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ENGENHARIA DE ALIMENTOS
GOIÂNIA – 2018
Ana Cristina Bispo de Moura
Bianca Maria Martins Caetano
GOIÂNIA – 2018
Ana Cristina Bispo de Moura
Bianca Maria Martins Caetano
__________________________________________________
Prof. Dr. Gabriel Luis Castiglioni
__________________________________________________
Profª. Drª. Fernanda Ferreira Freitas
__________________________________________________
Engª. Maryanna Moreira Viana
AGRADECIMENTOS
Somos gratas a todos vocês. Muito Obrigada por fazerem parte deste momento!
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 1 ao 4 em culturas
puras com as leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de
fermentação. ............................................................................................................................. 22
Figura 2- Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 5 ao 10 com duas
cepas na proporção de 1:1 das leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h
de fermentação .......................................................................................................................... 29
Figura 3- Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 11 ao 15 com três
e quatro cepas na proporção de 1:1:1 e 1:1:1:1, respectivamente, das leveduras
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação. ............................... 36
Figura 4- Regiões de contorno da resposta concentração de biomassa para a combinação
quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide. ........... 43
Figura 5- Regiões de contorno da resposta concentração de etanol para a combinação
quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide. ........... 44
Figura 6- Regiões de contorno da resposta concentração residual de glicose para a
combinação quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex
centroide. .................................................................................................................................. 45
Figura 7- Regiões de contorno da resposta concentração residual de frutose para a
combinação quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex
centroide. .................................................................................................................................. 46
Figura 8- Regiões de contorno da resposta concentração de glicerol para a combinação
quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide. ........... 47
Figura 9- Regiões de contorno da resposta concentração de ácido acético para a combinação
quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide. ........... 48
iii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Composição do Meio GPY sólido para manutenção das cepas ............................. 11
Quadro 2- Composição química do mosto de uva .................................................................. 12
Quadro 3- Composição química da solução de aminoácidos ................................................. 12
Quadro 4- Composição química da solução de vitaminas ................................................ 13
Quadro 5- Composição química da solução de elementos traços .......................................... 14
Quadro 6- Composição do Meio GPY líquido para manutenção das cepas .......................... 15
iv
LISTA DE EQUAÇÕES
RESUMO
O consumo de vinhos no mundo vem se elevando gradativamente, assim como as
exigências dos consumidores e busca por produtos de altíssima qualidade. Desta forma, as
indústrias vinícolas têm buscado estratégias para o desenvolvimento de vinhos com maior
quantidade de glicerol e redução do teor alcoólico, sendo vinhos mais encorpados e mais
suaves, geralmente aromáticos, características sensoriais de grande apreço por parte dos
consumidores. Neste contexto, foi proposto um delineamento de mistura com quatro cepas
diferentes, sendo duas delas Saccharomyces cerevisiae (MONASTRELL e T73), além da
Saccharomyces kudriavzevii (CR85) e Saccharomyces uvarum (BMV58), visando analisar o
comportamento de cada cepa individualmente e também em co-culturas, identificando
interações entre elas, a partir das respostas dos parâmetros cinéticos (etanol, glicerol, ácido
acético, açúcares residuais e biomassa). O estudo mostrou que as características inerentes das
leveduras e a proporção que as mesmas são analisadas podem influenciar diretamente no
comportamento dos parâmetros cinéticos do cultivo. Apresenta, ainda, de forma detalhada a
cinética de crescimento, consumo de substrato e produção de etanol e metabólitos secundários
de cepas que não haviam sido estudadas anteriormente, como é o caso da BMV58,
recentemente descoberta no ramo da vitivinicultura. A partir do delineamento de mistura,
observou-se que as combinações com três cepas obtiveram os melhores resultados para o
alcance dos objetivos deste trabalho.
ABSTRACT
The consumption of wines in the world has been increasing gradually, as well as the
demands of consumers and search for products of the highest quality. In this way, the wine
industry has sought strategies for the development of wines with a higher amount of glycerol
and a reduction in alcohol content, being wines that are fuller and softer, generally aromatic,
sensorial characteristics that are highly appreciated by consumers. In this context, an
experimental design was proposed from the design of the mixture with four different strains,
two of them Saccharomyces cerevisiae (MONASTRELL and T73), Saccharomyces
kudriavzevii (CR85) and Saccharomyces uvarum (BMV58), in order to analyze the behavior
of each (ethanol, glycerol, acetic acid, residual sugars and biomass), and to identify
interactions among them. The study showed that the inherent characteristics of the yeasts and
the proportion that they are analyzed can directly influence the behavior of the kinetic
parameters of the culture. It also presents in detail the kinetics of growth, substrate
consumption and ethanol production and secondary metabolites of strains that had not been
studied previously, as is the case of BMV58, recently discovered in the wine sector. From the
design of the mixture, it was observed that the combinations with three strains obtained the
best results to reach the objectives of this work.
1. INTRODUÇÃO
O vinho é um produto único que resulta das interações complexas entre fungos
filamentosos, bactérias e leveduras, desde a vinha até ao armazenamento, passando pelo
processo de fermentação (FLEET, 2003). Esta bebida, é um produto natural, fruto de reações
bioquímicas, que se iniciam durante a maturação da uva e se estendem até ao engarrafamento
(ROMANO et al., 2003).
Processo tradicional de obtenção do vinho, a fermentação natural (espontânea) do
mosto de uva é realizada por uma sequência de diferentes espécies de leveduras. Inúmeras
leveduras, como as do gênero Saccharomyces, Kloeckera, Candida, Hansenula,
Hanseniospora, Pichia, Zigossacharomyces, entre outras, fazem parte da microflora da uva e
podem iniciar a fermentação (HEARD; FLEET, 1986).
O crescimento destas leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes
fatores como pH, concentração de nitrogênio e açúcar, concentração de SO2, conteúdo de
álcool e ainda pela temperatura de fermentação (HEARD; FLEET, 1988).
Os processos mais importantes na produção de vinho são a fermentação alcoólica,
conduzida pelas leveduras, e a fermentação malolática, conduzida pelas bactérias láticas
(GENISHEVA et al., 2014). Durante a fermentação alcoólica os açúcares do mosto de uva,
nomeadamente a glucose e a frutose, são transformados, em sua maioria, em etanol, glicerol e
dióxido de carbono (ARANDA et al., 2005). A fermentação malolática, atua como uma
segunda fermentação, que reduz a acidez e leva a uma maior estabilidade a nível biológico
dos vinhos, além de aumentar as características organolépticas deste produto (LONVAUD-
FUNEL, 1999; VERSARI et al., 1999; FUGELSANG e EDWARDS, 2007; LERM et al.,
2010) .
Assim, as principais leveduras causadoras de alterações no vinho são as pertencentes
aos géneros Brettanomyces/Dekkera, Candida, Hanseniaspora, Pichia, Saccharomycodes,
Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces (LOUREIRO; FERREIRA, 2003). Os efeitos
comuns de contaminação são a formação de filmes nos vinhos armazenados, turvação,
produção de sedimentos e gases em vinhos engarrafados e aparecimento de odores e aromas
estranhos (TOIT et al., 2000; LOUREIRO et al., 2003).
Sacharomyces cerevisiae é a levedura dominante ao longo do processo de
fermentação e só é associada a levedura de contaminação quando existe uma re-fermentação
em vinhos engarrafados (LOUREIRO E MALFEITO-FERREIRA, 2003; ENRIQUE et al.,
2007; RODRIGUEZ et al., 2013).
2
2. OBJETIVOS
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 VINHO
3.4 LEVEDURAS
fermentam, com a formação de pouca biomassa e muito etanol, enquanto que, em aerobiose
seu metabolismo é destinado ao crescimento celular.
Dependendo do meio de cultivo, as leveduras apresentam dimensões e formas
variáveis, como ovoides, esféricas ou elipsoidais (PELCZAR JUNIOR et al., 1996). Podem
ser visualizadas isoladas, em pares, cadeia ou cachos. Reproduzem-se vegetativamente por
gemulação, formam esporos ovoides ou esféricos e fermentam vigorosamente (TORTORA et
al., 2012).
A escolha da linhagem apropriada para o processo é de importância fundamental
para o êxito da fermentação. É de grande valia as linhagens que apresentam características
fermentativas, tais como: boa eficiência fermentativa, elevada velocidade de fermentação,
resistência a etanol, eficiência de conversão, resistência a pH baixo, resistência a antissépticos
e estabilidade genética para que as qualidades das leveduras sejam mantidas durante
sucessivos reusos (MENEZES, 1980; SANTOS et al., 2012).
A abordagem do estudo de delineamento de mistura com mosto sintético de uva,
utilizará leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum e
Saccharomyces kudriavzevii, analisando os parâmetros cinéticos e fisiológicos das leveduras.
NADH intracelular a NAD+. Assim, além dessa biomolécula servir como osmorregulador
para as leveduras (VAN DIJKEN e SCHEIRS, 1986), a biossíntese de glicerol em condições
anaeróbias, está principalmente ligada ao metabolismo redox (VAN GULIK e HEIJNEN,
1995).
S. cerevisiae, são bem conhecidas pela sua capacidade de produzir ácido acético sob
condições aeróbias e anaeróbias (PÉTER; ROSA, 2005). Em S. cerevisiae, o metabolismo
adicional do ácido acético é de extrema importância, uma vez que através da acetil-CoA
sintetase, sendo ela a única fonte de acetil-CoA citosólica, produz esse ácido como
componente essencial da biossíntese de ácidos graxos para a levedura (BERG, VAN DEN;
STEENSMA, 1995). Quando o acetaldeído é convertido em ácido acético, produz-se um
excedente redutor. A formação de tal produto levanta um problema adicional no balanço
redox, mais uma vez solucionado pela produção de glicerol (PÉTER; ROSA, 2005).
desejadas, ou simplesmente para avaliar os efeitos ou impactos que os fatores têm nas
respostas desejadas (RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Diferentemente dos planejamentos tradicionais, nos experimentais para o estudo de
misturas, a variável resposta é função somente das proporções relativas dos ingredientes
presentes na mistura e não da quantidade total da mistura. Além disso, as proporções dos
diversos componentes de uma mistura não são independentes e a soma de todos deve totalizar
sempre 100% (BARROS NETO et al., 1995; ZAUBERAS et al., 2004; CAMPOS et al.,
2007). Pode-se, ainda, estabelecer limites inferiores e superiores das proporções dos
componentes nas misturas (BARROS NETO et al., 1995; ZAUBERAS et al., 2004).
Levando em consideração todas essas informações, a abordagem do estudo de
delineamento de mistura com mosto sintético de uva, utilizará leveduras do gênero
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum e Saccharomyces kudriavzevii, analisando
os parâmetros cinéticos e fisiológicos das leveduras.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MICRORGANISMO
Para o repique das cepas, foi preparado meio GPY sólido, conforme mostra o Quadro
1.
11
Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5
Glucose 120
Frutose 120
Acido Málico 6
Concentração
Componente
(g.L-1 )
Concentração
Componente
(g.L-1 )
.A (SIGMA-ALDRICH®) 4,1133
.A (SIGMA-ALDRICH® 4,400
Concentração
Componente
(g.L-1 )
Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5
MONASTRELL
N° do Ensaio (g.L-1 ) T73 (g.L-1 ) BMV58 (g.L-1 ) CR85 (g.L-1 )
4.6 FERMENTAÇÃO
Equação 02
Equação 03
Na qual:
: Concentração celular no início do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração celular no final do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração de etanol no início do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração de etanol no final do intervalo analisado (g.L-1);
: Instante inicial do intervalo analisado (h);
: Instante final do intervalo analisado (h);
O fator de conversão do substrato em células (YX/S) foi calculado pela diferença entre
concentrações iniciais de biomassa e substrato, utilizou-se a Equação 04:
Equação 04
Na qual:
: Concentração celular inicial (g.L-1);
: Concentração celular final (g.L-1);
: Concentração inicial do substrato (g.L-1);
: Concentração residual do substrato (g.L-1);
19
Equação 05
Na qual:
: Concentração final de etanol (g.L-1 );
: Concentração inicial de etanol (g.L-1 );
: Concentração de açúcar final (g.L-1 );
: Concentração inicial de açúcar (g.L-1 );
Na qual:
: Concentração de etanol inicial (g.L-1.h-1 );
: Concentração de etanol final (g.L-1.h-1 );
: Tempo total de fermentação (h);
P: Produtividade (g.L-1.h-1 )
x100 Equação 09
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1.1 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios com uma cepa.
Figura 01 - Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual (C), Formação de
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 1 ao 4 em culturas puras com as leveduras
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação.
1,5
100% Monastrell
1 100% T73
100% BMV58
0,5 100% CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
Tempo (h)
100
B
80
Média Glicose (g/L)
60
100% Monastrell
40 100% T73
100% BMV58
100% CR85
20
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
23
140
C
120 100% Monastrell
Média Frutose (g/L)
100
100% T73
80
100% BMV58
60
40 100% CR85
20
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
10 D
Média Etanol Produzido(%V.V)
6
100% Monastrell
4 100% T73
100% BMV58
2
100% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
24
10 E
Média Glicerol Produzido(mg/L) 9
8
7
6
5 100% Monastrell
4 100% T73
3 100% BMV58
2 100% CR85
1
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
F
1200
Média Ácido Acético Produzido(mg/L)
900
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
funcionais celulares é máxima. Após esta etapa, nota-se a desaceleração do crescimento, até o
fim do processo fermentativo.
O consumo do substrato é destinado à produção de biomassa, etanol e outros
bioprodutos secundários, e decai durante a fermentação (MENEZES, 1980; LIMA et al.,
2001). As Figuras 1-B e 1-C apresentam as concentrações de glicose e frutose residuais,
respectivamente, ao longo do período de fermentação (236h), sendo possível observar o
consumo destes açúcares que agiram como substrato durante o processo fermentativo. A
levedura MONASTRELL foi a maior consumidora de açúcares (glicose e frutose), enquanto
que a CR85 obteve menor consumo. Observa-se claramente como o consumo de glicose na
fermentação é prioritário diante do consumo de frutose. Para todas as cepas o declínio do
substrato foi significativo, no entanto, em 236h de fermentação não houve completo consumo
dos açúcares por parte de nenhuma cepa. Apesar da variação do consumo de substrato entre as
leveduras, os resultados se mostraram melhores do que os reportados na literatura (SANTOS,
2017).
Quanto à produção de etanol, a Figura 1-D mostra a média da porcentagem de
concentração de etanol em 236h de fermentação. Observa-se, claramente, para as leveduras
BMV58 e CR85, que a porcentagem de etanol aumenta mais rapidamente até as primeiras
159h de fermentação e logo desacelera, enquanto que para as leveduras MONASTRELL e
T73 a velocidade de produção se mantém durante as 236 h de fermentação.
No trabalho de SANTOS (2017), usando concentração inicial de 230g/L foram
encontrados resultados de produção de etanol parecidos com a linhagem MONASTRELL do
presente trabalho. Já em relação à cepa CR85 observou-se valores de etanol levemente
inferiores, em torno de 7%(V/V), aos encontrados por CONTRERAS (2016).
De acordo com LIMA et al., (2001) e PÉTER; ROSA, (2005), na sequência de
reações intracelulares para formação de etanol surgem rotas metabólicas alternativas que
propiciam uma maior adaptação da levedura no meio de fermentação, resultando em formação
de glicerol e demais compostos orgânicos secundários.
Estima-se que 5% do açúcar metabolizado pela levedura seja desviado para gerar
produtos secundários da fermentação, resultando num rendimento de 95% em etanol,
conforme já observado por Pasteur em condições adequadas de fermentação (com mostos
sintéticos). Entretanto, em condições industriais, nas quais fatores químicos, físicos e
microbiológicos afetam a levedura, rendimentos de 90% normalmente são obtidos, os que
implicam em desvios de 10% do açúcar processado para a formação de outros produtos que
não o etanol (LIMA et al., 2001).
26
Tabela 2 - Parâmetros cinéticos encontrados em 236 horas para os Ensaios de 1 a 4, culturas puras das cepas:
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85).
Variáveis da Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4
fermentação MONASTRELL T73 BMV58 CR85
Biomassa
Final (g.L-1) 1,4 ± 0,12 1,11 ± 0,13 0,98 ± 0,15 0,83 ± 0,11
µXmáx (h-1) 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556
YX/S (g.g-1) 0,008846 0,007833 0,006763 0,007073
Glicose
Final (g.L-1) 6,58 ± 3,55 11,92 ± 1,79 10,20±6,86 21,36±1,10
Frutose
Final (g.L-1) 35,16 ± 6,049 46,36± 4,48 44,90±1,91 61,29±4,36
Etanol
Final (% v/v)) 9,044 ± 0,939 7,47 ± 1,15 6,792±3,02 5,301±0,402
µPmáx (h-1) 0,332 1,197 1,303 1,282
YP/S (g.g-1) 0,456 0,421 0,374 0,361
Produtividade
(g. L-1.h-1) 0,306 0,826 0,909 0,781
Eficiência
Fermentativa(%) 70,618 58,327 53,03 41,392
Glicerol
Final (mg.L-1) 5,947 ± 0,288 5,694 ± 0,354 6,82 ± 2,26 7,412 ± 0,71
Ácido Acético
Final (mg.L-1) 987,515 ± 28,96 904,78±36,18 461,66±1,9 458,32±13,9
final tanto de glicose como de frutose no final da fermentação (Tabela 2), confirmando, assim,
a máxima utilização destes açúcares na formação de etanol e demais compostos orgânicos.
O ensaio que continha apenas a cepa CR85 apresentou a menor concentração de
biomassa e uma das piores taxas de conversão de substrato em biomassa (YX/S).
Contrariamente ao esperado, também foi o experimento de menor concentração de etanol,
YP/S e eficiência fermentativa, porém, com taxas intermediárias de µXMÁX e produtividade de
etanol. Apesar de ser a menor produtora de etanol e ácido acético, tal cepa foi a maior
produtora de glicerol e a que menos consumiu substrato (Tabela 3), confirmando ser potencial
produtora de glicerol. A S. kudriavzevii (CR85) pode respirar mais tempo e também a sua
fermentação não é tão eficaz, por isso requer a via de glicerol para compensar o potencial
redox que ocorre com a glicólise. (GONZÁLEZ et al, 2007).
Comparando os ensaios entre a T73 e a BMV58 é possível supor alguns
comportamentos metabólicos. A cepa T73 obteve maior concentração celular do que a
BMV58, e ainda assim obteve maior concentração de etanol final, YX/S, YP/S e eficiência
fermentativa, enquanto que, a cepa BMV58 além da menor produção de etanol, obteve
velocidade específica de produção de etanol superior, maior consumo de glicose e frutose e
menor produção de glicerol (Tabela 2). A junção dos resultados, permite afirmar que a
levedura T73 possui melhor capacidade fermentativa do que a levedura BMV58, visto que
conseguiu destinar melhor a glicose e frutose para a produção de etanol com menor consumo
destes substratos, desviando-o das rotas de produção de biomassa e glicerol. Essa
característica mencionada pode ser confirmada pelo fato de que a T73 alcançou a maior
eficiência fermentativa (58,327%), maior fator de transformação de substrato em etanol
(0,421gEtanol.g-1) com uma taxa de transformação máxima de 1,197 h-1 e produtividade de
0,826g.L-1 de etanol por hora. Enquanto que a BMV58 produziu menor concentração de
biomassa e etanol, e ainda apresentou a maior produção de glicerol e consumo de sacarose
superior.
Contrariamente ao esperado da levedura T73, houve maior produção de ácido
acético, com relação aos ensaios mencionados. Tal fato pode ser explicado com base na
utilização desse ácido como precursor dos lipídios constituintes da biomassa (PÉTER; ROSA,
2005), visto que T73 apresentou maior produção de biomassa se comparada à cepa BMV58
que apresentou menor concentração de ácido acético.
29
5.1.2 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com duas cepas
Figura 2 - Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual (C), Formação de
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos ensaios 5 ao 10 com duas cepas na proporção de 1:1 das
leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação.
2,5 A
Média Concentração Celular(g/L)
2
50% Monastrell/50%T73
1,5
50%Monastrell/50%BMV58
1 50%Monastrell/50%CR85
50%BMV58/50%CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
Tempo (h)
30
100 B
80
Média Glicose (g/L)
60 50% Monastrell/50%T73
50%Monastrell/50%BMV58
40 50% Monastrell/50%CR85
50% T73 / 50% BMV58
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
140 C
120
100
Média Frutose(g/L)
50%Monastrell/50%T73
80
50%Monastrell/50%BMV58
60 50%Monastrell/50%CR85
50% T73 / 50% BMV58
40
50% T73 / 50% CR85
20 50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
31
6 50%Monastrell/50%T73
50%Monastrell/50%BMV58
4 50%Monastrell/50%CR85
50% T73 / 50% BMV58
2 50% T73 / 50% CR85
50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
10
E
9
Média Glicerol Produzido(mg/L)
8
50%Monastrell/50%T73
7
6 50% Monastrell/50%BMV58
5 50%Monastrell/50%CR85
4
50% T73 / 50% BMV58
3
2 50% T73 / 50% CR85
1
50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
32
1200 F
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
A Figura 2-A mostra a cinética de crescimento das leveduras durante 236 horas de
fermentação. A partir do perfil da cinética de crescimento definido por Schmidell et al. (2001)
os seis ensaios mostrados, apresentaram comportamento semelhantes. Assim como nos
experimentos com culturas puras, não foi possível observar a fase lag, devido à rápida
adaptação das leveduras ao meio de cultivo. Já a fase logarítmica ou exponencial, observou-se
nas primeiras 89 horas de fermentação, seguida da desaceleração do crescimento que
permaneceu até o fim do período da fermentação. A fim de visualizar claramente as fases lag
e estacionária, recomenda-se observar o crescimento em um intervalo de tempo mais curto,
como a cada 15h, por exemplo.
Diferentemente do relatado da literatura, verificou-se que após 159 h de fermentação,
a combinação MONASTRELL+T73 apresentou considerado aumento na concentração de
biomassa, atingindo a maior concentração celular dentre todos os ensaios. De acordo com a
literatura, considera-se tal aumento após a desaceleração como resultado o uso do etanol
como fonte de carbono pela levedura Saccharomyces cerevisiae (CRUZ, 2016).
As interações entre a população da biomassa durante o processo fermentativo produz
diversos efeitos comportamentais nas leveduras, sendo que o sinergismo e o antagonismo são
considerados os principais. O primeiro, denominado sinergismo, caracteriza-se pelo aumento
de biomassa da cultura mista quando comparada aos cultivos puros, enquanto que o segundo,
denominado antagonismo, caracteriza-se pelo decaimento da biomassa quando comparada a
cada levedura que o compõe (AMORIM et al., 2011). Sendo assim, constata-se a partir da
comparação da concentração de biomassa das co-culturas com relação aos cultivos puros, que
33
Tabela 3 - Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de duas cepas na proporção
1:1, durante 236 horas.
Frutose
Final (g.L-1) 39,804 ± 5,764 40,592 ± 6,958 45,68±3,15 52,462±6,19 56,998±4,7 50,484± 4,6
Etanol
Final (% v/v) 8,492 ± 0,193 7,951 ± 0,009 7,635±0,015 7,597±0,126 6,774±0,03 7,774 ±0,09
-1
µPmáx (h ) 1,540 0,833 1,322 0,989 1,114 0,901
YP/S (g.g-1) 0,443 0,419 0,424 0,451 0,434 0,456
Produtividade
(g. L-1.h-1) 1,602 0,936 0,960 0,995 0,892 1,148
Eficiência
Ferment.(%) 66,304 62,086 59,616 59,321 52,893 60,702
Glicerol
Final 6,006 ± 0,167 6,051 ± 0,303 6,38 ± 0,99 6,323± 0,88 6,393±0,27 6,721± 0,643
-1
(mg.L )
Ácido Acético
Final 948,482 ± 19,459 743,554 ± 17,22 802,1±67,3 775,92±41,2 722,9±71,0 567,15± 80,542
1
(mg.L )
5.1.3 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com três e quatro
cepas.
Figura 3 - Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual (C), Formação de
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos ensaios 11 ao 15 com três e quatro cepas na proporção de 1:1:1
e 1:1:1:1, respectivamente, das leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de
fermentação.
2,5 A
Média Concentração Celular(g/L)
33% Monastrell/
33%T73/ 33%BMV58
2
33%Monastrell/
1,5 33%T73/ 33%CR85
1 33%Monastrell/
33%BMV58/ 33%CR85
0,5
33%T73/ 33% BMV58/
33%CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
25%Monastrell/
Tempo (h)
25%T73/ 25%BMV58/
25%CR85
37
100
B
80 33% Monastrel/33%
Média Glicose (g/L)
T73/33%BMV58
60 33% Monastrel/33%
T73/33%CR85
40 33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
33% T73/33%
20
BMV58/33%CR85
25% Monastrel/25% T73/
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
140
C
120
33% Monastrel/33%
Média Frutose(g/L)
100
T73/33%BMV58
80 33% Monastrel/33%
T73/33%CR85
60 33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
40
33% T73/33%
BMV58/33%CR85
20
25% Monastrel/25% T73/
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
38
10 D
Média Etanol Produzido(%V.V)
33% Monastrel/33%
6 T73/33%BMV58
33% Monastrel/33%
4 T73/33%CR85
33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
2 33% T73/33%
BMV58/33%CR85
E
10
9
Média Glicerol Produzido(mg;/L)
8
33% Monastrel/33%
7 T73/33%BMV58
6 33% Monastrel/33%
5 T73/33%CR85
4 33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
3
33% T73/33%
2 BMV58/33%CR85
1 25% Monastrel/25% T73/
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
39
A Figura 3-A apresenta a cinética de crescimento das leveduras durante 236 horas de
fermentação. Assim como nos demais ensaios, nestes com três e quatro leveduras, não foi
possível identificar a fase lag, isto é, fase de adaptação ao meio, devido ao longo período de
incubação antes da primeira avaliação de concentração celular no espectrofotômetro.
Diferentemente dos ensaios com culturas puras e com duas leveduras em co-cultura, é
possível observar um menor período de fase exponencial, sendo o mesmo ocorrido nas
primeiras 60h, tendo desaceleração do crescimento de biomassa até o fim do período
fermentativo observado. A fase estacionária aparece claramente em dois ensaios,
T73+BMV58+CR85 e MONASTRELL+BMV58+CR85, a partir de 209 horas de
fermentação, enquanto que o ensaio contendo quatro leveduras apresentou comportamento
inesperado ao aumentar significativamente seu crescimento após a fase de desaceleração, no
intervalo de 60h a 159h de fermentação, voltando a diminuir o crescimento após esse período.
Conforme citado anteriormente, tal aumento considerável após a desaceleração é
fruto do uso do etanol como fonte de carbono pela levedura Saccharomyces cerevisiae
(CRUZ, 2016), o que pode ser confirmado ao observar o ensaio contendo
MONASTRELL+T73 que apresentou mesmo comportamento.
As Figuras 3-B e 3-C apresentam as concentrações de substrato, sendo eles, glicose e
frutose, respectivamente, versus o tempo de fermentação. Para todas as combinações de cepas
houve declínio do substrato, no entanto, nenhuma das combinações de leveduras conseguiram
consumir totalmente os açúcares durante as 236 h de fermentação, semelhantemente ao
40
Tabela 4 - Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de três e quatro cepas nas
proporções 1:1:1 e 1:1:1:1, respectivamente, durante 236 horas.
Outro desvio também foi constatado neste estudo, desta vez, da rota metabólica de
etanol para a síntese de biomassa, observado nas misturas MONASTRELL+BMV58+CR85 e
T73+BMV58+CR85 que obtiveram resultados similares nos parâmetros cinéticos, obtendo os
maiores níveis de formação de biomassa e menor produção etanólica. Ao comparar o
consumo de substrato destas combinações com as demais nota-se que apesar de baixa
produção de etanol, o consumo de substrato também foi baixo, potencializando, assim, a
eficiência fermentativa. Percebe-se, ao relacionar seus parâmetros cinéticos, que apesar da
alta formação de biomassa, não houve desvios de açúcares para produção de metabólitos
secundários (glicerol, ácido acético, etc) e não houve maior concentração de ácido acético
42
visando suprir a busca pela síntese de biomassa (LIMA et al., 2001; PÉTER; ROSA, 2005;
SANTOS, 2017).
Surpreendentemente, os ensaios com três e quatro leveduras apresentaram
comportamento cinético favorável à produção de vinhos nacionais de acordo com a legislação
estabelecida pela União Brasileira de Vitivinicultura que regulamenta os padrões de
identidade e qualidade dos vinhos. Os ensaios MONASTRELL+T73+BMV58 e
MONASTRELL+T73+CR85, poderiam ser empregados na fermentação de vinhos do tipo
“V nh e Me D e S ve”, v q e e ó (9,221% e 8,448%,
respectivamente) e de açúcares totais (43,603 g/L e 47,817 g/L) está dentro dos limites
estabelecidos por legislação, que limita tais valores em 8,6 a 14% para teor alcoólico, e 25,1 a
80g/L de açúcares totais (UVIBRA, 1988). Visto isso, as combinações com três leveduras
mostraram características relevantes que devem ser aprofundadas em estudos futuros.
Figura 4 - Regiões de contorno da resposta concentração de biomassa para a combinação quaternária utilizada
no planejamento experimental para misturas simplex centroide. (p<0,1)
BIOMASSA BIOMASSA
BMV-58
0,00 1,00 A CR-85
0,00 1,00 B
1,4
1,3
1,4 1,2
1,3 1,1
1,00 0,00 1,2 1,00 0,00 1
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,1 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,9
MONASTRELL T-73 MONASTRELL BMV-58
BIOMASSA BIOMASSA
CR-85
0,00 1,00 C CR-85
0,00 1,00 D
1,1 1,4
1,05 1,3
1 1,2
0,95 1,1
1,00 0,00 0,9 1,00 0,00 1
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,85 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,9
T-73 BMV-58 MONASTRELL T-73
A Figura 4 ilustra as curvas de nível geradas na qual agrupou-se de três em três das
quatro leveduras utilizadas na fermentação quanto a resposta de produção de biomassa. Nota-
se na Figura 4-A, baixa concentração celular, aliada a um menor crescimento das leveduras e,
menor formação de biomassa, entre os eixos T73 e BMV58, caracterizados pela coloração
verde, conforme descrição de legenda. Na Figura 4-C, entretanto, nota-se uma ampla região
de alta concentração celular, caracterizada pela coloração vermelha, nos referidos eixos. As
Figuras 4-A e 4-D mostram que as leveduras MONASTRELL, T73 apresentaram maior
produção de biomassa quando comparadas às demais cepas. No entanto, no ensaio em que
estiveram em igual proporção, apresentaram resultados intermediários concernentes à
formação de biomassa, o que pode ser justificada pelo alto rendimento de etanol (Tabela 3)
uma vez que houve desvio na síntese metabólica de crescimento de biomassa, para a produção
de etanol.
44
Figura 5 - Regiões de contorno da resposta concentração de etanol para a combinação quaternária utilizada no
planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
ETANOL ETANOL
BMV-58
0,00 1,00 A CR-85
0,00 1,00 B
ETANOL ETANOL
CR-85 CR-85
0,00 1,00 C 0,00 1,00
D
GLICOSE
BMV-58
A GLICOSE
B
0,00 1,00 CR-85
0,00 1,00
0,25 0,75
0,25 0,75
0,50 0,50
0,50 0,50
Figura 7 - Regiões de contorno da resposta concentração residual de frutose para a combinação quaternária
utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
FRUTOSE FRUTOSE
CR-85 BMV-85
0,00 1,00 A 0,00 1,00 B
FRUTOSE FRUTOSE
MONASTRELL CR-85
0,00 1,00
C 0,00 1,00
D
Figura 8 - Regiões de contorno da resposta concentração de glicerol para a combinação quaternária utilizada no
planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
GLICEROL
GLICEROL CR-85
0,00 1,00
BMV-85
0,00 1,00 A B
0,25 0,75
0,25 0,75
0,50 0,50
0,50 0,50
GLICEROL GLICEROL
CR-85 CR-85
0,00 1,00 C 0,00 1,00 D
Figura 9 - Regiões de contorno da resposta concentração de ácido acético para a combinação quaternária
utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
1000 1000
900 900
800 800
1,00 0,00 700 1,00 0,00 700
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600
MONASTRELL T-73 MONASTRELL BMV-58
ÁCIDO ACÉTICO
ÁCIDO ACÉTICO
CR-85 CR-85
0,00 1,00 0,00 1,00
C D
1000
900 900
800 800
1,00 0,00 1,00 0,00
700 700
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600
T-73 BMV-58 MONASTRELL T-73
A análise das curvas de nível de biomassa (Figura 4) e ácido acético (Figura 9),
possibilitou relacioná-las, uma vez que o ácido acético é precursor para produção de lipídios
constituinte da biomassa (PÉTER; ROSA, 2005). As mesmas combinações de levedura a
região de maior produção de ácido acético obtiveram, também, maior produção de biomassa,
entretanto, há estudos contrários a esta verdade apresentada, sendo justificados pelo fato de
que as células possuem outros componentes, além de lipídios (BECZE, 1955).
Considera-se de grande importância, esta análise estatística apresentada, pois
confirmam os resultados analíticos.
No intuito de atender as demandas atuais dos consumidores de vinho, cada dia mais
exigentes, as indústrias vinícolas têm desenvolvido vinhos ricos em glicerol, responsável por
porporcionar mais suavidade e consistência aos vinhos, e reduzido teor alcoólico. Sendo
assim, atualmente, tem se empregado diversos métodos, entre eles a utilização de co-culturas
49
6. CONCLUSÃO
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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