Protocolos de Microbiologia Ambiental

Parte 3: Análise microbiológica da água

Manuela Abelho
2010

Índice
Análise microbiológica da água .....................................................................................................................1
Protocolo 3.1 Recolha de amostras de água para análise microbiológica...........................................2
Protocolo 3.2 Enumeração de microrganismos viáveis a 22ºC e a 37ºC (ISO 6222, 1999) .................3
Protocolo 3.3 Enumeração de coliformes totais, fecais e detecção de E. coli .....................................4
Protocolo 3.4 Enumeração de enterococos .........................................................................................7
Protocolo 3.5 Quantificação de microrganismos pelo método do número mais provável (NMP) .....7

Objectivos: (1) Determinar os principais parâmetros microbiológicos de qualidade da água; (2) Executar
a técnica da inoculação de tubos múltiplos; (3) Executar a técnica da quantificação indirecta de
microrganismos pelo método do número mais provável (NMP); (4) Comparar os resultados obtidos com
a legislação actual aplicável e criticar a qualidade microbiológica da amostra de água analisada.

Análise microbiológica da água

Os reservatórios de água e as fontes de água potável estão sujeitas a contaminações por matéria fecal
dos esgotos ou de outra origem, podendo provocar infecções intestinais como febre tifóide, disenteria e
cólera. A identificação das bactérias patogénicas constituiria a prova mais directa de uma contaminação
perigosa, mas tais organismos, quando presentes, encontram-se geralmente em tão escasso número
que as dificuldades técnicas do seu isolamento tornam o ensaio impraticável como método de rotina.
Assim, fazem-se pesquisas de microrganismos (ou grupos de microrganismos) denominados indicadores
de contaminação da água por fezes humanas ou de outros animais (bactérias entéricas, bactérias
coliformes, bactérias fecais).

A análise bacteriológica da água não é feita apenas a águas que se destinam ao consumo das
populações, mas também a águas destinadas ao recreio (praias, rios, piscinas, etc.), à aquacultura e à
rega. É igualmente importante, numa perspectiva de preservação dos ecossistemas, vigiar a qualidade
das águas que não têm uma utilização especificamente humana.

O processo de rotina consta de contagens em placa para determinar o número de bactérias presentes,
testes para revelar a presença de bactérias coliformes e testes para revelar a presença de estreptococos
fecais. As bactérias coliformes são indicadoras de poluição fecal e incluem bastonetes Gram-negativos,
aeróbios ou anaeróbios facultativos que não formam esporos e fermentam lactose com produção de
ácido e gás em 48 horas e a uma temperatura de 37º C, na presença de sais de bílis. Como exemplo,
citam-se Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae.
Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3

O grupo dos microrganismos denominados "coliformes totais" inclui todos os coliformes específicos e
não específicos do material fecal. É um bom indicador microbiológico da qualidade da água, porque é
facilmente detectável e quantificável. A ausência de coliformes totais numa água potável garante a sua
pureza bacteriológica. A sua presença pressupõe que o tratamento da água foi inadequado ou que a
rede de distribuição não é estanque e foi contaminada por águas residuais. A tecnologia actual do
tratamento de águas permite, através do controlo cuidado da coagulação, sedimentação e filtração, que
mais de 99% dos coliformes sejam removidos.

O grupo de microrganismos denominados "coliformes fecais" é um subgrupo do anterior. Permite

estabelecer uma correlação mais precisa entre a existência de coliformes numa amostra de água e a
entidade responsável pela sua libertação, que terá sido um organismo homeotérmico. De entre os
coliformes que existem nas fezes de animais homeotérmicos, mais de 90% são coliformes fecais. Estes
coliformes fermentam a lactose com produção de ácido e gás a 44ºC.

É conveniente pesquisar também a existência de estreptococos fecais. A ocorrência destes indica que
houve contaminação fecal. Embora raramente se multipliquem na água são capazes de persistir por
longos períodos de tempo, desde que a temperatura e a concentração hidrogeniónica sejam favoráveis.
São muito resistentes, suportando concentrações relativamente altas de cloro. Exemplos deste grupo
são Streptococcus durans e S. fecalis (homem) e S. faecium (vaca e ovelha). Os estreptococos são cocos,
Gram-positivos e dão resposta negativa ao teste da catalase.

A determinação do número total de microrganismos vivos na água constitui uma prova complementar
(embora de limitado valor quando isolada), que fornece indicações quanto ao teor e natureza da
matéria orgânica da amostra. O teste é realizado a 22ºC e a 37ºC em caixas de Petri inoculadas por
incorporação. Determina-se assim o número de bactérias mesófilas, heterotróficas, aeróbias e
anaeróbias não estritas.

Protocolo 3.1 Recolha de amostras de água para análise microbiológica

As mãos e a roupa dos intervenientes na colheita devem estar limpas. Os recipientes para colheita das
amostras de água devem estar esterilizados. A amostra de água deve ser colhida obedecendo aos
cuidados de assepsia, deve ser representativa das características microbiológicas do material a analisar
e deve ter volume suficiente para permitir, se necessário, a repetição dos testes (i.e. 500 mL). O
recipiente (esterilizado) para a amostra deve permanecer fechado até ao momento da colheita; nessa
altura enche-se sem enxaguar com a água a analisar e fecha-se imediatamente, tendo cuidado para não
contaminar durante estas operações as superfícies interiores da rolha ou tampa. O frasco não deve ficar
completamente cheio, pois algum espaço vazio no seu interior facilitará a agitação e mistura da amostra
antes de se efectuarem as análises. Após a colheita, os recipientes devem ser mantidos numa mala
térmica para que a amostra não sofra alterações relativamente ao seu conteúdo microbiológico.

RECOLHA DE AMOSTRAS DE ÁGUA DE UMA TORNEIRA

1. Lavar e desinfectar as mãos (ou usar luvas)

2. Retirar qualquer filtro (Figura 3.1) e deixar correr o tempo necessário (1-2 minutos) para esgotar a
água que tenha estado parada na canalização (Figura 3.1)
4. Fechar a torneira e flamejar bem (no interior e no exterior) com um maçarico ou uma tocha
embebida em álcool (Figura 3.1)
5. Abrir a torneira com cuidado e deixar a água correr de novo até arrefecer (Figura 3.1)

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6. Abrir o frasco esterilizado só neste momento e colher a água mantendo-o inclinado para evitar a
sua contaminação pelo ar. Manter a rolha na mão esquerda virada para baixo e nunca tocar no
interior da rolha ou no gargalo do frasco (Figura 3.1)
7. Recolher a amostra de água mantendo o frasco inclinado para evitar a sua contaminação pelo ar e
sem encher completamente o frasco (Figura 3.1)
8. Fechar imediatamente o frasco (Figura 3.1)
9. Colocar um rótulo que contenha a identificação da amostra: nome do requisitante; origem; ponto
de amostragem e data de colheita
10.Transportar as amostras em caixa isotérmica com placas acumuladoras térmicas congeladas e
realizar a análise até 6 horas após a colheita

Figura 3.1. Procedimento para a recolha de amostras de água a partir de uma torneira.

RECOLHA DE AMOSTRAS DE ÁGUA DE UM CURSO DE ÁGUA OU DE UM RESERVATÓRIO

1. Segurar o frasco numa zona perto da sua base e mergulhá-lo na massa de água com a boca virada
para baixo. Deve mergulhar-se até cerca de metade da altura da coluna líquida ou pelo menos até
cerca de 20 cm abaixo da superfície da água
2. Virar o frasco até que o gargalo aponte ligeiramente para a superfície e a boca esteja voltada
contra a corrente. Se não existir qualquer corrente (por exemplo, no caso de um reservatório)
empurrar o frasco horizontalmente
3. Recolher a amostra e fechar imediatamente o frasco

Protocolo 3.2 Enumeração de microrganismos viáveis a 22ºC e a 37ºC (ISO

6222, 1999)
Consiste na enumeração de microrganismos cultiváveis1, por contagem de UFC em agar nutritivo após
incubação aeróbia a 22 e a 37ºC, em águas destinadas ao consumo humano. Faz-se a inoculação de um
volume conhecido de amostra ou suas diluições, por homogeneização com um meio de cultura
específico em caixas de Petri, com incubação de um conjunto a 37ºC durante 44 horas e de outro
conjunto a 22ºC durante 68 horas. No final contam-se as colónias das caixas contáveis e faz-se o cálculo
do número de UFC por mililitro da amostra.

1
Todos os microrganismos – bactérias, fungos e leveduras – capazes de formar colónias no meio especificado sob as condições
de teste descritas.

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As bactérias aeróbias mesófilas são aquelas que se multiplicam em aerobiose a temperaturas entre 20 e
40ºC. Neste grupo existem bactérias patogénicas e não patogénicas. O método permite-nos conhecer a
qualidade microbiológica da água; elevadas quantidades de mesofilos indicam que a água não é
apropriada para consumo humano.

PRIMEIRO TEMPO

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO

5667-3 (ver acima)
2. Incorporar um inóculo de 1 mL em 15-20 mL de meio plate count agar (PCA) fundido
3. Inocular no mínimo uma caixa de Petri por cada temperatura de incubação
4. Deixar solidificar, inverter e incubar um conjunto a 372ºC durante 444h e o outro conjunto a
222ºC durante 684h

SEGUNDO TEMPO

1. Observar as caixas assim que terminar o tempo de incubação ou armazená-las a 53ºC e fazer a
observação num período de 48h
2. Exprimir os resultados como número de UFC/mL da amostra para cada temperatura
3. Se não existirem colónias nas caixas inoculadas com a amostra não diluída, exprimir os resultados
como não detectados num mL. Se existirem mais de 300 colónias nas caixas inoculadas com a
diluição maia alta utilizada, exprimir os resultados como> 300
4. O relatório deve incluir a referência à norma e a classificação da qualidade da água em função da
sua utilização e de acordo com a legislação e deve incluir também: a identificação completa da
amostra, a técnica de inoculação e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de
incubação, os resultados de contagem expressos como UFC/mL e qualquer ocorrência particular
observada durante o decorrer da análise

Protocolo 3.3 Enumeração de coliformes totais, fecais e detecção de E. coli

O grupo dos coliformes pertence à família Enterobacteriaceae e inclui vários géneros: Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. O seu habitat natural é o intestino do homem e dos outros
animais homeotérmicos, mas também podem ser isolados noutros ambientes como o solo, as plantas,
etc., pelo que os coliformes totais não apresentam boa especificidade como indicadores de
contaminação fecal. Apesar disso, a sua frequência nas fezes, a sua fácil detecção e a possibilidade de
que juntamente com eles existam microrganismos patogénicos tornam-nos um dos principais
indicadores de contaminação fecal.

De acordo com as normas e a legislação em vigor, a enumeração de coliformes e a detecção de E. coli

em águas destinadas ao consumo humano e outras, deve fazer-se através da filtração por membrana,
com cultura em meio diferencial de agar e cálculo do número de microrganismos-alvo da amostra. Na
técnica da filtração por membrana, a amostra deve conter pouca matéria em suspensão de forma a não
interferir com a filtração, cultura e contagem.

No entanto, a enumeração dos coliformes pode ser também feita pelo método dos tubos múltiplos com
determinação do Número Mais Provável (NMP). O teste completo permite determinar os coliformes
totais e os coliformes fecais (mas não especificamente E. coli) para o que são necessárias três fases:
teste presuntivo, teste confirmativo e teste final.

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No teste presuntivo (verificação da produção de gás) inoculam-se volumes apropriados da amostra em

séries de tubos contendo meio de cultura apropriado, e a incubam-se a 350,5º C, durante 242 horas.
Se findo esse período não tiver havido formação de gás em nenhum tubo, prolonga-se a incubação até
às 483 horas. O meio de cultura inibe o crescimento dos microrganismos Gram-positivos e encoraja o
crescimento dos microrganismos coliformes. Os coliformes usam o oxigénio presente no meio e através
da fermentação produzem ácido e gás sob condições anaeróbias. Se não existir produção de gás o
resultado do teste é negativo, estabelecendo-se que não existem coliformes na amostra. A formação de
gás (resultado positivo) determina a presença de coliformes na amostra. O número de tubos positivos é
utilizado para calcular o NMP de microrganismos coliformes na amostra de água.

No teste confirmativo (confirmação dos resultados) todos os tubos positivos às 24 horas são repicados
para um caldo de verde brilhante, lactose e sais de bílis (VBLB), incubados a 35ºC e lidos nas condições
anteriormente descritas. A formação de gás confirma a presença de coliformes na amostra. Este teste
confirma os resultados uma vez que a formação de gás no teste presuntivo pode ter sido devida à
actividade de microrganismos não coliformes, como por exemplo Clostridium perfringens, que é Gram-
positiva.

No teste final (verificação da presença de coliformes fecais), repete-se o procedimento utilizado no teste
confirmativo mas a incubação é feita a 44.5ºC durante 24 a 48 horas. A formação de gás determina a
presença de coliformes fecais na amostra. Se não existir formação de gás a 44.5ºC mas existir a 35ºC
determina-se que existem coliformes mas que não são fecais. O NMP de coliformes fecais é
determinado com base no número de tubos positivos.

Um teste adicional permite determinar se a presença ou ausência de E. coli na amostra. Adiciona-se aos
tubos inoculados para o teste final reagente de Kovacs (teste do indol). Uma reacção positiva (formação
de um anel cor-de-rosa) mostra a presença de E. coli. Uma reacção negativa (formação de um anel da
cor do meio) mostra que E. coli não faz parte da população de coliformes fecais presentes na amostra.

PRIMEIRO TEMPO

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO

5667-3 (ver acima)
2. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante duplo (contendo um tubo
Durham2) com 10 mL da amostra
3. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante simples (contendo um tubo
Durham) com 1 mL da amostra
4. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante simples (contendo um tubo
Durham) com 0.1 mL da amostra3
5. Levar a incubar a 370.5º C, durante 242 horas

2
Os tubos Durham acumulam o gás produzido pelos coliformes permitindo assim a detecção da sua presença numa dada
amostra de água; a presença de gás nos tubos Durham é um resultado positivo para coliformes.

3 A utilização de inóculos de 10 mL, 1 mL e 0.1 mL é semelhante a inocular a amostra e 2 diluições decimais dessa amostra.

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SEGUNDO TEMPO: TESTE PRESUNTIVO

1. Verificar a produção de gás nos tubos, anotando o número de tubos positivos e negativos em
cada série
2. Determinar o NMP de microrganismos coliformes na amostra (ver abaixo)

SEGUNDO TEMPO: TESTE CONFIRMATIVO

1. Repicar com uma ansa os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio verde
brilhante
2. Levar a incubar a 370.5º C, durante 242 horas

TESTE FINAL

3. Repicar com uma ansa os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio verde
brilhante
4. Levar a incubar a 44.5ºC durante 24+24 horas
5. Na aula seguinte verificar a produção de gás nos tubos, anotando o número de tubos positivos e
negativos em cada série
6. Determinar o NMP de coliformes fecais na amostra (ver abaixo)

DETECÇÃO DE ESCHERICHIA COLI

7. Repicar com uma ansa os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio peptonado
8. Levar a incubar a 44.5ºC durante 24+24 horas

TERCEIRO TEMPO: TESTE CONFIRMATIVO E TESTE FINAL

1. Verificar a produção de gás nos tubos, anotando o número de tubos positivos e negativos em
cada série
2. Com os tubos positivos do teste confirmativo, determinar o NMP de coliformes totais na amostra
(ver abaixo)
3. Com os tubos positivos do teste final, determinar o NMP de coliformes fecais na amostra (ver
abaixo)

DETECÇÃO DE E. COLI ( TESTE DO INDOL )

4. Adicionar uma gota de reagente de Kovacs a cada um dos tubos

5. A formação de um anel cor-de-rosa é um resultado positivo que indica a presença de E. coli na
amostra

6. O relatório deve incluir a referência à norma e a classificação da qualidade da água em função da

sua utilização e de acordo com a legislação e deve incluir também: a identificação completa da
amostra, a técnica de inoculação e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de
incubação, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de microrganismos coliformes, coliformes
fecais e E. coli na amostra e qualquer ocorrência particular observada durante o decorrer da
análise.

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Protocolo 3.4 Enumeração de enterococos

Os enterococos são bactérias Gram-positivas com a forma de cocos, aeróbias, com reacção negativa à
catalase, que fermentam glucose com produção de ácido e gás a 37ºC O seu habitat normal é o tubo
digestivo do homem e dos outros animais homeotérmicos, por isso são utilizados como indicadores de
contaminação fecal. Embora na legislação actual a sua determinação seja levada a cabo através da
técnica da filtração por membrana, também se podem quantificar com a técnica dos tubos múltiplos
seguida pela determinação do NMP.

PRIMEIRO TEMPO

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO

5667-3 (ver acima)
2. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg duplo com 10 mL da amostra
3. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg com 1 mL da amostra
4. Inocular uma série de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg simples com 0.1 mL da amostra4
5. Levar a incubar a 370.5º C, durante 242 horas (ou 48 horas)

SEGUNDO TEMPO

1. Observar os tubos para detecção da alteração de cor. Um resultado positivo (demonstrando a

presença de enterococos) é obtido quando a cor do meio de cultura passa de roxo-violeta a
amarelo-acastanhado
2. Anotar o número de tubos positivos e negativos em cada série
3. Determinar o NMP de enterococos presentes na amostra (ver abaixo)

4. O relatório deve incluir a referência à norma e a classificação da qualidade da água em função da

sua utilização e de acordo com a legislação e deve incluir também: a identificação completa da
amostra, a técnica de inoculação e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de
incubação, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer
ocorrência particular observada durante o decorrer da análise.

Protocolo 3.5 Quantificação de microrganismos pelo método do número

mais provável (NMP)
O método do número mais provável (NMP) pode ser usado para estimar o número de microrganismos
viáveis presentes numa determinada população. A amostra é diluída (diluições sucessivas ou inoculação
de volumes 10 vezes inferiores para a mesma quantidade de meio) inoculando-se um meio de cultura
líquido com um volume preciso dessas diluições. Desta forma, presume-se que os meios de cultura
inoculados com as últimas diluições não vão apresentar qualquer crescimento (resultados negativos) e
que ocorrerá crescimento nos tubos que tenham, pelo menos, um microrganismo viável.

Se a amostra e as diluições forem homogéneas e se houver um número suficiente de repetições (podem

fazer-se séries de vários tubos), é possível tratar estatisticamente os resultados e generalizá-los à
amostra inicial. Por cada diluição da amostra inoculam-se, geralmente, 3-5 ou 10 séries de tubos com o
referido meio de cultura (repetições). A própria designação do método aponta claramente para o
carácter probabilístico que lhe deve ser atribuído.

4 A utilização de inóculos de 10 mL, 1 mL e 0.1 mL é semelhante a inocular a amostra e duas diluições decimais dessa amostra.

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Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3

O NMP de microrganismos presentes na amostra inicial calcula-se a partir do número de tubos que
manifestem crescimento (resultados positivos), recorrendo a tabelas estatísticas, como as tabelas de
McCrady (Tabela 3.1).

Tabela 3.1. Tabela de McCrady para a determinação do número mais provável (NMP) de microrganismos com base em
5 repetições de cada diluição

Número de tubos positivos nas NMP / Número de tubos positivos nas NMP
diluições 100mL de diluições /100mL de
10 mL 1 mL 0.1 mL amostra 10 mL 1 mL 0.1 mL amostra
0 0 0 0 4 0 0 13
0 0 1 2 4 0 1 17
0 0 2 4 4 0 2 20
0 1 0 2 4 0 3 25
0 1 1 4 4 1 0 17
0 0 2 6 4 1 1 20
0 2 0 4 4 1 2 25
0 2 1 6 4 2 0 20
0 3 0 6 4 2 1 25
1 0 0 2 4 2 2 30
1 0 1 4 4 3 0 25
1 0 2 6 4 3 1 35
1 0 3 8 4 3 2 40
1 1 0 4 4 4 0 35
1 1 1 6 4 4 1 40
1 1 2 8 4 4 2 45
1 2 0 6 4 5 0 40
1 2 1 8 4 5 1 50
1 2 2 10 4 5 2 55
1 3 0 8 5 0 0 25
1 3 1 10 5 0 1 30
1 4 0 11 5 0 2 45
2 0 0 5 5 0 3 60
2 0 1 7 5 0 4 75
2 0 2 9 5 1 0 35
2 0 3 12 5 1 1 45
2 1 0 7 5 1 2 65
2 1 1 9 5 1 3 85
2 1 2 12 5 1 4 115
2 2 0 9 5 2 0 50
2 2 1 12 5 2 1 70
2 2 2 14 5 2 2 95
2 3 0 12 5 2 3 120
2 3 1 14 5 2 4 150
2 4 0 15 5 2 5 175
3 0 0 8 5 3 0 80
3 0 1 11 5 3 1 110
3 0 2 13 5 3 2 140
3 1 0 11 5 3 3 175
3 1 1 14 5 3 4 200
3 1 2 17 5 3 5 250
3 1 3 20 5 4 0 130
3 2 0 14 5 4 1 170
3 2 1 17 5 4 2 225

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Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3

Número de tubos positivos nas NMP / Número de tubos positivos nas NMP
diluições 100mL de diluições /100mL de
10 mL 1 mL 0.1 mL amostra 10 mL 1 mL 0.1 mL amostra
3 2 3 20 5 4 3 275
3 3 0 17 5 4 4 350
3 3 1 20 5 4 5 425
3 4 0 20 5 5 0 250
3 4 1 25 5 5 1 350
3 5 0 25 5 5 2 550
5 5 3 900
5 5 4 1600
5 5 5 1800+

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