CARA PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN

PREPARAT

OLEH
KELAS 1.A
D-IV KEPERAWATAN

NI LUH PUTU ARY APRILIYANTI (P07120216017)

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN DIV KEPERAWATAN
TAHUN AKADEMIK
2017/2018
I. Judul Praktikum : Cara Pewarnaan Gram Dan Pengamatan Preparat

II. Tujuan Praktikum :

1. Agar mahasiswa mampu mengetahui pengertian pewarnaan bakteri
2. Agar mahasiswa mampu mengetahui macam – macam pewarnaan bakteri
3. Agar mahasiswa mampu mengetahui prosedur kerja pewarnaan bakteri
4. Agar mahasiswa mengelompokkan bakteri gram positif atau bakteri gram
negative

III. Prinsip Kerja

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu
pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan
sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode
pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl,
2008).

IV. Dasar Teori

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri
sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan
mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri
memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali
lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup
dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam
yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan
terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat
dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal
dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang
(silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri
dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat
struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat
warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua
golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian
violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan
Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur)
kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin,
dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram
negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan
struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan
itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada
umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi
kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif.
Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan
dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau
permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol
gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif
terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada
perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri
Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan
jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam
peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari
keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram
psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa
strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh
kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh
alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram
positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol
gentian violet. (Razali, 1987).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter
kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna
tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri
menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi.
Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal
violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium,
setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95%
selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck
(untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan
yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan
melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri
yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%.
Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram
negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah
pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui
morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat
mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan
pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua
bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif
membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan
safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif
adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium
dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram
negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan
memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram
negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,
Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat
dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna
basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut
bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen
dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen
terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan
safranin (Tracy, 2005).
 Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada
dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam
pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat
pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan
bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal
ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal
iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan
peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya
menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2
lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih
besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol,
Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol,
Aquades) (Madigan, 2003).

V. Waktu dan Tempat

1. Waktu : 09.00-11.00
2. Tempat : Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan
Politeknik Kesehatan Denpasar

VI. Alat dan Bahan

1. Alat
- Pipet tetes
- Ose
- Lampu bunsen
- Mikroskop
- Botol semprot
- Korek api
- Object Glass
2. Bahan
 - Biakan murni
- Garm A: Kristal violet
- Gram B: lugol /iodin
- Gram C: Alkohol
- Gram D: Safranin
- Air
- Minyak imersi

VII. Cara Kerja

1. Area dan obyek glass difiksasi/diaseptiskan
2. Menyalakan api Bunsen dengan korek
3. Slide/ objek glass di labeli
4. Melewatkan objek glass dia atas lidah api
5. Memfiksasi Ose di atas api Bunsen sampe berwarna merah lalu diamkan
sebentar
6. Meneteskan sedikit Nacl di atas permukaan objek glass menggunakan
ose
7. Mengambil sedikit koloni dengan menggunakan ose lalu diratakan di
atas objek glass dan dikeringkan
8. Difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di
atas bunsen 2-3 kali dengan cepat
9. Lakukan tahap pewarnaan
- Langkah pertama menuangkan pewarna cristal violet, biarkan
selama 1 menit setelah itu sisa cristal violet, mencuci preparat
dengan air mengalir
- Langkah kedua menuangkan pewarna iodium, biarkan selama 2
menit setelah itu sisa iodium dibuang dan mencuci preparat dengan
air mengalir
 - Tahap ketiga dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara
meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang dibilas dengan air
mengalir
- Tahap keempat dituangkan pewarna safranin sebagai pewarna
penutup/ pembanding biarkan selama 30 detik lalu membuang
kelebihan safranin dan mencuci preparat dengan air mengalir
10. Mengeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap
lalu menambahkan minyak imersi pada preparat dan amati preparat
dibawah mikroskop dengan perbesaran lemah (10 x) kemudian
perbesaran kuat (100)
11. Setelah selesai melakukan pengamatan membersihakan lensa objektif
dengan alcohol dan mematikan mikroskop.

VIII. Hasil dan Pembahasan

1. Hasil Pengamatan
Pada praktikum mengenai cara pewarnaan gram dan pengamatan
preparat penggunaan mikroskop didapatkan hasil sebagai berikut
Gambar Hasil Pengamatan Keterangan

Tahap pewarnaan

Gambar 1
 Tahap pembersihan dari
pewarnaan dengan air mengalir

Gambar.2

Tahap pada saat mencari

lapang pandang dengan
pembesaran 10x lensa objektif
dan perbesaran 10x diafragma

Gambar. 3
Tahap pada saat mencari hasil
yang jelas dengan pembesaran
100x lensa objektif dan
perbesaran 100x diafragma
dari hasil pewarnaan didapat
bakteri gram positif dan
berbentuk cocus.

Gambar. 4

2. Pembahasan
Gambar 1 dan gambar 2 merupakan tahap dari pewarnaan gram.
Gambar 3 adalah hasil dari pada saat mencari lapang pandang. gambar
4 hasil dari tahapan pewarnaan gram yang di lihat di bawah mikroskop.
 Mendapatkan hasil Bakteri berbentuk coccus dan berwarna ungu
menunjukan bahwa bakteri tersebut termasuk pada golongan bakteri
gram (+) ini dapat ditemukan dengan menggunakan perbesaran 10x
lensa objektif dan perbesaran 10x diafragma terlebih dahulu untuk
mendapatkan lapang pandangnya. Kemudian, setelah menemukan
lapang pandang, berikan setetes minyak emersi untuk memperjelas
objek/ Setelah itu, mengubah perbesaran menjadi 100x lensa objektif
dan perbesaran 100x diafragma serta memutar micrometer untuk
memperjelas penampang dari bakteri berbentuk coccus dan
didapatkanlah hasil seperti gambar di atas.

IX. Kesimpulan
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah
pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui
morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Proses pewarnaan gram ini
memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan
pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Setelah
melakukan pewarnaan gram didapatkan hasil bakteri yang berbentuk cocus
berwarna ungu yang menunjukan gram (+) positif.

X. Daftar Pustaka
Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual,
Addison-Wesley Publishing Company : New York.
Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect.
Bandung.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada
: Jakarta.
Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education :
inc. UnitedState of America.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill
 Book Company: New York.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

Denpasar, 6 Mei 2017

Dosen Pembimbing/CI

Burhannudin, S.Si., M.Biomed

NIP. 198602282009121003