Annales de pathologie (2013) 33, 24—37

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ARTICLE ORIGINAL

Mise en place d’un secteur de pathologie

moléculaire en oncologie au sein d’un laboratoire
d’anatomie pathologique (LPCE, CHU de Nice)
Setting up a department of molecular pathology in oncology in a pathology
laboratory (LPCE, CHU de Nice)

Elodie Long a,1, Véronique Hofman a,b,1, Marius Ilie a,

Virgine Lespinet a, Christelle Bonnetaud b,
Olivier Bordone b, Virginie Gavric-Tanga b,
Kevin Washetine a, Marie-Clotilde Gaziello a,b,
Virginie Mauro b, Sandra Lassalle a, Eric Selva b,
Katia Zahaf a, José Santini c, Laurent Castillo c,
Jean-Philippe Lacour d, Nicolas Vénissac e,
Jérôme Mouroux e, Josiane Otto f, Michel Poudenx g,
Charles-Hugo Marquette g,
Jean-Christophe Sabourin h, Paul Hofman a,∗,b,1

a
Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale (LPCE), hôpital Pasteur, centre
hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France
b
Tumorothèque-centre de ressources biologiques, hôpital Pasteur, centre
hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice, France
c
Institut universitaire de la face et du cou, avenue de Valombrose, 06100 Nice, France
d
Service de dermatologie, hôpital de l’Archet, 06200 Nice, France
e
Service de chirurgie thoracique, hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69,
06002 Nice, France
f
Unité de pneumologie, CLCC Antoine-Lacassagne, 06189 Nice, France
g
Service de pneumologie, hôpital Pasteur, centre hospitalo-universitaire, BP 69, 06002 Nice,
France
h
Laboratoire de pathologie, CHU de Rouen, 1, rue de Germont, 76031 Rouen cedex, France

Accepté pour publication le 16 décembre 2012

Disponible sur Internet le 30 janvier 2013

∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : hofman.p@chu-nice.fr (P. Hofman).
1 Ces auteurs ont contribué de façon identique à ce travail.

0242-6498/$ — see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.12.003
Création d’un secteur de pathologie moléculaire 25

MOTS CLÉS Résumé L’avènement des thérapies ciblées et de la médecine personnalisée en oncologie a
Biologie moléculaire ; provoqué en France la mise en place et la structuration du réseau des plateformes hospita-
Pathologie lières de génétique moléculaire sous l’impulsion de l’Institut national du cancer (INCa). Ces
moléculaire ; plateformes sont, selon les sites concernés, intégrées ou non au sein des services d’anatomie
Assurance qualité ; pathologique. Le développement des techniques de biologie moléculaire, le choix des procé-
Accréditation ; dures, l’établissement du circuit des échantillons, le contrôle de la qualité et la sélection des
NF ISO 15189:2007 ; altérations génomiques à détecter sur chaque plateforme, ont été laissés à l’appréciation des
Thérapie ciblée différents laboratoires. En fonction des appels à projet formulés par l’INCa, les plateformes hos-
pitalières de génétique moléculaire ont pu adapter leur activité selon l’enveloppe budgétaire
attribuée. Alors que la présence de certaines altérations génomiques (comme les mutations
du gène KRAS dans les adénocarcinomes coliques métastatiques ou les mutations du gène de
l’EGFR dans les adénocarcinomes bronchopulmonaires), peuvent avoir comme conséquence
l’administration de thérapies ciblées associée à une autorisation de mise sur le marché (AMM) de
différentes molécules, d’autres sont associées à des essais thérapeutiques. Dans ce contexte,
il est apparu nécessaire d’adapter rapidement le fonctionnement des laboratoires hospita-
liers d’anatomie pathologique réalisant des actes de biologie moléculaire afin de répondre à la
demande croissante des oncologues dans le domaine des thérapies ciblées. Cet article a pour
but de décrire les différentes étapes de la mise en place d’un secteur de pathologie moléculaire
au sein d’un laboratoire hospitalier d’anatomie pathologique (LPCE, CHU de Nice) et de mon-
trer l’expérience dans ce domaine de ce laboratoire plus particulièrement orienté sur la prise
en charge du diagnostic morphologique et moléculaire des cancers du poumon, de la thyroïde
et du mélanome malin.
© 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDS Summary The advent of targeted therapies and personalized medicine in oncology has led in
Molecular biology; France to the settlement and organisation of a network of hospital molecular genetic platforms
Molecular pathology; under the impetus of the National Cancer Institute (INCa). These platforms are, according to
Quality assurance; the concerned sites, integrated or not in pathology laboratories. The development of molecular
Accreditation; biology methods, the choice of the procedures, the establishment of sample workflow, the
ISO 15189; quality control and the selection of the genomic alterations to be detected on each platform,
Targeted therapy have been left to the discretion of the different laboratories. Based on calls for project made by
the INCa, hospital molecular genetic platforms were able to adapt their activity according to the
assigned budgets. While the presence of some genomic alterations (i.e. KRAS gene mutations in
metastatic colon adenocarcinoma or EGFR gene mutations in lung adenocarcinomas), may lead
to administration of targeted therapies under the Marketing Authorization Application (MAA),
others are associated with therapeutic clinical trials. However, increasing number of MAA for
new molecules targeting genomic alterations is likely in the near future. In this context, it
is necessary to quickly adapt the organisation of work of the hospital pathology laboratories
performing molecular biology tests in order to meet the growing demand of oncologists in the
field of targeted therapies. The purpose of this article is to describe the different steps of the
settlement of a molecular genetic platform in an academic pathology laboratory (LPCE, CHU de
Nice) and to show the experience of this laboratory specifically oriented on the support of the
morphological and molecular diagnosis of lung cancer, thyroid cancer and malignant melanoma.
© 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Le concept de médecine personnalisée et « l’explosion » des
thérapies ciblées en oncologie ont eu pour conséquence
la mise en place en 2006 des plateformes hospitalières
de génétique moléculaire par l’Institut national du can-
cer (INCa) afin de rendre accessibles les tests de détection
d’altérations génomiques à tous les patients sur l’ensemble
du territoire français. Selon les villes, ces plateformes se
sont organisées en plateforme centralisée sur un seul labo-
ratoire ou réparties sur plusieurs laboratoires au sein d’une
même institution ou d’une même ville. Les laboratoires
développant une activité de biologie moléculaire à partir de
tissus ou de cellules tumorales (ou activité de « pathologie
moléculaire ») peuvent être des structures « autonomes »
dirigées par des biologistes, des pharmaciens ou des histolo-
gistes, ou bien des structures intégrées dans des laboratoires
d’anatomie pathologique. C’est dans ce dernier cadre
que les pathologistes ont dû rapidement s’adapter à une
nouvelle activité et à de nouvelles obligations [1]. Ainsi,
l’association d’une activité de « morphologiste » et de bio-
logiste moléculaire (ou de « pathologiste moléculaire »)
a demandé au pathologiste une formation nouvelle et
l’acquisition rapide de connaissances à la fois théoriques
et pratiques. Le nombre croissant des publications consa-
crées à l’intégration de la biologie moléculaire en anatomie
pathologique dans les revues anglo-saxonnes de patholo-
gie témoigne de la nécessité de développer ce secteur
d’activité au sein de nos laboratoires [2—11]. L’obligation
de devoir accréditer (selon la norme ISO 15189) à court
terme l’activité de biologie moléculaire, a entraîné une
autre obligation pour le pathologiste développant ce sec-
teur au sein de son laboratoire, celle d’appréhender le
système de management de la qualité dans ce domaine
et de maîtriser toutes les exigences liées à cette activité
[12].
26
Le but de cet article est de décrire la mise en place d’un
secteur de « pathologie moléculaire » au sein d’un labora-
toire d’anatomie pathologique (le laboratoire de pathologie
clinique et expérimentale [LPCE] du CHU de Nice) avec les
différentes contraintes et obligations liées à ce dévelop-
pement. Nous détaillons plus particulièrement les étapes
préanalytique, analytique et postanalytique nécessaires à
la réalisation de ce secteur. Nous décrivons également le
périmètre choisi pour l’engagement du laboratoire dans la
démarche d’accréditation selon la norme ISO 15189 de ce
secteur de pathologie moléculaire et l’activité de ce secteur
entre janvier 2010 et avril 2012.
Matériel et méthodes
Périmètre défini dans le cadre de la démarche
d’accréditation (selon la norme ISO 15189) du
secteur de pathologie moléculaire du LPCE
Cette étude porte sur la période comprise entre le premier
janvier 2010 et le 30 avril 2012.
Pathologies concernées
Le LPCE du CHU de Nice a orienté une activité de patho-
logie moléculaire sur la prise en charge des cancers du
poumon non à petites cellules (essentiellement les adé-
nocarcinomes, et plus exceptionnellement les carcinomes
épidermoïdes et les carcinomes à grandes cellules), des
adénocarcinomes colorectaux métastatiques, des cancers
papillaires de la thyroïde (CPT) et des mélanomes malins.
Entre janvier 2010 et décembre 2010, cette activité n’a pas
fait l’objet de compte rendu systématiquement transmis
aux cliniciens. Nous avons considéré qu’il s’agissait d’une
phase de mise en place et « d’apprentissage ». Cette période
a nécessité de nombreux contrôles intra- et interlabora-
toires. À partir du mois de janvier 2011, les comptes rendus
concernant tous les résultats de pathologie moléculaire ont
été transmis aux cliniciens et/ou aux pathologistes prescrip-
teurs.
Les prélèvements analysés ont concerné des fragments
tissulaires issus des pièces opératoires, des biopsies réali-
sées sous vidéo-médiastinoscopie, des biopsies bronchiques,
des biopsies cutanées et de sites tissulaires métastatiques
et des culots cellulaires. Les tissus étaient, soit fixés dans
du formaldéhyde et inclus en paraffine, soit congelés dans
l’azote liquide, puis conservés à —80 ◦ C dans la biobanque
du CHU de Nice (http://www.biobank06.com). Les prélève-
ments provenaient de patients hospitalisés au sein du CHU
de Nice ou bien de patients pris en charge dans le secteur
libéral. Si les échantillons des patients provenant du secteur
libéral ont bénéficié de la même prise en charge au sein
du secteur de pathologie moléculaire, nous avons décidé
de restreindre dans une première phase le périmètre de la
démarche d’accréditation aux échantillons prélevés sur les
patients hospitalisés au CHU de Nice et techniqués dans le
secteur de pathologie clinique du LPCE.
Altérations génomiques recherchées
Lors de l’année 2010, ont été recherchées les mutations
présentes sur les exons 18, 19, 20 et 21 du gène de l’EGFR
(adénocarcinomes primitifs broncho-pulmonaires [ADCBP]),
sur les codons 12, 13, et 61 du gène KRAS (ADCBP et adé-
nocarcinome colique métastatique) et la mutation V600E
du gène BRAF (CPT et mélanome malin métastatique,
E. Long et al.
muqueux, ou acrolentigineux). En 2011, les mutations du
gène KIT (exons 9, 11, 13, 17, 18) (mélanomes muqueux
et acro-lengitineux), du gène BRAF (V600, K, D, G, M,
A, G464E, G466 V, G469A) (mélanomes, ADCBP, adénocar-
cinome colique métastatique), du gène P13KCA (exons 9 et
20) (ADCBP), du gène HER2 (ADCBP) et le réarrangement de
EML4-ALK (ADCBP) ont été également recherchées. Seule
cependant, la recherche des mutations des gènes de l’EGFR,
de BRAF et de KRAS a été inclue dans le périmètre initial de
la démarche d’accréditation.
L’ensemble des altérations génomiques recherchées et
des pathologies concernées est résumé dans le Tableau 1.
Les étapes préanalytique, analytique et
postanalytique
La phase préanalytique
La phase préanalytique est certainement la phase la plus
difficile à maîtriser et aussi la plus concernée par les non-
conformités. Il est donc crucial d’en assurer la bonne gestion
par la rédaction d’un manuel et d’un guide de prélèvements.
Des réunions d’information organisées tous les trois mois
avec les chirurgiens et les cliniciens ont été mises en place.
Le but de ces réunions a été de donner des conseils sur
la gestion des échantillons tissulaires dès le prélèvement.
Le contrôle de la phase préanalytique au sein du LPCE se
conçoit de façon différente selon le système de transport
de l’échantillon. Le LPCE est lié par deux pneumatiques
à deux blocs opératoires distants de plusieurs centaines
de mètres (un pneumatique liant le bloc de chirurgie tho-
racique et d’endoscopie pulmonaire au laboratoire et un
pneumatique liant le bloc de chirurgie de la face et du cou
au laboratoire). La grande majorité des échantillons tissu-
laires sont transmis non fixés grâce à ces pneumatiques, dès
que les prélèvements sont réalisés. Certains prélèvements
peuvent occasionnellement transiter par un coursier (en par-
ticulier les pièces opératoires volumineuses). Les critères
d’acceptation des échantillons doivent être définis par écrit
et validés par les services de soins (identification du patient
et du préleveur ; heure et date du prélèvement ; conditions
de transport et délai d’acheminement). Le périmètre de la
phase préanalytique tel que définit dans notre démarche
d’accréditation du secteur de pathologie moléculaire inclut
la gestion de l’échantillon dès son prélèvement, la fixation
formolée ou bien la congélation des fragments tissulaires.
Ce périmètre englobe aussi l’inclusion des échantillons en
paraffine, la coupe tissulaire, la coloration standard par
l’hématoxyline éosine et la sélection par les pathologistes du
LPCE des territoires tumoraux à partir desquels sera réalisée
l’extraction de l’ADN. Il convient d’ajouter dans cette phase
préanalytique, la maîtrise du diagnostic histologique faite
par un pathologiste du LPCE (étape qui entre ici en théorie
dans la phase analytique d’un secteur de pathologie). Il nous
paraît très important que le continuum entre le diagnostic
morphologique et l’indication d’un examen de pathologie
moléculaire puisse se réaliser de façon idéale au sein du
même laboratoire et par une même équipe de pathologistes,
ces derniers pouvant avoir ainsi la « double compétence » de
pathologiste « morphologiste » et « moléculaire ». Ce mode
de fonctionnement permet de parfaitement gérer les indi-
cations et de mieux intégrer dans la réflexion les limites des
examens réalisés en aval du diagnostic histologique (extrac-
tion, amplification, et contrôle de qualité de l’ADN) [13].
C’est à ce niveau que le pourcentage de cellules tumorales,
la présence d’une intense réaction inflammatoire et/ou de
Création d’un secteur de pathologie moléculaire 27

Tableau 1 Principales altérations génomiques recherchées au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimen-
tale et pathologies d’organe concernées par ces analyses.
Main genomic alterations determined at the LPCE and corresponding tumour pathology.
Gène Adénocarcinome pulmonaire Mélanome malin Carcinome papillaire Adénocarcinome
de la thyroïde colique métastatique
EGFR Exon 18 (p.G719A ; p.G719S, Non recherché Non recherché Non recherché
p.G719 C)
Exon 19 (Del19)
Exon 20 (p.S768I ; p.T790 M)
Exon 21 (p.L858R ; p.L861Q
ou R)
KRAS Exon 2 (p.G12D ; pG12V ; Non recherché Non recherché Exon 2 (p.G12D ;
p.G12 C ; p.G12S ; p.G12A ; pG12V ; p.G12 C ;
p.G12R ; p.G13D) p.G12S ; p.G12A ;
Exon 3 (p.Q61L ; p.Q61E ; p.G12R ; p.G13D)
p.Q61H ; p.Q61R) Exon 3 (p.Q61L ;
p.Q61E ; p.Q61H ;
p.Q61R)
BRAF Exon 15 Exon 15 (V600E ; V600G ; Exon 15 (V600E ; Exon 15 (V600E ;
(V600E ; V600G ; V600 M ; V600 M ; V600 K ; V600A) V600G ; V600 M ; V600G ; V600 M ;
V600 K ; V600A) V600 K ; V600A) V600 K ; V600A)
Exon 11 (G464E ; G466V ;
G469A)
KIT Non recherché Exon 9 (p.K509I ; Non recherché Non recherché
p.Y503 F504insAY ;
p.F508 K509insFAF)
Exon 11 (p.K550* ; p.Y553* ;
p.W557* ; p.V559* ; p.N566* ;
p.V569* ; p.L576*)
Exon 13 (p.R634* ; p.K642E ;
p.N655 K)
Exon 17 (p.D816* ; p.A829P)
Exon 18 (p.I841V)
PI3KCA Exon 9 (p.E542 ; p.E545 ; Non recherché Non recherché Non recherché
p.Q546)
Exon 20 (p.M1043 ; p.H1047 ;
p.G1049)
ALK Réarrangement ALK Non recherché Non recherché Non recherché
HER2 Insertions exon 20 Non recherché Non recherché Non recherché

zones étendues de nécrose (éléments impactant sur la qua-
lité des résultats), sont pris en considération lors de la
validation finale des résultats de pathologie moléculaire.
Les différentes étapes concernant l’extraction, la quanti-
fication, et le contrôle de qualité de l’ADN ont été réalisées
comme précédemment décrites [6].
La phase analytique
Nous avons décidé de mettre en place des méthodes auto-
matisées et nous avons utilisé des kits commercialisés avec
des lots ayant des dates de péremption (« kits » développant
des tests « CE-IVD » correspondant à des tests de diagnostic
in vitro agréés par le conseil de l’Europe). Ce choix nous
autorise à « adopter » les « pratiques » et « à vérifier » au sein
du laboratoire les différentes performances affichées par
les fournisseurs, selon les « exigences » du chapitre 5 de la
norme ISO15189. L’ « adoption », terme employé dans cette
norme, consiste pour un laboratoire à utiliser de façon scru-
puleuse l’ensemble des procédures (ou des « pratiques »)
développées sur son site par le fournisseur pour utiliser un
kit commercialisé ou un équipement. Ainsi cette approche
autorise une simple « vérification » au sein du laboratoire,
c’est-à-dire que la mise en application des procédures
conduit à des résultats reproductibles (ce qui constitue
l’une des « exigences » de la norme). L’évaluation de dif-
férents paramètres (fidélité, reproductibilité, répétabilité,
robustesse, contamination inter-échantillons, justesse) a
été conduite pour les différentes techniques automatisées.
En 2010, les recherches de mutation ont été réalisées
par pyroséquençage et par séquençage direct de façon sys-
tématique pour chaque examen. En 2011, seule la technique
de pyroséquençage a été utilisée, hormis pour la recherche
des mutations des gènes KIT, PI3KA et HER2 qui a été réa-
lisée par séquençage direct (compte tenue de l’absence de
« kits CE-IVD » disponibles actuellement pour la recherche
des mutations par pyroséquençage sur ces trois gènes).
L’analyse ciblée des mutations sur les gènes :
• EGFR (codons 719, 768, 790, et 858—861, et les délétions
dans l’exon 19) ;
28
• KRAS (codons 12, 13 et 61) ;
• BRAF (codons 600 et 464—469), a été réalisée par
pyroséquençage selon une méthode décrite précédem-
ment (Matériel complémentaire) [14].
L’analyse globale des mutations sur les gènes :
• PIK3CA (exons 9 et 20) ;
• HER2 (exon 20) ;
• KIT (exons 9, 11, 13, 17 et 18) a été réalisée par
séquençage direct (Matériel complémentaire). L’analyse
du réarrangement du gène ALK a été réalisée par une
technique d’hybridation in situ fluorescente FISH (Vysis
ALK Break Apart FFPE FISH Probe Kit, Abbott Molecular)
(Matériel complémentaire).
L’ensemble des mutations recherchées au sein du LPCE
selon la pathologie d’organe est indiqué dans le Tableau 1.
La phase postanalytique
Nous avons inclut dans l’étape postanalytique la réalisation
et la validation du compte rendu de pathologie moléculaire
et la convention de preuves (vérification de la réception
des résultats par les prescripteurs et mise à disposition
rapide et sécurisée de ces résultats sur un serveur hospi-
talier ou par l’envoi de courriels cryptés). L’interprétation
et la validation des résultats sont une composante majeure
du compte rendu. La validation initiale du compte rendu
écrit se fait par trois personnes, un ingénieur biologiste
responsable du secteur technique des analyses, un patholo-
giste moléculaire et le responsable de l’unité fonctionnelle
de pathologie moléculaire. La validation se fait ensuite en
lien avec le pathologiste ayant fait le diagnostic morpholo-
gique (Fig. 1). Les comptes rendus de pathologie moléculaire
réalisés au LPCE ont fait l’objet d’une standardisation afin
que les pathologistes moléculaires utilisent la même for-
mulation. Un exemple de compte rendu est donné sur la
Fig. 2. Ces compte rendus sont transmis systématiquement
aux pathologistes ayant adressé le prélèvement et aux clini-
ciens lorsque ceux-ci ont été identifiés avec la transmission
de l’échantillon au secteur de biologie moléculaire.
Contrôles intralaboratoires et
interlaboratoires
Contrôles intralaboratoires
Pour l’année 2010, deux échantillons par tumeur ont été sys-
tématiquement analysés (lorsque cela était rendu possible
par la taille des prélèvements). L’ensemble du processus
a alors été comparé (extraction et qualité de l’ADN, et
résultats des mutations). Un contrôle intertechnicien (deux
techniciens travaillant « à l’aveugle ») a été effectué pour
34 tumeurs. À partir du mois de janvier 2011, et pour
chaque pathologie (ADCBP, métastase d’adénocarcinome
colique, CPT et mélanome malin), deux échantillons d’un
même patient ont été analysés chaque mois (si la taille
du prélèvement le permettait) (contrôle interne de qualité
« échantillon »), et un même prélèvement a été contrôlé
de façon indépendante par deux techniciens une fois par
mois (contrôle interne de qualité « technicien »). Les résul-
tats obtenus sur le pyroséquenceur pour le gène de l’EGFR
ont été systématiquement contrôlés par séquençage direct
lors du deuxième trimestre 2011, puis un résultat positif et
un résultat négatif de mutation sur le gène de l’EGFR ont
été ensuite contrôlés une fois par mois (contrôle interne de
qualité « méthode »).
E. Long et al.
Contrôles interlaboratoires
Pour l’année 2010, le nombre de contrôles interlaboratoires
pour les mutations des gènes de l’EGFR, de KRAS et de BRAF
a été important compte tenu de la mise en place du secteur
de pathologie moléculaire. Ces contrôles interlaboratoires
ont été réalisés, soit en utilisant la même technique de
détection de la mutation (à partir de d’ADN déjà extrait,
ou à partir de l’échantillon primaire et après une nouvelle
extraction sur le laboratoire contrôlant les résultats), soit en
utilisant une ou plusieurs techniques différentes de détec-
tion de la mutation. Ainsi, pour la recherche de mutation
sur l’un des quatre exons du gène EGFR, les laboratoires
externes ont utilisés la technique de séquençage direct. Pour
la recherche des mutations du gène KRAS, les méthodes de
détection réalisées dans les laboratoires externes étaient
soient identiques à celles effectués dans le laboratoire
(séquençage direct et pyroséquençage) soient différentes
(SNaPshot® , Taqman® ). Les laboratoires externes ayant par-
ticipé à ces contrôles interlaboratoires ont été :
• le laboratoire de génétique des tumeurs solides
(Dr Florence Pedeutour, CHU de Nice);
• l’International Agency for Research Cancer
(Dr Pierre Hainaut, Lyon), le laboratoire de patholo-
gie du CHU de Rouen (Dr A Lamy et Pr JC Sabourin), le
laboratoire de pathologie de l’hôpital Erasme à Bruxelles
(Dr Isabelle Salmon), et le Laboratoire de Transfert de
l’Institut Gustave Roussy (Dr Ludovic Lacroix).
Pour la recherche des mutations du gène KRAS, le LPCE
a participé au test d’assurance qualité européen (« EQA
scheme ») en 2010 et en 2011. Pour l’année 2011, une
tumeur mutée et une tumeur non mutée, pour chaque
pathologie et pour chaque gène (KRAS, EGFR, BRAF), ont été
adressées tous les mois en contrôle à un laboratoire externe.
Les principaux contrôles sont résumés dans le Tableau 2.
Analyse des concordances
Cette analyse a été réalisée pour les résultats des contrôles
intralaboratoires et interlaboratoires.
Prescription des examens de pathologie
moléculaire, stratégie, arbre décisionnel et
délai de rendu des résultats
La prescription des examens de pathologie moléculaire est
faite par un pathologiste ayant fait le diagnostic histo-
logique et/ou par le clinicien responsable du patient. La
demande d’examen de pathologie moléculaire est transmise
au secteur de biologie moléculaire avec un certain nombre
d’informations associées concernant le patient, la date du
prélèvement et le (s) type (s) de mutation (s) à rechercher
(Fig. 3).
En ce qui concerne les altérations génomiques à recher-
cher dans les cancers du poumon non à petites cellules,
nous avons adopté l’arbre décisionnel suivant en accord
avec les prescripteurs (Fig. 4) : les recherches de muta-
tions ont été effectuées uniquement lorsque le diagnostic
d’ADCBP était posé sauf demande expresse et justifiée par
les prescripteurs pour un autre sous-type histologique ou un
contexte clinique particulier (âge jeune, patient non taba-
gique). La recherche des mutations des gènes de l’EGFR,
de KRAS et de PI3KA a été réalisée systématiquement de
façon synchrone. En l’absence de mutation, la recherche
d’un réarrangement de EML4-ALK a été réalisée par une
technique d’hybridation in situ en fluorescence FISH. Une
Création d’un secteur de pathologie moléculaire
Figure 1. Circuit d’analyse et de validation d’un examen de pathologie moléculaire.
Analysis and validation workflow of a molecular pathology test.
analyse immuno-histochimique avec un anticorps anti-ALK
a été réalisée systématiquement d’emblée en cas de dia-
gnostic d’ADCBP suivi d’une analyse par FISH sans attendre
les résultats des mutations sur les gènes de l’EGFR et de
KRAS. La recherche des mutations de BRAF est ensuite réa-
lisée en cas d’absence de mutations et de réarrangement
détectés précédemment. Une recherche de mutation du
gène HER2 est ensuite réalisée en l’absence de mutation
détectée.
Un certain nombre d’informations présentes sur la fiche
de prescription et sur le compte rendu de pathologie molé-
culaire permet d’apprécier les délais de transmission des
résultats et les délais pouvant exister entre différentes
étapes :
• délai entre le prélèvement et la prescription par le patho-
logiste et/ou le clinicien ;
• délai entre la prescription et la transmission de
l’échantillon au secteur de pathologie moléculaire ;
• délai entre la réception de l’échantillon dans le secteur de
pathologie moléculaire et la signature du compte rendu
et sa mise à disposition.
Ces délais ont été analysés de façon comparative pour
des échantillons provenant du secteur libéral et du secteur
hospitalier.
Résultats
Tumeurs analysées
En 2010, 80 ADCBP ont été analysés, correspondant à
75 pièces opératoires (dont 70 tumeurs congelées) et cinq
biopsies bronchiques (toutes fixées) ; 45 CPT ont été analy-
sés (tumeurs congelées). Du premier janvier 2011 au 30 avril
2012, 364 ADCBP ont été adressés au LPCE pour une ana-
lyse moléculaire. 39/364 (10 %) cas ont été réfutés pour
29
cette analyse compte tenu d’un pourcentage de cellules
tumorales trop faible (< 5 %), d’un matériel entièrement
nécrotique ou plus exceptionnellement d’un diagnostic his-
tologique non adapté à la demande de la mutation (erreur
d’identification du bloc de paraffine adressé). L’analyse
a concerné 155 pièces opératoires (75 tissus congelés),
198 biopsies bronchiques (dont 16 biopsies congelées) et
11 culots cellulaires (réalisés à partir d’aspiration bron-
chique). Dans la même période, 58 CPT (dont 39 tumeurs
congelées) ont été analysés ainsi que 110 mélanomes malins
(dont 45 tumeurs congelées).
Altérations génomiques observées
L’ensemble des résultats obtenus et le détail des mutations
par pathologie d’organe sont indiqués dans le Tableau 3.
En 2010, 11 % des ADCBP présentaient une mutation du
gène de l’EGFR, correspondant dans 8 % des cas à une muta-
tion sur l’exon 19 et dans 3 % des cas à une mutation sur
l’exon 21. Trente-cinq pour cent des ADCBP présentaient une
mutation sur le gène KRAS, avec une majorité des mutations
sur le codon 12. Ces mutations étaient toujours exclusives.
De 2011 à 2012, 17,2 % des ADCBP présentaient une mutation
du gène de l’EGFR (10,5 % des cas sur l’exon 19 et 5,7 % des
cas sur l’exon 21). Parmi les ADCBP, 33,1 % montraient une
mutation exclusive sur le gène KRAS. Quatorze tumeurs non
mutées pour l’EGFR, KRAS et PI3KA montraient une muta-
tion du gène BRAF (V600E [six cas] ; G469 [sept cas] ; G466
[un cas]). Le réarrangement du gène ALK était présent chez
13,7 % des patients sélectionnés non mutés sur les gènes
EGFR, KRAS et PI3KA. 22/41 (54,4 %) des CPT étaient mutés
sur le gène BRAF (100 % des cas sur V600E). Quarante-deux
pour cent des mélanomes étaient mutés sur le gène BRAF
(41 V600E ; 1 V600 K). Une seule mutation sur le gène KIT
(exon 13) a été observée. De 2011 à 2012, 3,5 % des patients
présentaient une mutation du gène P13KA et 1, 5 % du gène
HER2.
30 E. Long et al.

Figure 2. Exemple de compte rendu de résultat d’un test de mutation somatique au sein du laboratoire de pathologie clinique et
expérimentale.
Example of a somatic mutation test report from the LPCE.

Absence de résultats • l’absence ou à quantité trop faible d’ADN avec

l’impossibilité de réaliser une amplification par PCR
Pour l’ensemble des analyses demandées en (15 cas [1,7 %]) ;
2011/2012 aucun résultat n’a pu être obtenu pour 42/887 • l’impossibilité d’une analyse correcte des séquences (exa-
(5 %) des tumeurs prises en charge sur la plateforme de men non interprétable) (15 cas [1,7 %]) ;
pathologie moléculaire du LPCE. • une mauvaise qualité de l’ADN (hyperfixation, fixateur
Cela correspondait à : non formolé) (12 cas [1,3 %]).
Création d’un secteur de pathologie moléculaire 31

Tableau 2 Différents contrôles intra et interlaboratoires et analyse des concordances.

Laboratory controls and analyse of concordances.
A. Contrôles intralaboratoire concernant les échantillons (année 2010)
Gène Nombre de tests réalisés Nombre de tests concordants % concordance
EGFR 5 5 100
KRAS 5 5 100
BRAF 2 2 100

B. Contrôles intralaboratoire concernant les techniciens (année 2010)

Gène Nombre de tests réalisés Nombre de tests concordants % concordance

EGFR 13 13 100
KRAS 12 12 100
BRAF 9 9 100

C. Contrôles intralaboratoire concernant les méthodes d’analyse sur le gène de l’EGFR (année 2010)

Séquençage versus pyroséquençage gène EGFR

n = 39 patients Exon 18 Exon 19 Exon 20 Exon 21

Résultats concordants 33 34 37 30
Résultats impossibles en séquençage directa 6 5 1 9
Discordanceb 0 0 1 0
Concordance (par exon) 85 % 87 % 95 % 77 %
Total 86 %

D. Contrôles interlaboratoires (année 2010)

Gène Technique utilisée Nombre Technique du Résultats % concordance
au LPCE de tests laboratoire externe concordants
EGFR (Exons 18, 19, 20 et 21) Séquençage direct 30 Séquençage direct 30 100
KRAS (Codons 12—13 et 61) Séquençage direct 22 Snapshot 22 100
Séquençage direct 19 Séquençage direct 19
BRAF (Exon 15) Séquençage direct 16 TaqMan 15 97
CIQ : contrôle interne de qualité.
a Résultats non interprétables par séquençage direct mais analysables par pyroséquençage.
b Mutation rare (insertion c.2301ins9 ; p.A767 S768insAASVD) non analysée par la technique de pyroséquençage.

L’absence ou la quantité trop faible d’ADN était liée dans
les 15 cas observés à une cellularité en cellules tumorales
insuffisante par rapport à l’ensemble des cellules observées
sur le prélèvement (généralement inférieur à 5 %) ou à un
très faible nombre de cellules tumorales.
l’analyse du test KRAS (codons 12, 13 et 61) dans le cadre
des l’EQA 2010, 2011 et 2012 nous avons obtenu 100 % de
concordance. Les principaux résultats sont résumés dans le
Tableau 2.

Délai de rendu des résultats

Analyse des concordances
Dans le cadre des contrôles intralaboratoires et pour
l’année 2010, le contrôle effectué de façon systématique
sur deux échantillons d’un même patient et en utilisant la
même technique montre 100 % de concordance. Les résul-
tats obtenus par deux techniques différentes (séquençage
direct et pyroséquençage) montrent 100 % de concordance
pour les recherches de mutations sur le gène KRAS, 100 % de
concordance pour les recherches de mutations sur le gène
BRAF, et 86 % de concordance pour la recherche de mutation
sur le gène EGFR.
Dans le cadre des contrôles interlaboratoires : la concor-
dance a été de 100 % pour le gène de l’EGFR, de 100 %
pour le gène KRAS et de 97 % pour le gène BRAF (écart
lié aux différences intertechniques : méthode globale ver-
sus méthode ciblée de détection des mutations). Pour
Pour les prélèvements provenant du secteur libéral, le
délai entre la prescription et la transmission des résultats
aux prescripteurs a été en moyenne de 17 jours (écart :
6—35 jours) pour les gènes EGFR et KRAS respectivement.
Pour les prélèvements provenant du secteur hospitalier (CHU
de Nice) le délai entre la prescription et la transmission
des résultats aux prescripteurs a été de 11 jours (écart :
3—26) pour EGFR et KRAS (Fig. 5). La différence dans ces
délais s’explique par un délai d’acheminement (déstockage
de l’échantillon et transfert au laboratoire central) plus
long pour les prélèvements du secteur libéral. Ainsi, le délai
moyen entre la prescription et l’enregistrement au labora-
toire était de neuf jours pour le secteur libéral et de deux
jours pour le secteur hospitalier. L’ensemble des délais de
transmission des résultats selon la mutation recherchée est
indiqué sur la Fig. 5.
32
Figure 3. Fiche de prescription pour une demande de pathologie moléculaire formulée au laboratoire de pathologie clinique et expéri-
mentale.
Prescription form for a molecular biology analysis requested to the LPCE.
Commentaires
Afin de répondre aux différents appels à projet de l’INCa
orientés sur les tests de détection des altérations molé-
culaires en oncologie et pour faire face aux demandes
croissantes des oncologues de la région niçoise, nous avons
développé à partir de 2010 une activité de diagnostic
moléculaire au sein de notre laboratoire d’anatomie patho-
logique. Nous avons alors orienté notre activité de biologie
moléculaire (ou pathologie moléculaire) sur les pathologies
tumorales gérées sur le plan du diagnostic morphologique
au sein du LPCE. En effet, ces différentes pathologies
peuvent bénéficier de thérapies ciblées avec des molé-
cules ayant obtenu une AMM ou bien utilisées dans le cadre
d’essais cliniques [15—24]. Nous avons procédé selon deux
schémas directeurs successifs, avec une première année
(2010) au cours de laquelle nous avons réalisé de nom-
breux contrôles de qualité intralaboratoire (intertechniciens
E. Long et al.
et intertechniques) et interlaboratoires. Cette procédure
contraignante a permis de faire ensuite des analyses de
concordance, et compte tenu des résultats obtenus, nous
avons dans un deuxième temps « allégé » notre mode de
fonctionnement à partir de janvier 2011. Nous avons observé
une augmentation constante de l’activité entre le mois jan-
vier 2010 et le mois de mars 2012 (en particulier pour la
recherche des altérations génomiques des cancers pulmo-
naires). Cette augmentation de l’activité a été le reflet de :
• transmission plus importante des prélèvements en prove-
nance du secteur libéral ;
• l’augmentation du nombre des biomarqueurs molécu-
laires à analyser suite au deuxième appel à projet 2010 de
l’INCa portant sur les biomarqeurs émergeants.
Pour répondre à l’établissement et au maintien des cri-
tères de qualité, nous avons limité le nombre d’altérations
génomiques à rechercher dans trois pathologies d’organe
Création d’un secteur de pathologie moléculaire
Figure 4. Arbre décisionnel pour la recherche d’une altération génomique au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale.
Diagnostic flow chart for the detection of genomic alterations at the LPCE.
(cancer du poumon, cancer de la thyroïde et méla-
nome malin). Hormis la recherche des mutations par
pyroséquençage, nous avons inclus au sein du secteur de
pathologie moléculaire, la technique FISH, bien que cette
technique puisse être considérée par certains praticiens
être « hors champ » d’un secteur de pathologie moléculaire.
L’ensemble des résultats obtenus au sein de notre labora-
toire est sensiblement comparable à celui décrit dans la
plupart des publications réalisées sur ce sujet en ce qui
concerne les types de mutations détectés selon la pathologie
d’organe [2,4,8,9,11,13,18,19,23,24]. Toutefois, si le pour-
centage de mutations détectées dans les mélanomes malins
et les CPT sont similaires à ceux rapportés dans la littéra-
ture, le pourcentage des différentes altérations génomiques
trouvées dans les ADCBP est globalement plus élevé, en par-
ticulier pour EML4-ALK et pour BRAF. Ceci peut s’expliquer
par le fait que tous les échantillons reçus sur la plateforme
n’ont pas été analysés et qu’un certain nombre de prélève-
ments a été écarté compte tenu d’une mauvaise qualité. La
33
deuxième explication tient à l’enrichissement de la popula-
tion analysée pour le réarrangement de EML4-ALK et pour
la mutation de BRAF, puisque seuls les patients non mutés
pour EGFR (sur les quatre exons 18, 19, 20 et 21) et KRAS
(sur les codons 12, 13 et 61) ont été analysés.
L’activité de pathologie moléculaire nécessite une ges-
tion optimale des processus et impose de s’intégrer
rapidement dans une démarche d’accréditation. Nous avons
choisi pour le secteur de « pathologie moléculaire », une
accréditation selon une norme ISO 15189. Cette norme est
utilisée pour l’accréditation des actes de « biologie médi-
cale » dans le cadre des activités de soin. Il n’existe pas
en fait de norme ISO parfaitement adaptée à l’activité
de « pathologie moléculaire », et certaines étapes devant
conduire à l’obtention de cette accréditation sont diffi-
ciles à franchir. Ainsi dans certains pays (États-Unis, Grande
Bretagne), l’accréditation de la pathologie moléculaire
n’utilise pas cette norme et ce sont les organismes natio-
naux qui délivrent les autorisations de réaliser les tests
34 E. Long et al.

Tableau 3 Altérations génomiques détectées selon la pathologie d’organe (janvier 2010—avril 2012).
Genomic alterations assessed according to tumor type (January 2010—April 2012).
Gène Total WT Muté Non interprétable Distribution des mutations
n (%) n (%) n (%) n (%)
Adénocarcinome EGFR 325 260 (80) 54 (17) 11 (3) Exon 18 : 3 (6)
pulmonaire Exon 19 : 33 (61)
Exon 21 : 18 (33)
KRAS 324 210 (65) 104 (32) 10 (3) Exon 2 (Codon 12) : 93 (89)
Exon 2 (Codon 13) : 6 (6)
Exon 3 (Codon 61) : 5 (5)
BRAFa 148 133 (90) 14 (9) 1 (1) Exon 11 : 8 (57)
Exon 15 : 6 (43)
Pi3KCA 90 82 (91) 3 (3) 5 (6) Exon 9 : 3 (100)
Exon 20 : 0 (0)
ALKb 110 88 (80) 14 (13) 8 (7) NA
HER2 98 88 (90) 1 (1) 9 (9) Exon 20 : 1 (100)
Carcinome papillaire BRAF 58 26 (45) 31 (53) 1 (2) Exon 15 : 31 (100)
de la thyroïde
Mélanome malin BRAF 104 58 (56) 42 (40) 4 (4) Exon 11 : 1 (2)
Exon 15 : 41 (98)
KIT 33 30 (91) 1 (3) 2 (6) Exon 13 : 1 (100)
a Ces résultats sont obtenus à partir d’une population tumorale sélectionnée EGFR, KRAS, PI3KA, non mutés.
b Ces résultats (translocation ou non de ALK) sont obtenus à partir d’une population tumorale sélectionnée EGFR, KRAS, PI3KA, BRAF
non mutés.

Figure 5. Délais de rendu des résultats de biologie moléculaire au sein du laboratoire de pathologie clinique et expérimentale selon
l’origine de la prescription (secteur libéral versus secteur hospitalier).
The turn around time for molecular biology results at the LPCE according to the source of prescription (private sector versus university
healthcare institution).
Création d’un secteur de pathologie moléculaire 35

moléculaires. La difficulté d’une démarche d’accréditation des réseaux moléculaires à identifier au sein d’une tumeur
en « pathologie moléculaire » est liée d’une part à sa spécifi- combinée à des échantillons tumoraux de taille de plus en
cité technique combinant souvent des techniques manuelles plus réduite (compte tenu de gestes de moins en moins
et automatisées et d’autre part au manque d’informations invasifs) sur lesquels un diagnostic morphologique optimal
précises sur la mise en œuvre organisationnelle, technique peut devenir plus difficile [28], vont imposer une optimisa-
et méthodologique accessible dans la littérature scientifique tion des méthodes de détection des altérations génomiques.
concernant cette activité. Lors de la mise en place de notre Ainsi les nouvelles techniques de séquençage (next genera-
démarche d’accréditation nous avons défini une politique tion sequencing ou NGS) devraient permettre des détections
qualité orientée sur trois grandes directions : mutationnelles multiples à partir de l’ADN de plusieurs
• amélioration de l’organisation et de la communication ; patients dans un même temps et à partir d’échantillons de
• satisfaction des clients ; petite taille [29,30]. Ces techniques doivent aussi autori-
• qualité de l’instrumentation et des réactifs. ser une diminution du temps d’analyse afin d’obtenir les
résultats plus rapidement. Un des écueils possibles de ces
Nous avons ainsi ciblé des objectifs mesurables avec des
analyses à haut ou moyen débit risque d’être la qualité
indicateurs de performance. La maîtrise de la phase pré-
de l’ADN après fixation formolée et inclusion en paraffine.
analytique est un élément déterminant pour l’obtention de
Cependant certaines études récentes montrent toutefois de
l’accréditation selon la norme ISO 15189. Si cette phase
très bons résultats avec ces méthodes sur de l’ADN extrait de
préanalytique peut être bien contrôlée pour les analyses bio-
tissus fixés [31]. Un des éléments le plus contraignant sera
logiques, la maîtrise de cette phase dans l’environnement
de pouvoir analyser une quantité suffisante d’ADN extrait
d’un laboratoire de pathologie est plus difficile, car elle
à partir du matériel biologique, le seuil étant le plus sou-
fait intervenir de nombreux paramètres dont certains sont
vent fixé à 10 ng d’ADN. Il faudra certainement réaliser
extérieurs à l’enceinte du laboratoire (bloc opératoire ou
des contrôles de qualité de l’ADN avant toute analyse par
d’endoscopie, service clinique, acheminement des prélè-
NGS et faire aussi des tests comparatifs initiaux avec les
vements jusqu’au laboratoire) [6,25]. D’autres éléments
résultats obtenus sur de l’ADN extrait de matériel tissulaire
de cette phase préanalytique doivent être gérés au sein
congelé. À cette complexité méthodologique (qui néces-
du laboratoire d’anatomie pathologique et ont été précé-
sitera l’émergence rapide de nouvelles compétences dans
demment détaillés [6]. Nous avons créé un fonctionnement
les laboratoires hospitaliers, comme l’expertise bioinfor-
associant les départements cliniques et chirurgicaux reliés
matique), s’ajoute aussi la complexité tumorale avec une
par des pneumatiques au laboratoire d’anatomie patholo-
grande hétérogénéité des mutations selon la cartographie
gique [26]. La grande majorité des prélèvements (pièces
réalisée dans une même tumeur [32]. Ainsi, le concept de
opératoires, biopsies chirurgicales, biopsies bronchiques)
médecine personnalisée doit aussi intégrer les difficultés
arrive par les pneumatiques au laboratoire permettant
actuelles pour cerner avec certitude le profil mutationnel
ainsi leur gestion immédiate (fixation ou congélation) par
de l’ensemble d’une tumeur [32].
les pathologistes en association avec l’équipe technique.
L’avenir d’un secteur de pathologie moléculaire dans
L’organisation mise en place conduit à une prise en charge
un laboratoire d’anatomie pathologique devra aussi tenir
multidisciplinaire associant la pathologie clinique, la bio-
compte des nouveaux développements dans le domaine
banque et la pathologie moléculaire. Ce fonctionnement
de l’immuno-histochimie avec l’arrivée d’anticorps pouvant
conduit à transmettre les résultats de pathologie molécu-
mettre en évidence les mutations et les réarrangements
laire dans un délai optimal aboutissant ainsi à une meilleure
génomiques (par exemple avec les anticorps anti-ALK, anti-
prise en charge thérapeutique.
EGFR [pouvant reconnaître les formes mutées du gène de
Dans la démarche d’accréditation, il est primordial
l’EGFR] ou anti-BRAF) [33—37]. C’est dans ce contexte que
d’effectuer des contrôles de qualité intra- et interlabo-
la confrontation précise des signaux obtenus sur une ana-
ratoires. Ces contrôles doivent concerner chaque gène et
lyse histologique avec les résultats de biologie moléculaire
chaque mutation d’intérêt recherchée, en les adaptant
« classique » s’avère incontournable [33—37]. La présence
à la pathologie d’organe. Les contrôles interlaboratoires
de pathologistes ayant une compétence en biologie molé-
peuvent être réalisés ou non en utilisant les mêmes tech-
culaire sera l’une des garanties de l’utilisation optimale de
niques d’analyse, ce qui peut permettre de comparer les
ces anticorps et d’une bonne interprétation des résultats.
sensibilités des méthodes, notamment en fonction du pour-
Au-delà de l’apport dans le cadre de l’offre de soin
centage de cellules tumorales présent dans l’échantillon à
aux patients, on ne peut ignorer le fait que l’intégration
analyser. Les contrôles de qualité doivent se faire sur toutes
d’un secteur de pathologie moléculaire dans les laboratoires
les étapes (préanalytique, analytique et postanalytique) du
d’anatomie pathologique doit permettre à la nouvelle géné-
processus, mais en particulier depuis la prise en charge
ration de pathologistes, l’acquisition d’une nouvelle culture
initiale du tissu jusqu’à la détermination des altérations
en biologie et de nouvelles connaissances dans la physiopa-
génomiques. Les contrôles externes de qualité bénéficient
thologie du cancer au bénéfice des futurs patients [38—43].
de la mise en place de tests nationaux et européens qui
Enfin, la possibilité d’établir un lien étroit avec une bio-
permettent au laboratoire qui y participe d’obtenir une cer-
banque, idéalement au sein d’un même laboratoire, doit
tification et une reconnaissance objective [27].
permettre également de renforcer l’optimisation d’un sec-
L’évolution constante des nouvelles thérapies ciblées
teur de pathologie moléculaire et de faire naître le concept
dans le domaine de l’oncologie, leur éventuelle combinaison
de « pathologie intégrative » dans les hôpitaux [39,44,45].
adaptée à la présence de plusieurs mutations simultané-
Ce concept de « pathologie intégrative » ou de biopathologie
ment présentes dans la même tumeur, laissent envisager
pourra associer les données moléculaires, la morphologie en
le transfert à court dans le secteur de l’offre de soin de
pathologie clinique et la gestion des différentes collections
nouvelles technologies d’extraction des acides nucléiques et
biologiques.
aussi de l’analyse des altérations génomiques. La complexité
36
Déclaration d’intérêts
Paul Hofman est consultant pour Qiagen (Hilden, Alle-
magne). Les autres auteurs déclarent ne pas avoir de conflits
d’intérêts en relation avec cet article.
Remerciements
Les auteurs remercient l’Institut national du cancer pour
l’aide financière à la mise en place des tests de bio-
logie moléculaire au sein du LPCE. Nous remercions les
personnes ayant accepté de participer aux contrôles interla-
boratoires : Dr Florence Pedeutour (laboratoire de génétique
des tumeurs solides, faculte de médecine de Nice),
Dr Pierre Hainaut (département de pathologie moléculaire,
IARC, Lyon), Dr Ludovic Lacroix (laboratoire de transfert,
institut Gustave Roussy, Villejuif), Dr Aude Lamy (laboratoire
de pathologie, CHU de Rouen), Dr Isabelle Salmon (labora-
toire de pathologie, hôpital Erasme, Bruxelles).
Appendix A. Matériel complémentaire
Le matériel complémentaire accompagnant la version
en ligne de cet article est disponible sur http://www.
sciencedirect.com et http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.
2012.12.003.
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