongos toleran un gran intervalo de pH ( 2,5 - 7,5 ), de un modo general soportan mejor el medio ácido que
el alcalino. Es de destacar que ellos mismos son capaces de alterar el pH,
utilizando como fuente de energía los ácidos orgánicos del alimento o los excretados por bacterias
acidificantes que pueden aparecer durante el periodo de deterioro del alimento (3).

d) Composición del sustrato.

Los hongos no son exigentes desde el punto de vista nutricional y ellos se nutren de los micro y macro-
elementos existentes en el sustrato donde se desarrollan. Sin embargo, la composición del sustrato está muy
ligada a la producción de la micotoxina.

Están descritos estudios en cereales y semillas de oleaginosas previamente esterilizadas en autoclave e

inoculadas con cepas toxicogénicas de Aspergillus parasiticus

3. ¿Para qué se realizan las diluciones en el aislamiento de los hongos del suelo?
Para poder aislar los hongos que se encuentran en la tierra y poder realizar una lectura de ellos en
microscopio.
4. Nombre cinco medios de cultivo para hongos y su composición química.
Medios de cultivo
utilizados comúnmente
Agar Sabouraud

Agar Neopeptone-glucose-rose Bengal-aureomycin

Agar Czapek (para Aspergillus, penicillium y hongos relacionedos

Agar Yeast extract-malt extract-glucose

Agar Diamalt (para levaduras)

5. Nombre cinco géneros de hongos que se presentan en suelo.

Chytridiomycota, Zygomycota, Basidiomycota, Ascomycota, Glomeromycota

6. Nombre cinco géneros de Deuteromycetes patógenos. (Hongos imperfectos)

Tolypocladium inflatum → del que se extrae el inmunosupresor ciclosporina
Penicillium notatum y P. chysogenum → el origen de la penicilina orgánica.
Penicillium griseofulvum → componente principal del antifúngico griseofulvina
Aspergillus niger → contiene enzimas usado para modificar el sabor de alimentos
Cladosporium resinae → descompone hidrocarburos como el petróleo, y el queroseno
7. ¿Qué es una aflotoxina?
Son micotoxinas producidas en pequeñas concentraciones por hongos del género Aspergillus. Los más
notables Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Aspergillus parasiticus. También pueden ser producidas por
hongos del género Penicillium, como P. verrucosum. Las aflatoxinas son tóxicas. Después de la entrada al
cuerpo, las aflatoxinas se metabolizan por el hígado con un reactivo intermedio, la aflatoxina M1

8. Nombre tres hongos superiores venenosos.

Practica3.
1. ¿Cuál es el fundamento y en qué casos se utiliza la técnica de Gram, Ziehl-Neelsen y la técnica de Schiff?
Tinciones diferenciales: Son técnicas que utilizan dos o más colorantes y/o principios activos.
Tinción Ziehl – Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes)
Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que son difíciles de colorear con colorantes
básicos, porque se muestran impermeables a la coloración. El contenido lipídico de estos organismos está
compuesto principalmente por ceras y fosfolípidos que alcanzan hasta un 40% de su peso seco total.
La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales biológicos para formar complejos con
algunos colorantes y que luego de la exposición al alcohol-ácido no ocurre de coloración Se cree que el ácido
micólico es responsable de ácido- alcohol-resistencia. Útil en algunos microorganismos ácido resistentes como
N.Asteroides, N.Brasiliensis y otros actinomicetes.
Tinción de Gram
Tinción diferencial: Se emplea para teñir: Productos biológicos líquidos Exudados de lesiones Macerados de
biopsias. Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram, excepto Cryptococcusneoformans.
El de colorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de la pared impidiendo la retención del cristal violeta en
los organismos Gram negativos. Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio Esta
técnica se basa en las diferencias en el punto isoeléctrico.

2. ¿Qué técnica de tinción se usa en hongos demateáceos?

Tinciones específicas:
del hongo
Hematoxilina – Eosina
Metanamina - plata de Gomori, de Grocott, Masson - Fontana
PAS, Azul-alcian, Mucicarmín (el PAS tiñe con mayor intensidad el Mucor que el Aspergillus; el Azul-alcián y el
Mucicarmín tiñen mejor la cápsula del Criptococo).
de la reacción tisular:
Masson, Reticulina
Identificación de componentes de la inflamación

3. ¿Qué técnicas de tinción son más utilizadas en el área de Bioquímica Clínica para el diagnóstico de
hongos, patógenos tanto miceliales como levaduriformes?
TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON, Reichert Zetopan. Tinción de Gram, Tinción de azul algodón de lactofenol

4. ¿Qué técnicas de tinción son más utilizadas en el área Farmacéutica para la determinación de hongos de
importancia industrial o de contaminación en plantas farmacéuticas?
Tinción de Wrigh, Tinción negativa, Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen.

Practica 4.
1. ¿Cuál es la función de agregar glicerina-agua a la caja de Petri?
Mantener la humedad del medio dentro de la caja petri.

2. ¿Cuál es el efecto del fenol o el formaldehido al 10%, al agregar a la caja de Petri?

Inactivar por 15 minutos al hongo para preparar la observación al micro.

3. ¿Qué otras técnicas a parte del microcultivo son útiles para la identificación de mohos?
• Montaje húmedo, técnica fácil de realizar, rápida y económica, pero debido a la forma tan directa de tomar
la muestra, esta sufre algún traumatismo, en las estructuras microscópicas, lo que dificulta el hecho de
identificarlo correctamente.
• Técnica de cinta adhesiva, la cual es barata, rápida y fácil de realizar, sin embargo, si la toma de la muestra
no se hace correctamente la observación será mala.

4. En un hongo levaduriforme ¿Es recomendable usar el microcultivo para su identificación?

No es recomendable realizar por microcultivo, debido a micelos muy finos y sedosos donde la colonia presenta
una apariencia tersa y sedosa, para este tipo de hongo es mejor realizar zimograma o auxonograma.

PREGUNTAS EXTRAS.
¿Qué otros medios de cultivos para hongos?
Clasificación de
medios de cultivo
POR COMPOSICIÓN

POR UTILIZACIÓN

DEFINIDOS- Se preparan añadiendo agua destilada, cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos
purificados. Se conoce la composición química exacta.

COMPLEJOS- Emplean hidrolizados de productos animales o vegetales, como caseína, carne, extracto de levaduras.
No están definidas (no se sabe la composición química exacta).

SELECTIVO- Contiene compuestos que inhiben selectivamente el crecimiento de algunos microorganismos, y favorece el
de otros.

Medios de cultivo
Utilizados comúnmente
Agar Sabouraud
Agar Neopeptone-glucose-rose Bengal-aureomycin
Agar Czapek (para Aspergillus, penicillium y hongos relacionedos
Agar Yeast extract-malt extract-glucose
Agar Diamalt (para levaduras)

Medios no selectivos
AGAR- DEXTROSA-PATATA (PDA)
MEDIO UTILIZADO EN LA MAYORIA DE LOS HONGOS

AGAR- CALDO DE GUISANTES SACAROSADO

medio adecuado para estudiar especies de Pythium y Phytophyhora

AGAR-HARINA DE AVENA (OMA)

Es utilizado para Pythium sp., Phytophthora sp., Fusarium sp y Phoma sp
Medios selectivos
P10 VP.
medio utilizado para aislar Phytophythora spp.
La vancomicina y la piramicina inhiben, a los hongos pertenecientes a la familia Pitiaceas. El PCNB inhibe a otros hongos
del suelo.
KOMADA
Medio selectivo para especies de fusarium. Se pueden diferenciar las especies del hongo por el color de sus colonias en
este medio de cultivo. F. oxysporum: salmon, F. solani: rojizo, F. roseum: rojo fuerte.
Referencias
DIFERENCIAL- Es aquel al que se añade un indicador,
normalmente un colorante, para permitir diferenciación de reacciones químicas particulares que ocurren durante el
crecimiento.
POR ESTADO FÍSICO

SÓLIDOS- Inmovilizan a las células, permitiéndoles

crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias.

LÍQUIDOS- Se denominan caldos. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión de
una determinada concentración.

AGAR AGUA (AA)

Es un medio muy pobre en nutrientes, pero muy útil para estudiar fructificaciones debido al escaso crecimiento miceliar.
se utiliza también para estudiar Rhizoctonia solani.

¿Qué otras tinciones para hongos existen??

Safranina
Útil para el estudio de cultivos y productos biológicos líquidos. Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo
intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro oro sapálido.
Azul de algodón
El azul de lacto fenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos
por aislamiento de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante. El ácido láctico conserva las
estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior del fúngico
generando una película por así llamarlo protectora.
Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que es una técnica rápida que permite visualizar
perfectamente las estructuras fúngicas. El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de
micelio micólico, el cual toma un delicado color azul claro.
Composición:
• Alcohol metílico
• Azul de algodón acetico
• Agua destilada 250 mL
• Alcohol al 96%
• Xilol
Anaranjado de Acridina
Se utiliza para la detección de bacterias y hongos en muestras clínicas Puede utilizarse un microscopio con
accesorios fluorescentes como el de Reichert Zetopan. El microscopio ordinario puede equiparse con filtros
para filtración fluorescente (BG12, de 4 mm de espesor). Se colocan filtros amarillos de modo de barreras
filtrantes.
Fundamento: El pigmento se intercala en el ácido nucleico (nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, las
bacterias, los hongos y el material celular se tiñen de naranja rojizo. Con pH ácido, las bacterias y los hongos se
mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se tiñe de amarillo verdoso.
Composición:
× Alcohol absoluto
× Ácido acético
× Anaranjado de acridina
× Buffer de fosfatos
× Cloruro de calcio.
Tinción con Eritrosina
Útil para la observación de gránulos causados por:
• Nocardia
• Madurellagrisea
• M. mycetomatis
Solución de eritrosina.
Reactivos utilizados:
• Eritrocinade Grübler0.20g
• Naranja G 1g
• Agua destilada 100mL
Tinciones diferenciales: Son técnicas que utilizan dos o más colorantes y/o principios activos.
Tinción de Gram
Tinción diferencial: Se emplea para teñir: Productos biológicos líquidos Exudados de lesiones Macerados de
biopsias. Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram, excepto Cryptococcusneoformans.
El de colorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de la pared impidiendo la retención del cristal violeta en
los organismos Gram negativos. Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio Esta
técnica se basa en las diferencias en el punto isoeléctrico
Tinción Ziehl – Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes)
Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que son difíciles de colorear con colorantes
básicos, porque se muestran impermeables a la coloración. El contenido lipídico de estos organismos está
compuesto principalmente por ceras y fosfolípidos que alcanzan hasta un 40% de su peso seco total.
La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales biológicos para formar complejos con
algunos colorantes y que luego de la exposición al alcohol-ácido no ocurre de coloración Se cree que el ácido
micólico es responsable de ácido- alcohol-resistencia. Útil en algunos microorganismos ácido resistentes como
N.Asteroides, N.Brasiliensis y otros actinomicetes.
ESPECIALES
Blanco de carcoflour
Fundamento: El calcofloúr es un flourocromo que se une a polisacáridos con los en la cesbeta1-3 y beta1-4
presentes en polímeros tales como celulosa y la quitina. El colorante fluorece cuando se expone a una fuente
de luz ultravioleta de onda cortao capaz de producir la luz azul (longitud de onda 410-450 nm). Es un método
de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micóticos con microscopio de fluorescencia.
 TINCION DE HONGOS CON AZUL LACTOFENOL
 limpiar la porta objetos en la disolución éter etílico
 secarlo con el papel, hasta que esté totalmente seco, y no tenga éter, ya que es un alcohol y puede eliminar las
bacterias existentes

1) se coloca una gota de agua salina fisiológicamente encima del portaobjetos

2) se aplica un trocito de hongo de la naranja podrida y se expanden por encima de la gota de agua salina fisiológica,
hasta que se seque
3) se coje una gota de azul lactorend con agua estéril y se añade encima de la muestra
4) se cubre la muestra con el cubreobjetos y esta preparación esta lista para ser observado

TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON
Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esférica u oval. Al microscopio las esporas sin teñir
se observan como gránulos brillantes. Según su localización se distinguen tres tipos de esporas: Centrales,
Subterminales, Terminales
• Realizar el frotis
• Cubrir el frotis con verde de malaquita
• Calentar 5 minutos a emisión de vapores
• Enjuagar con agua de la llave
• Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
• Lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.
TINCIONES HABITUALES (GMS, PAS)
Las tinciones habituales para hongos son la plata metenamina de Grocott (GMS) el ácido periódico de Schiff (PAS).
La tinción GMS es más sensible que el PAS, pero tiene el inconveniente de que tiñe las células inflamatorias
(lisososmas) y la reticulina del tejido además de los hongos lo que puede causar problemas de identificación de
estructuras.
La tinción de PAS tiene la ventaja de que el tejido adyacente al hongo se observa mejor, aunque esto también se
puede conseguir haciendo una tinción GMS y una contra tinción con H&E. Hay que incluir buenas secciones
control ya que algunos hongos, como los Mucorales, pueden requerir más tiempo de tinción y otros, por el
contrario, estar sobre teñidos.
TINCION LACTOFENOL AZUL DE ALGODÓN
Método utilizado rutinariamente para la realización de preparaciones microscópicas de hongos filamentosos.
Cada uno de los constituyentes del colorante lactofenol azul de algodón cumple una función determinada.
-El fenol utilizado sirve como funguicida
-la glicerina permite tener una preparación semipermanente
-El azul de algodón tiñe el exterior de la pared de los hongos
-El ac alcohol láctico actúa como agente a clarante
Hongos filamentosos; Aspergillux, Microsporum, Mucor , Pelicilium

Tinción de Gram
• Colocar una gotita de cristal violeta sobre elfrotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua
• Colocar una gotita de lugol durante 1 min. enjuagar con agua
• Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua
• Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua
• dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X ainmersión. Dibujar y colorear.
Tinción Con Naranja De Acridina
• Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire.
• Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min.
• Eliminar el etanol y colocar 100 ml de naranja de acridina durante 3min.
Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%.
• Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisión a 490 nm.
Tinción Diferencial
Tinción De Ziehl-Neelsen (Aar)
• Se utiliza para diferenciar las bacterias denominadas ácido alcohol resistente del No ácido alcohol resistente
• Algunas bacterias poseen, en su pared celular, ciertos ácidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad
de resistir la decoloración con alcohol ácido, tras haber sido teñidas con colorantes básicos.
• Esta tinción requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene la capa cerosa
formada por ácido micólico.

Bibliografías.
-Biología de los Microorganismos.Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J, 2003-. Prácticas De Patología
Vegetal. Medios de cultivos para hongos
-Cifuentes Romo Dina,1990 pp. 7-12.
-Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis. Salud OPDL. Vol. 1. 2008.
-Larone DH. Medical important fungi. A guide to identification. 5th ed. USA: American Society for Microbiolog
2011