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Cromossomos são os portadores dos genes

Cell 201
Genética molecular. O DNA
1869: Friedrich Miescher descobre o ácido desoxirribonucléico (DNA)

Friedrich Miescher
Genética molecular. O DNA é o material hereditária

Na década de 1940 pensava-


se que o DNA era
simplesmente um longo
polímero composto de apenas
quatro tipos de subunidades.
Como portador da informação
hereditária foram favorecidos
as proteínas.

Knippers 17
Genética molecular. A DNA é o material hereditária

Oswald Avery
1877-1955

Fundamentos 187
Genética molecular. A DNA é o material hereditária

1944: Experimentos com a


transformação de bactérias
mostram que genes consistem de
DNA.

Oswald Avery consegui de


transformar bactérias com a DNA
de uma outra linha bacterial

Fundamentos 187
“The dark Lady of the DNA”

Linus Carl Pauling Rosalind Franklin 1920-1958


1901-1994
Genética molecular. A corrida pela estrutura do DNA.

Rosalind Franklin fez o doutorado na Ingla Terra em química física.


1947: Ela começou de trabalhar no laboratório de Jaques Mering em Paris e
foi considerado mais tarde como maior especialista na área de trabalho
com difração de raios X.
1950: Ela começou de trabalhar no King´s College, London juntos com
Maurice Wilkins no laboratório de John Randall

Fundamentos 167
Genética molecular. A corrida pela estrutura do DNA.

1952: Watson e Crick mostram um modelo de três hélices. Franklin mostra


que é um modelo errado. Ela proclamou a hipótese que as bases da
DNA são no lado interno da hélice
1953: Maurice Wilkins entregou fotos de raios X da DNA, feito de Franklin,
sem o conhecimento dela, à Watson e Crick.
23 de Fevereiro: Noticias mostram que Franklin sabe que a DNA consiste
de hélices duplas

28 de Fevereiro: Watson e Crick concluíram que a DNA é o carregador do


código genético
Watson e Crick publicaram três artigos sobre a estrutura da DNA
„ We have also been stimulated by a knowledge of the general
nature of the unpublished experimental results and ideas of Dr. M. H.
F. Wilkins, Dr. R. E. Franklin and their co-workers at King's College,
London“ Nature, April 1953

Numa outra publicação, na mesma edição, Wilkins, Fanklin et al.,


confirmaram os dados de Watson e Crick.
Genética molecular. A corrida pela estrutura do DNA.

1958: Rosalind Franklin morre de câncer


1962: Watson e Crick recebem o preço Nobel sem mencionar a
contribuição de Franklin
1968: Watson publica o livro “A hélice dupla” e admitiu de ter sabido de
dados de Franklin
1982: Aaron Klug recebe o preço Nobel e homenageou Franklin na
apresentação em Stockholm

James Watson 2006 Rosalind Franklin


1920-1958
Genética molecular. A estrutura do DNA. Watson e Crick
1953: O DNA gira em dupla hélice consistindo de duas fitas antiparalelas

James Watson and Francis Crick, 1953.


Preço Nobel 1962
Genética molecular. A estrutura do DNA
DNA:
“ácido desoxirribonucléico”
(“Desoxyribonucleinacid”)
consiste de duas longas
cadeias polinucleotídicas
compostas de quatro tipos de
subunidades de nucleotídeos.

Cada uma dessas cadeias é


conhecida como uma fita de
DNA.

Os nucleotídeos são
compostos de um açúcar de
cinco carbonos ao qual estão
ligados um ou mais grupos
fosfatos e uma base contendo
nitrogênio
Fundamentos 188
Genética molecular. A estrutura do DNA
Os nucleotídeos são ligados ........
1. covalentemente em uma cadeia por meio dos açúcares e fosfatos
formando um esqueleto de fosfato-açúcar-fosfato-açúcar alternados.
2. por pontes de hidrogênio entre as bases pareadas

Apenas a base é que difere


em cada um dos quatro tipos
de nucleotídeos. O
“esqueleto” do DNA.
consistindo de fosfato e
açúcar é igual em cada
nucleotídeo.

Adenina pareia com Timina


Citosina pareia com Guanina

Fundamentos 189
Genética molecular. A estrutura do DNA

Cada fita tem uma polaridade química: Os nucleotídeos são ligados por
ligações pelo grupo 3`-hidroxilo (-OH) de um açúcar e o 5`-fosfato (P) do
próximo.

Purinas: As
bases com dois
anéis, Adenina
e Guanina

Pirimidinas: As
bases com um
anel, Citosina e
Timina

Fundamentos 189
Genética molecular. O DNA é o carregador de uma informação linear

Como a informação pode estar sob uma forma química ?


Como esta informação é traduzido?
O DNA é uma mensagem linear com 4 letras (A, C, G, T). As quatro letras
codificam as informações.
O DNA codifica proteínas e alem disso instruções da leitura. As proteínas
consistem de 20 aminoácidos

Fundamentos 190
Genética molecular. O DNA é o carregador de uma informação linear

Em qual células genes são exprimidos em forma de proteínas??


Qual genes são exprimidos ?
Quanto as genes são exprimidos ?
Quantas copias destes genes são exprimidas ?

Cell 202
Genética molecular. O DNA é o carregador de uma informação linear

Genoma: O conjunto completo de


informações de DNA de um
organismo.
Se cada par de bases teria um
comprimento de 1 mm, o DNA
humana, consistindo de 3 x 109,
nucleotídeos se estende 3200 km.

Uma célula humana contem 1 metro


de DNA.

A seqüência completa de DNA do


genoma humano preencheria mais de
1000 livros com 750 paginas.
Cell 203
Genética molecular. Replicação do DNA
Cada fita de DNA contém uma seqüência de nucleotídeos que é
complementar á seqüência da sua fita parceira.
Cada fita pode servir como molde na replicação da fita complementaria

Para a síntese de novas fitas as duas


fitas originais se separam

Fundamentos
191, 192
Genética molecular. Replicação do DNA
Células são capazes de duplicar seus
cromossomos e distribuir igualmente para as
células filhas.
Em cerca de 8 horas uma célula animal em
divisão irá copiar o equivalente de 1000 livros
com apenas, na media, uma única ou duas
letras erradas !

Cada dupla hélice-filha termina com uma fita


original.
Um conjunto de proteínas forma uma
“maquina de replicação”

Fundamentos 192
Genética molecular. Replicação do DNA
Proteínas iniciadores que se ligam ao DNA e quebram os pontes de
hidrogênio entre as bases.
Os locais onde a DNA é aberto primeiro são chamados origens de
replicação. Os origens de replicação são marcados por uma seqüência
particular de nucleotídeos ricos em A-T
Fundamentos 193
Bactérias tem um único origem
de replicação enquanto
humanos tem
aproximadamente 10.000 de
tais origens no genoma inteiro.
Uma proteína
iniciadora liga-
se ao DNA
abrindo a dupla
hélice e atraia
outras proteínas
formando a
maquina de
replicação.
Genética molecular. Replicação do DNA
Na microscopia eletrônica é possível de visualizar as forquilhas de
replicação. A máquina de replicação se move ao longo do DNA.

Duas forquilhas de
replicação são
formadas a partir
de cada origem de
replicação
movendo-se
bidirecional cerca
de 100 pares de
bases por segundo
no homem.

Fundamentos 193
Genética molecular. Replicação do DNA
A DNA-polimerase catalisa a
adição de nucleotídeos à
extremidade 3´ de uma fita de
DNA. A enzima catalisa a
ligação fosfodiéster entre a
extremidade 3´e o grupo 5´-
fosfato do nucleotídeo que está
sendo incorporado.

A liberação de energia pela


formação de pirofosfato (Ppi) é
usado pela DNA-polimerase na
formação da ligação

A DNA-polimerase não se
dissocia da DNA mas move-se
ao longo dele.

Fundamentos 194
Genética molecular. Replicação do DNA
Uma nova fita de DNA é feita na direção 5 → 3`. A DNA-polimerase
trabalha apenas nessa direção
A fita retardada é feito descontinuamente, em pequenos pedaços
separados e sucessivos. A fita-líder é sintetizada continuamente.

Fundamentos
195
Genética molecular. Replicação do DNA
A DNA-polimerase é tão fiel que ela comete
apenas cerca de um erro a cada 107 pares de
nucleotídeo replicados.

Ela tem um mecanismo de verificação


(“proofreading”). A DNA-polimerase corta a
ligação fosfodiéster do nucleotídeo malpareado,
antes de adicionar o próximo nucleotídeo.

A DNA-Polimerase possui tanto uma atividade


de polimerização 5` → 3` como uma atividade
de nuclease 3´ → 5´

Fundamentos 196
Genética molecular. Replicação do DNA

Uma DNA-polimerase
hipotética que sintetizasse
na direção 3´ → 5´ seria
incapaz de verificação: Se
ela removesse um
nucleotídeo mal pareado
ela criaria uma extremidade
que é quimicamente morta.

Fundamentos 197
Genética molecular. Replicação do DNA
A DNA-polimerase no pode iniciar a formação de
uma fita completamente nova.
Uma RNA, a RNA iniciador, (ácido ribonucléico)
consistindo de 10 nucleotídeos se liga á fita molde
e serve como primer (iniciador). A RNA fornece
uma extremidade 3´ para a DNA-polimerase.

A RNA é sintetizado sobre a fita de DNA pelo


pareamento de bases complementares. Ao lado
de timina a RNA contem uracila que é pareado
com adenina. O açúcar da RNA é a ribose em vez
da desoxirribose.

Fragmentos de DNA na fita retardada se chama


fragmentos de Okazaki.
1. Uma nuclease degrada a RNA iniciador
2. A Polimerase de reparo substitua a RNA por
DNA.
3. A DNA-Ligase une os 3´e 5´de fragmentos de
DNA.
Fundamentos 569
Genética molecular. Replicação do DNA
A helicase usa ATP para correr ao longo do DNA abrindo a dupla hélice.
A “proteína de ligação à fita simples” une-se à fita exposto e impede de
formar novamente o pareamento de bases.
O “grampo deslizante” mantém a DNA-polimerase firmemente ligada à fita
molde e libera a DNA-polimerase apos a síntese de um fragmento de
Okazaki

Fundamentos
199
Como a replicação proceda de forma sincrônica em ambos as fitas?
Genética molecular. Replicação do DNA

Fundamentos 200
Genética molecular. Replicação do DNA
Estrutura da DNA-helicase

Cell 246
Genética molecular. Replicação do DNA

Estrutura da proteína de ligação à fita simples

Cell 247
Genética molecular. Replicação do DNA

Estrutura do grampo deslizante

Cell 247
Genética molecular. Polymerase chain reaction (PCR)

Gilbert 96
Genética molecular. Polymerase chain reaction (PCR)

PRIMER

5` TTAAGCAGCGGG...................................................TACGTCCTGCATGTTACC
3` AATTCGTCGCCCCTAGC........... 1000 bases......................GACGTACAATGG

3` 5`

5` 3`
Programa de temperatura, 25-35 ciclos
94° C Separação das fitas
52° C Ligação dos primers com as fitas
72° C Temperatura ótima da enzima Taq polimerase
Genética molecular. Polymerase chain reaction (PCR)
1x x50
H2O: 6,96 !l 348 !l
10 x Buffer: 1,00 !l 50 !l
(20mM) dNTP`s: 1,00 !l 50 !l
(20!M) Primer 1: 0,50 !l 25 !l
(20!M)Primer2: 0,50 !l 25 !l
Taq-Polymerase: 0,04 !l 2!l
Kary B. Mullis, premio Nobel de química 1992, inventou o PCR 1983

Kary B. Mullis